海洋酸化对Littorina littorea（腹足纲，软体动物）齿舌材料性质的影响

《Marine Environmental Research》：Effects of ocean acidification on radular tooth material properties in Littorina littorea (Gastropoda, Mollusca)

　　文克·克林斯（Wencke Krings）|亨里克·K·C·施赖伯（Henrik.K.C. Schreiber）|斯坦尼斯拉夫·N·戈尔布（Stanislav N. Gorb）
莱比锡大学牙科、牙内科学和牙周病学系，Liebigstra?e 12，04103 莱比锡，德国

**摘要**
已知海洋酸化会影响海洋生物中的钙化结构，但其对非钙化但功能至关重要的摄食工具的影响仍知之甚少。齿舌是软体动物的一个独特特征，其机械性能对摄食和生存至关重要。本研究探讨了海水pH值降低对潮间带腹足类动物Littorina littorea齿舌的影响。实验中将这些动物分别置于酸化条件（pH 7.5）和接近当前环境条件（pH 8.1）下饲养七周，并与野外采集的对照组进行比较。通过扫描电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、能量色散X射线光谱（EDX）和纳米压痕实验对齿舌进行了分析。

结果显示，尽管总体形态基本保持不变，但在酸化条件下，齿舌牙齿的工作区域磨损明显增加。磨损主要集中在中央和侧部牙齿的尖端，且牙齿表面呈现圆形轮廓，表明发生了渐进性的磨损。酸化环境导致牙齿外层涂层发生变化，硅含量减少，硬度和刚性显著下降，而牙齿内部结构受影响较小。共聚焦显微镜观察发现特定于处理的自动荧光模式，表明有机基质发生了pH依赖性的改变。实验室饲养的个体与野外采集的个体之间的差异进一步表明，摄食条件会影响齿舌的物理特性。

**1. 引言**
人类工业活动导致大气中二氧化碳（CO2）浓度持续升高，从而增强了海洋对CO2的吸收，进而促使海水pH值逐渐下降[1][2][3]。随着CO2浓度增加，更多CO2溶解于海水中，根据勒夏特列原理（Le Chatelier’s principle），碳酸（H2CO3）、碳酸氢根离子（HCO3-）和氢离子（H+）的生成增加，导致海水pH值降低，碳酸根离子（CO32-）的可用性减少[4]。溶解的CO2与水反应生成碳酸，进一步加剧了海洋酸化并减少了碳酸根离子的供应。据预测，到21世纪末，北海的海水pH值可能下降0.5个单位[5]。在高排放情景下，北海/西北欧大陆架的pH值可能降至约7.6，尤其是在底部水域，同时还会存在显著的季节性和空间变异性[6]。然而，酸化过程在空间上具有异质性，尤其是在沿海地区[7]。在近岸环境中，淡水输入、富营养化、初级生产及呼吸作用等因素也会影响pH值[8][9][10]。因此，瓦登海（Wadden Sea）的潮间带生物既面临长期酸化趋势，也受到短期波动的影响。

关于海洋酸化对软体动物的生物学影响，主要关注的是它们的钙化壳。多项研究表明，pH值降低会损害壳的形成，降低壳的强度，并增加溶解速率[11][12][13][14][15][16]。另有研究指出，酸化可能改变生物矿化过程和能量分配，并可能引发表型可塑性、适应或响应[17]。相比之下，非钙化但功能关键的结构（如软体动物的齿舌）受到的关注较少。

齿舌是软体动物的一个独特结构，用于刮取食物和摄取营养。尽管它在摄食和生存中起着核心作用且暴露在环境中，但海洋酸化对其牙齿的潜在影响仍不甚清楚。现有研究较少，且主要集中在形态损伤方面：一项研究报道了齿舌损伤[18]，另一项研究未发现形态差异[19]，因此牙齿材料组成和机械性能的变化尚未得到明确。

齿舌在摄食过程中的性能不仅取决于牙齿形态，还取决于组成材料的机械性质和内部结构[20][21][22][23][24]。齿舌的机械性能得益于矿化作用、离子介导的交联以及有机基质的调控鞣制[21][22][25][26][27][28][29]。在多板纲（Polyplacophora）和巴特尔加斯特罗普达纲（Patellogastropoda）的齿舌中，主要牙齿含有大量钙、铁和硅基矿物（如针铁矿、二氧化硅、氧化铁、磷灰石），使其成为已知最硬和最坚韧的生物材料之一[27][28][30]。相比之下，大多数腹足类动物的齿舌中Fe、Si、Ca、P、Mg和F的含量较低[31][32][33]。这类齿舌通常具有薄的外层涂层（见补充图1），富含Si或Ca，这些成分比内部牙齿结构更硬更韧[34][35]，有助于减少摄食过程中的磨损[36][37][38][39][40][41]。除了矿物相外，某些元素（如Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Si）在几丁质材料中可作为离子交联剂，即使在低浓度下也能增强硬度和韧性[29][42]。此外，有机基质的鞣制程度和蛋白质组成也会显著影响机械性能。共聚焦激光扫描显微镜是揭示这些材料状态的强大工具，因为不同的自动荧光信号与齿舌的硬化程度、元素掺入量和机械性能相关[21][22][32][34][35][38][39][41]。在钙或硅含量较低的齿舌中（如Littorina littorea），硬度和韧性的变化主要由交联或鞣制过程驱动，而不仅仅是矿物含量[32][33]。

**2. 材料与方法**
2.1. 样本来源
2023年8月，在汉堡大学（位于北威斯特伐利亚州，北海沿岸）的年度动物学考察活动中，从Hallig Langene?附近的潮间带采集了45只成年Littorina littorea个体。这些蜗牛附着在木制防波堤上，部分表面长满了藤壶。对照组中的10只蜗牛在采集当天用沸水杀死后保存在70%乙醇中，其余个体则被饲养在水族箱中。样本被分为两组：基础处理组（pH 8.1，14只）和酸处理组（pH 7.5，21只）。

2.2. 饲养条件
所有动物被饲养在两个塑料水族箱中，每个水族箱配备两个曝气泵（Air 275 R plus，Sera GmbH，德国海因斯堡），以确保充足的氧气供应。一个水族箱的pH值为7.5，另一个为8.1。两个水族箱均置于室温下的封闭环境中，实验期间水温保持在20–22°C。实验持续时间为七周。

海水通过将自来水与商用水质调节剂（Gan，Dupla，Gelsdorf，德国）混合来中和潜在污染物，再加入商用海盐混合物（Classic Meersalz，Tropic Marin，Hünenberg，瑞士）以模拟自然海水的盐度和矿物质组成。每隔两天使用电导率仪（pH-100 ATC，Voltcraft，Conrad Electronic SE，Hirschau，德国）检测pH值，并通过Aqua Medic pH控制器（Aqua Medic Anlagenbau GmbH，Bissendorf，德国）调节pH值（通过添加纯CO2气体）。每四天更换一次水。

2.3. 实验结果
酸处理组（pH 7.5）中有21只个体，最终只有10只存活至实验结束，死亡率为11%。基础处理组（pH 8.1）的14只个体中有10只存活，死亡率为4%。

2.4. 分析方法
实验后，所有个体被固定在70%乙醇中并仔细解剖。齿舌被取出后用70%乙醇在超声浴中清洗。为进行形态分析，每组选取六个完整的齿舌样本用于SEM观察（见补充图2）。齿舌使用双面碳胶带固定在SEM样品台上，干燥后喷涂5纳米厚的铂层。SEM成像使用Zeiss LEO 1525扫描电子显微镜（One Zeiss Drive，Thornwood，美国）进行，加速电压为5 keV。

2.5. 能量色散X射线光谱和纳米压痕
为确定齿舌内部成分，对每组两个齿舌样本进行了EDX分析（见补充图2）。样本制备遵循既定协议[30][40][47]。齿舌用双面碳胶带固定在玻璃片上，并用金属环包裹，然后填充环氧树脂（Reckli Epoxy WST，RECKLI GmbH，Herne，德国）以完全包裹样本。在室温下聚合三天后，去除玻璃片和胶带。样品用逐渐细化的砂纸打磨直至可见牙齿截面，再用0.3微米氧化铝悬浮液在抛光机上抛光（Minitech 233/333，PRESI GmbH，Hagen，德国），以获得均匀光滑的表面。此步骤有助于减少表面粗糙度并避免EDX测量中的电子散射等分析误差。

抛光后，样品在超声浴中清洗5分钟，固定在SEM样品台上并喷涂5纳米厚的铂层。元素分析使用配备Octane硅漂移检测器的Zeiss LEO 1525扫描电子显微镜（TEAM? microanalysis system，EDAX Inc., New Jersey，美国）进行。所有测量使用相同的分析参数（加速电压20 kV，恒定工作距离和光圈）。分析前先用铜校准检测器。此外，还测量了藻类糊料的元素组成。测量设置与对牙齿进行测试时相同。在小的、定义明确的区域进行了点分析（不进行元素映射）。检测到的元素包括Al、C、Ca、Cl、Cu、F、Fe、K、Mg、Mn、N、Na、O、P、Pt、S、Si和Zn。形成有机基质的元素（C、N、O）、来自溅射涂层的铂以及可能来自抛光残留物的铝和氧被排除在进一步讨论之外。为了评估嵌入或抛光过程中可能造成的污染，在纯环氧树脂上进行了10次对照测量；未检测到硅或其他相关元素，这证实了这些元素在牙齿样本中的存在来源于齿舌。由于探测器无法可靠地区分磷（P）和铂（Pt）的峰值，因此将这些元素共同评估为PPt。为了估计铂的贡献，在纯环氧树脂上进行了20次测量，得到的平均铂含量为0.11 ± 0.02原子百分比。总共分析了147个牙齿内部结构的点数据。EDX分析之后，使用相同的嵌入样本进行了牙齿内部结构的纳米压痕测量。

2.6 统计分析
统计分析使用JMP Pro版本14（SAS Institute Inc.，美国卡里）进行。计算了所有变量的平均值和标准差。对机械性能进行了组间比较，并选择性地对某些元素进行了比较。统计评估主要集中在Ca、Si、Fe和F上，因为这些元素与L. littorea齿舌牙齿的机械性能有最强的关联。仅在微量存在或在处理组间变化较小的元素被排除在组间比较之外，以减少多重比较的数量并降低I型错误率的风险。相关系数也是使用JMP计算的。

2.5 共聚焦激光扫描显微镜
为了记录齿舌牙齿材料的自发荧光，按照[46]中描述的协议，对每组额外的两个齿舌进行了共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察。齿舌被安装在玻璃载玻片上，周围有多个加固环，嵌入到纯度≥99.5%的无水甘油（Carl Roth GmbH & Co. KG，德国卡尔斯鲁厄）中，并覆盖上盖玻片。使用配备Berkovich金刚石尖端和动态接触模块（DCM）的Zeiss LSM 700共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国耶拿）进行成像。使用玻璃进行尖端校准，获得了压痕深度范围内的稳定载荷-位移曲线。有效杨氏模量（E）使用Oliver-Pharr方法[48]计算。E和硬度（H）都是通过连续刚度测量（CSM）模式从载荷-位移曲线中得出的。应用了0.3的泊松比和0.1 nm s-1的最大允许漂移率。所有测量都在受控实验室条件下进行（22–24°C；28–30%相对湿度），并且每次压痕都进行了手动监控。在100至200纳米的穿透深度处提取了E和H的值。总共分析了147个位置。

2.6.1 外部牙齿涂层的机械性能表征
为了表征外部牙齿涂层的机械性能，对孤立的牙齿尖端进行了纳米压痕测试（工作流程见补充图2）。在立体显微镜下使用细镊子小心地将单个尖端从齿舌上分离出来，以暴露适合压痕的平坦涂层表面。从每组六个齿舌的工作区中分离出的尖端，未用于任何先前的实验中，使用双面碳胶带粘贴在玻璃载玻片上，确保涂层表面朝上并且尽可能平行于压头轴线。测试前将样品风干。特别注意确保尖端基底与胶带之间有足够的接触面积，以防止压痕过程中样品移动。在50至100纳米的穿透深度处提取机械性能数据，以最小化来自底层有机基质的影响。总共测试了248个区域。

2.6.2 自发荧光记录
在纳米压痕之后，使用双面碳胶带将带有分离出的牙齿尖端的玻璃载玻片转移到SEM样品支架上（工作流程见补充图2）。样品首先用5纳米厚的铂层进行溅射涂层，然后使用EDX进行分析。接着在压痕区域旁边进行EDX分析，以确定牙齿涂层的元素组成。这种顺序工作流程允许直接关联纳米压痕得到的机械性能与同一涂层区域内的局部元素组成。

3. 结果
3.1 形态和牙齿磨损
图1和图2记录了Littorina littorea在不同发育阶段的齿舌形态，并突出了工作区中的牙齿磨损情况，该区域包含功能活跃的牙齿，包括对照组、基础处理组和酸性处理组。在工作区和后成熟区，三组之间没有明显的形态差异。然而，在新牙齿形成的构建区，酸性处理组的牙齿排列更密集，牙齿数量也更多（图2H），比对照组（图1D）和基础组（图2G）更多。

3.2 元素组成
3.2.1 内部牙齿结构
所有牙齿类型的内部牙齿结构的元素组成大致相似，差异主要反映了处理效果而非牙齿类型（详见补充表1-3中的平均值和标准差；补充图3和4中的箱线图）。C和O占主导地位（此处不再详细讨论），而F始终是最丰富的次要元素（约0.85–1.01原子百分比）。Ca和Mg的含量较低（通常<0.5原子百分比），其次是Na、S和P以及PPt。所有其他元素，包括Si、Mn、Fe、Zn、Cu、Cl和K，仅以微量存在（通常≤0.05原子百分比）。酸性处理导致所有牙齿类型的Ca和Mg含量略有增加，而Na含量减少，F的含量保持较高且基本不变。相比之下，基础处理组的Ca和Mg含量与对照组相当，但Si和Mn的含量略有升高。不同牙齿类型之间的差异较小，其中中央牙齿的Ca和Mg含量略高于侧缘和边缘牙齿，而边缘牙齿II的浓度最低。总体而言，处理相关的变化较为微妙，没有根本改变内部牙齿结构的元素特征。

3.2.2 外部牙齿涂层
与内部结构相比，外部牙齿涂层的元素含量较高，处理效果明显（见图3中的Ca和Si含量；补充表1-3中的平均值和标准差；补充图3和4中的箱线图）。在所有牙齿类型中，Ca和Si占涂层组成的主导地位，其含量远高于内部结构。

3.3 机械性能
使用Nanoindenter SA2（MTS Nano Instruments，美国橡树岭）进行了机械性能测量，该仪器配备了Berkovich金刚石尖端和动态接触模块（DCM）。使用玻璃进行尖端校准，获得了压痕深度范围内的稳定载荷-位移曲线。有效杨氏模量（E）使用Oliver-Pharr方法[48]计算。E和硬度（H）都是通过连续刚度测量（CSM）模式从载荷-位移曲线中得出的。应用了0.3的泊松比和0.1 nm s-1的最大允许漂移率。所有测量都在受控实验室条件下进行（22–24°C；28–30%相对湿度），并且每次压痕都进行了手动监控。在100至200纳米的穿透深度处提取了E和H的值。总共分析了147个位置。

3.4 结果讨论
3.4.1 形态和牙齿磨损
图1和图2展示了Littorina littorea在不同发育阶段的齿舌形态，并突出了工作区中的牙齿磨损情况，该区域包含功能活跃的牙齿，包括对照组、基础处理组和酸性处理组。在工作区和后成熟区，三组之间没有明显的形态差异。然而，在新牙齿形成的构建区，酸性处理组的牙齿排列更密集，牙齿数量也更多（图2H），比对照组（图1D）和基础组（图2G）更多。

3.4.2 元素组成
3.4.2.1 内部牙齿结构
所有牙齿类型的内部牙齿结构的元素组成大致相似，差异主要反映了处理效果而非牙齿类型（详见补充表1-3中的平均值和标准差；补充图3和4中的箱线图）。C和O占主导地位（此处不再详细讨论），而F始终是最丰富的次要元素（约0.85–1.01原子百分比）。Ca和Mg的含量较低（通常<0.5原子百分比），其次是Na、S和P以及PPt。所有其他元素，包括Si、Mn、Fe、Zn、Cu、Cl和K，仅以微量存在（通常≤0.05原子百分比）。酸性处理导致所有牙齿类型的Ca和Mg含量略有增加，而Na含量减少，F的含量保持较高且基本不变。相比之下，基础处理组的Ca和Mg含量与对照组相当，但Si和Mn的含量略有升高。不同牙齿类型之间的差异较小，其中中央牙齿的Ca和Mg含量略高于侧缘和边缘牙齿，而边缘牙齿II的浓度最低。总体而言，处理相关的变化较为微妙，没有根本改变内部牙齿结构的元素特征。

3.4.2.2 外部牙齿涂层
与内部结构相比，外部牙齿涂层的元素含量较高，处理效果明显（见图3中的Ca和Si含量；补充表1-3中的平均值和标准差；补充图3和4中的箱线图）。在所有牙齿类型中，Ca和Si占涂层组成的主导地位，其含量远高于内部结构。

3.4.3 内部牙齿结构和外部牙齿涂层的比较
内部牙齿结构和外部牙齿涂层的元素组成存在根本差异（见图3中的Ca和Si含量；补充表1-3中的平均值和标准差；补充图3和4中的箱线图）。内部结构的元素浓度均匀较低且变化有限，而涂层则富含Ca和Si，同时F和其他次要元素的含量也较高。处理效果在内部结构中较为微妙，但在涂层中非常明显，这突显了这两种结构成分之间的明显功能和组成差异。

3.4.4 机械性能
在对照组、酸性处理组和基础处理条件下，测量了中央牙齿、侧缘牙齿I和边缘牙齿II的内部牙齿结构和外部牙齿涂层的杨氏模量（E）和硬度（H）（见图4中的箱线图；补充表4中的平均值和标准差）。在所有牙齿类型和处理条件下，外部牙齿涂层的刚度和硬度值始终约为内部结构的三倍。酸性处理导致两层的E和H显著降低，而基础处理组的机械性能更接近对照组，尤其是在涂层中。涂层数据来自每种处理的六个样本，而内部结构数据来自每种处理的两个样本。在中央牙齿中，对照组显示出较高的涂层硬度和强度（E = 33.90 ± 4.66 GPa；H = 1.88 ± 0.22 GPa），而内部结构则明显更软（E = 12.84 ± 0.76 GPa；H = 0.68 ± 0.06 GPa）。酸性处理降低了涂层（E = 18.00 ± 2.11 GPa；H = 0.88 ± 0.11 GPa）和内部结构的值（E = 8.84 ± 1.25 GPa；H = 0.43 ± 0.06 GPa）。在碱性处理组中，涂层性能保持相对较高（E = 29.98 ± 3.98 GPa；H = 1.49 ± 0.15 GPa），而内部结构显示出中等值（E = 11.37 ± 0.60 GPa；H = 0.52 ± 0.03 GPa）。侧牙在对照组中显示出最高的涂层硬度（E = 35.25 ± 4.12 GPa；H = 1.70 ± 0.19 GPa），相比之下内部结构要软得多（E = 10.22 ± 0.71 GPa；H = 0.49 ± 0.04 GPa）。酸性处理导致两层都显著降低（涂层：E = 21.60 ± 3.11 GPa；H = 1.05 ± 0.15 GPa；内部：E = 8.81 ± 0.65 GPa；H = 0.43 ± 0.03 GPa）。在碱性条件下，涂层值与对照组相当（E = 33.59 ± 4.28 GPa；H = 1.62 ± 0.21 GPa），而内部结构略低（E = 9.67 ± 0.44 GPa；H = 0.46 ± 0.02 GPa）。在边缘牙I中，对照组涂层的E值为30.57 ± 4.07 GPa，H值为1.52 ± 0.19 GPa，而内部结构的值则低得多（E = 9.17 ± 0.52 GPa；H = 0.45 ± 0.03 GPa）。酸性处理降低了涂层（E = 19.16 ± 3.21 GPa；H = 1.04 ± 0.16 GPa）和内部结构的性能（E = 7.38 ± 0.44 GPa；H = 0.39 ± 0.02 GPa）。相比之下，碱性处理保持了较高的涂层值（E = 31.42 ± 3.85 GPa；H = 1.62 ± 0.20 GPa），而内部结构保持柔韧性（E = 7.93 ± 0.39 GPa；H = 0.41 ± 0.02 GPa）。边缘牙II也显示出类似的模式。在对照组中，涂层硬度和强度分别为E = 30.83 ± 4.26 GPa和H = 1.53 ± 0.21 GPa，而内部结构分别为E = 8.99 ± 1.16 GPa和H = 0.45 ± 0.05 GPa。酸性处理降低了涂层（E = 18.44 ± 2.72 GPa；H = 1.01 ± 0.14 GPa）和内部结构的值（E = 7.03 ± 1.12 GPa；H = 0.39 ± 0.05 GPa）。在碱性条件下，涂层性能保持较高（E = 29.01 ± 3.52 GPa；H = 1.51 ± 0.17 GPa），而内部结构为E = 7.96 ± 0.83 GPa和H = 0.41 ± 0.04 GPa。

对元素组成和机械性能进行了成对比较（对照组-酸性处理组、对照组-碱性处理组、酸性处理组-碱性处理组；p < 0.05），分别针对每种牙齿类型（中央牙、侧牙、边缘牙I、边缘牙II）以及内部牙齿结构和外部涂层中的Ca、F、Fe、Si、E和H（相关成对比较和均匀组的p值见补充表5-51）。在所有牙齿类型中，处理效果在外部牙齿涂层中最为明显。所有牙齿类型中，涂层中的Ca浓度在不同处理之间存在显著差异。酸性处理组在侧牙和两个边缘牙中与对照组不同，但在中央牙中没有差异；而碱性处理组在所有牙齿类型中与酸性处理组和对照组都有显著差异（p < 0.0001）。涂层中的Si在所有牙齿类型中表现出高度一致的模式：酸性处理组与对照组和碱性处理组在所有比较中都有显著差异（所有p < 0.0001），而对照组和碱性处理组之间没有差异。相比之下，Fe在任何牙齿类型或层中都没有显示出显著的处理相关差异。F仅在边缘牙II的内部结构中显示出单一的显著差异（酸性处理组与对照组）。机械性能受到处理的强烈影响，尤其是在涂层中。对于几乎所有牙齿类型，E和H在酸性处理组和对照组之间以及在酸性处理组和碱性处理组之间都有显著差异，大多数情况下p < 0.0001。碱性处理组和对照组之间的差异不太一致，主要局限于中央牙。在个别牙齿类型中，内部牙齿结构中的处理效果有限且具有元素特异性。Ca在中央牙和两个边缘牙中显示出显著的酸性-对照组差异，但在侧牙中没有差异；而Si和Fe在任何牙齿类型中都没有显著差异。F仅在边缘牙II的内部结构中有所不同。相比之下，外部涂层在所有牙齿类型中一致显示出Ca和Si的显著处理相关差异，而F和Fe在涂层层面没有显著差异。

对元素组成和机械性能进行了相关性分析（对照组、酸性处理组和碱性处理组），以评估元素组成与机械性能E和H之间的关系（相关系数见补充表52-54，E与Ca以及E与Si之间的关系见补充图5-10）。在所有三个处理组中，E和H都呈非常强的正相关（对照组：r = 0.97；酸性处理组：r = 0.99；碱性处理组：r = 0.98）。在每个组中，这两种机械性能都与Ca和Si浓度呈强到非常强的正相关，表明较高的Ca和Si含量始终与增加的硬度和强度相关。所有组中都观察到与Fe的中等正相关，而F仅显示出弱到中等的正相关。相反，E和H在所有处理中都与C、S、Cu和Mg呈强负相关，表明这些元素的比例较高与机械性能降低相关。Cl、K、Na和Mn在所有组中与机械性能只有弱或可忽略的相关性。总体而言，处理之间的相关模式非常一致，Ca和Si是最强烈关联于增加硬度和强度的元素，而富含C、S、Cu和Mg的组成与机械性能较软的牙齿材料相关。

在对照组中，自荧光是异质的（图5A）。中央牙齿的尖端显示出灰绿色信号，而侧牙和边缘牙的尖端显示出更亮的绿色自荧光。边缘牙的基部显示出绿色自荧光。其余牙齿区域发出微弱的紫色到绿色再到蓝色的自荧光。在酸性处理组（图5B）中，绿色自荧光几乎不存在，仅限于一些边缘牙的尖端的小区域。在碱性处理组（图5C）中，所有牙齿类型主要显示出深绿色自荧光，牙齿边缘有明亮的绿色亮点。

下载：下载高分辨率图像（2MB）
下载：下载全尺寸图像
图5. Littorina littorea工作区的CLSM图像。箭头标出了绿色自荧光区域。A. 对照组。B. 酸性处理组。C. 碱性处理组。所有图像均使用相同的设置获取。缩写：Ct，中央牙；Lt，侧牙；Mt I，边缘牙1；Mt II，边缘牙2。

4.1. 腹足类齿舌对海洋酸化的响应
关于海洋酸化对齿舌牙齿的影响，研究较少。只有两项研究在pH值降低的情况下检查了齿舌牙齿，这两项研究都仅关注形态变化[18]、[19]，而没有探讨材料组成或机械性能的变化，而这些变化在这里是首次被研究的。在这两项研究中，重点都是高度矿化的齿舌牙齿，其中一项研究没有报告形态变化[19]，另一项研究报告了齿舌损伤[18]。相比之下，大多数关于海洋酸化对腹足类的实验研究都集中在壳的形成和完整性上，一致报告了钙化速率降低、壳变薄、溶解增加以及在pH值降低条件下的机械强度下降[例如，11,12,13,14,15]。这些效应通常归因于碳酸盐饱和度的降低以及在酸化条件下维持碳酸钙沉淀所需能量的增加[17]、[49]。与壳不同，Littorina littorea的齿舌牙齿是薄的功能性分级复合材料，由有机基质和局部元素富集强化组成。因此，齿舌牙齿的失效主要是由于涂层组成的pH依赖性改变、有机-元素相互作用和机械性能的变化，而不是由于大量矿物的溶解。虽然以壳为中心的研究通常强调直接的化学溶解，但这里观察到的磨损增加和硬度降低反映了微观机械层面的材料减弱，即使在不断更新的结构中也是如此。这种对比表明，海洋酸化不仅通过损害保护性壳来影响腹足类的性能，还通过破坏它们获取能量的工具来影响个体的适应性，从而可能放大基于壳的评估所推断的亚致死影响。

4.2. pH值降低对齿舌牙齿磨损和功能完整性的影响
本研究证明，海水pH值的降低对L. littorea的齿舌有显著影响，尽管总体形态和齿舌组织基本保持不变，但酸化条件导致牙齿磨损显著增加。磨损集中在工作区，该区域包含在进食过程中直接暴露的完全成熟的牙齿[33]、[50]、[51]、[52]，主要影响中央牙和侧牙的尖端。这种模式与这些牙齿类型在刮擦基底和传递力量过程中的功能作用一致[24]。SEM图像中观察到的磨损尖端的圆形形态是渐进性磨损的特征，而不是灾难性失效，这与之前描述的在持续机械负荷下腹足类齿舌的情况相反[53]。在其他腹足类中，即使在整体进食行为没有明显影响的情况下，也报告了在pH值降低或高碳酸盐条件下类似的齿舌损伤[18]，这表明齿舌牙齿可能对海水化学成分的变化特别敏感。由于我们实验中的水族箱条件、食物类型和实验持续时间在处理组之间是相同的，因此酸性处理组中观察到的磨损增加主要可以归因于pH值相关性的牙齿材料性质变化，而不是行为差异。此外，由于动物没有接触硬质或磨蚀性基底，外部物体的相互作用无法解释观察到的磨损模式，进一步支持了在酸性条件下齿舌牙齿基于材料的弱化。

4.3. 齿舌牙齿的形成与形成后的改变
一个重要问题是，观察到的pH效应反映了齿舌牙齿的形成改变还是已经形成的牙齿的后期修改。现有证据表明，腹足类的齿舌完全更新可能需要几周到几个月的时间[50]、[54]、[55]、[56]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]，齿舌更新的速率取决于许多因素，如温度（温度较高时产生的齿舌行数更多）或动物的年龄（较老的动物产生的齿舌行数较少）[56]、[58]、[60]、活跃进食的时间[56]或特定食物[57]（更活跃的进食和连续数月食用硬食物会增加生产速率）。鉴于实验持续时间相对较短（七周），因此不太可能在整个实验期间新形成了整个齿舌。因此，在实验结束时工作区存在的许多牙齿很可能是在暴露之前产生的，并在使用过程中随后受到酸性或碱性海水的影响。因此，在酸性条件下观察到的明显处理效应以及磨损增加表明，pH值降低可以削弱或化学改变已经形成的齿舌牙齿，这与早期关于在短期高碳酸盐条件下齿舌损伤的报告一致[18]。同时，在构建区和成熟区观察到的细微形态差异表明，pH值也可能影响牙齿的形成过程。关于构建区的元素组成的数据尚未获得。然而，这些发现表明可能存在一种双重机制：海洋酸化不仅影响功能性齿舌齿的稳定性（暴露的外层涂层是环境敏感性的主要部位），还影响新形成齿舌齿的属性。4.4. pH值依赖的钙可用性与钙吸收的生物控制乍一看，基础处理组中观察到的外层齿舌齿钙含量减少似乎有些反常，因为较高的海水pH值通常与较高的碳酸盐可用性和更有利于钙吸收的条件相关[49]，[62]。然而，像L. littorea这样的腹足类动物的齿舌齿形成并不受与周围海水被动地球化学平衡的支配，而是反映了在齿舌齿形成和成熟过程中的严格生物控制[26]，[50]。因此，钙的结合和固定预计取决于与有机几丁质-蛋白质基质的pH敏感相互作用，包括参与成核和交联的功能基团的离子化状态[29]，[63]，[64]。因此，即使环境中的钙可用性较高，升高的pH值也可能以某种方式改变钙-基质相互作用，从而降低有效的钙吸收。重要的是，基础处理组保持了与对照组相当的高硅浓度和机械性能，这表明钙部分被硅替代，而不是整体失去了强化作用，这与之前的研究结果一致，即硅的富集与齿舌齿涂层的增硬和增强有关[34]，[35]，[36]。这些发现表明，涂层化学成分的变化反映了生物介导的物质重组，而不仅仅是简单的矿物质限制。这引发了这样一个问题：观察到的成分变化是齿舌齿材料形成的适应性生理调整，还是由于牙齿发育过程中生化条件的改变而产生的非适应性后果。L. littorea栖息在潮间带环境中，该环境的特点是潮汐和日间pH值波动明显，特别是在瓦登海，那里的生物活动和流体动力学会产生显著的短期变化。这种反复暴露于变化的碳酸盐化学环境中可能选择了齿舌齿形成途径中的某种可塑性或缓冲能力。在这种情况下，在碱性条件下保持的硅富集和大部分保留的机械性能表明，当钙吸收发生变化时，元素组成可能会被重新组织，而不仅仅是简单地减少。因此，钙部分被硅替代可能代表了一种生物介导的补偿性调整。相反，在持续酸性条件下观察到的硅减少和机械性能减弱表明这种灵活性存在限制。这些变化是反映了生物矿化途径的受限、生理适应时间不足，还是纯粹的生化干扰对基质-交联剂相互作用的影响，目前尚不清楚，但应在未来进行研究。4.5. 硅在维持机械性能中的作用硅被确定为与齿舌齿涂层的机械稳定性相关的关键元素。在所有处理组中，硬度和硬度与硅含量呈强正相关，即使钙含量降低，富含硅的涂层也保持了高机械性能，这与之前的研究结果一致，即硅是齿舌齿中重要的强化成分[21]，[22]，[32]，[34]，[35]，[36]，[41]。相比之下，酸性条件与硅的显著损失以及硬度和硬度的显著降低相关。这表明硅在齿舌齿涂层中起着重要的稳定作用，可能是通过强化有机基质或增强耐磨性来实现的，正如其他软体动物齿舌齿的研究所提出的[21]，[22]，[32]，[34]，[35]，[36]，[41]。矿物形式的硅通常不会在这种pH值（7.5）下溶解，这可能表明它在Littorina中以离子和交联剂的形式存在。这种物种中硅的具体吸收机制尚不清楚。4.6. 自荧光模式作为钙和硅相关齿舌齿成分的指示剂在具有复合角质结构的节肢动物和其他无脊椎动物中，基于[46]协议的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）自荧光已被广泛用作材料成分和功能分化的定性指标。不同的荧光发射通常与几丁质-蛋白质复合体的特定结构成分相关。特别是，蓝到紫色的自荧光通常与富含蛋白质的区域相关，而绿色荧光则常与交联的几丁质基质相关，因此是机械强度更高的材料[例如，46,47,65]。尽管自荧光不能提供直接的化学鉴定，但它提供了一种强大的、非破坏性的方法来检测与处理相关的复合体组织变化，当结合元素分析和机械分析进行解释时尤其如此。在我们的研究中，CLSM揭示了与处理相关的齿舌齿自荧光模式的显著差异，这些差异紧密反映了齿舌齿涂层的元素组成。先前的研究表明，几丁质结构中的蓝光自荧光与富含钙的成分相关，而绿色自荧光则与富含硅的区域相关[21]，[22]，[34]，[35]，[38]，[39]，[41]，[66]。在本研究中，酸处理组的特征是主要的蓝-紫色信号和几乎完全缺乏绿色自荧光，这与EDX检测到的硅含量减少以及涂层中钙的相对优势一致。相比之下，基础处理组在所有类型的齿舌齿中都表现出强烈的绿色自荧光，这与高硅浓度和保留的机械性能相符。这些发现表明，pH值依赖的自荧光变化主要反映了复合齿舌齿材料中元素相关成分的变化，而不仅仅是有机鞣制的普遍变化。由于富含硅的区域与硬度和硬度的增加密切相关，因此在酸性条件下绿色自荧光的丧失提供了涂层组成改变与机械阻力降低之间的机制联系。因此，CLSM模式支持这样的解释：海洋酸化通过破坏齿舌齿涂层中基于钙和硅的强化平衡来损害齿舌齿的性能，而不是单独影响元素吸收或有机基质化学。4.7. 对齿舌齿更新和能量成本的影响在酸性条件下，增加的齿舌齿磨损和降低的机械性能可能会对齿舌齿的更新动态产生影响。尽管齿舌齿不断更新，功能性齿舌齿会逐渐被替换[50]，[53]，但加速的磨损可能需要更快地替换功能性齿舌齿，从而增加齿舌齿生产的能量投入。在维持的个体中观察到的齿舌齿密度和大小的细微差异进一步表明，pH值可能会影响齿舌齿的发育和生成速率。从更长的时间尺度来看，增加对齿舌齿维护的能量分配可能会减少用于生长、繁殖或抗压力的资源，特别是在能量需求高的潮间带环境中，这与更广泛的证据一致，即海洋酸化会对软体动物造成代谢和能量上的权衡[11]，[17]，[67]。4.8. 亚致死压力和行为反应酸处理组观察到的高死亡率，加上对长时间浸泡的行为回避，表明pH值的降低对L. littorea造成了显著的生理压力，这与之前关于酸化引起的潮间带腹足类动物应激反应的报告一致[11]，[67]。重要的是，即使是在长时间暴露后存活下来的个体也表现出齿舌齿的明显材料退化，这表明观察到的效应不仅限于严重受损的个体，而是持续存在于存活动物中的亚致死影响，这在海洋酸化情景下是常见的[17]。由于齿舌齿变弱导致的进食效率下降可能会进一步加剧能量压力，从而在食物摄入减少和维持功能性进食结构的能力下降之间形成反馈循环。4.9. 实验室条件下饮食的影响对照组在采样前在自然条件下进食，其齿舌齿涂层中的钙含量最高，机械性能也最平衡。相比之下，无论pH值如何处理，实验室条件下维持的个体都表现出明显的差异。由于两个实验组都仅喂食藻类糊剂并且缺乏自然生物膜，这些差异很可能反映了饮食效应，而不仅仅是pH值条件。在自然条件下，L. littorea以附着在硬基底上的藻类和生物膜为食，使齿舌齿暴露于富含矿物质的食物来源和反复的磨损负荷，这强烈影响齿舌齿的磨损和功能性能[43]。已知生物膜可以结合和浓缩无机离子，包括钙和硅，可能在进食过程中促进矿物质的吸收或现有涂层的稳定。相比之下，均匀的实验室饮食和进食环境可能改变了齿舌齿的负荷条件，尽管有硬基底的存在。个体在硬塑料水族箱表面上进食。这种基底与自然基底在结构上完全不同，自然基底结构复杂、富含矿物质并且覆盖有生物膜。因此，在硬塑料上进食可能降低了磨损复杂性和微观机械异质性。正如元素分析所确认的，食物中含有足够的钙和硅（见补充表1-3中的食物元素组成），涂层组成的改变不能仅用矿物质限制来解释。相反，进食过程中的减少或改变的机械刺激可能影响了使用和更新过程中强化元素在齿舌齿涂层中的吸收、保留或空间组织，即使在化学上有利的pH值条件下也是如此。这些发现表明，在解释基于实验室的海洋酸化实验时，必须考虑进食机制和基底特性，而不仅仅是矿物质供应。4.10. 生态影响和更广泛的相关性在生态尺度上，L. littorea的齿舌齿功能受损可能会降低其进食效率，从而改变其与潮间带栖息地中藻类和生物膜群落的相互作用。L. littorea是北海海岸和瓦登海的主要食草动物，在那里它在控制附着藻类生长和生物膜动态方面起着关键作用[43]，[68]，[69]。因此，进食性能的降低可能会对群落结构和初级生产者之间的竞争相互作用产生连锁效应[70]，[71]。更广泛地说，这项研究表明，海洋酸化可以通过材料水平的降解来损害功能关键的、非钙化的进食结构。虽然海洋酸化研究传统上集中在壳和骨骼成分上[2]，[17]，[72]，但这些发现强调了需要扩展对酸化影响的评估，以包括对进食、生存和生态系统功能至关重要的复合生物工具。4.11. 研究的局限性和未来方向应承认这项研究的几个局限性。SEM、CLSM和EDX分析的样本量必然有限，而且酸处理组的死亡率较高，可能会使结果偏向于更能耐受压力的个体。除了pH值外，其他水质参数也可能导致观察到的齿舌齿属性的差异。尽管盐度和主要离子组成被调整以接近自然海水，但碳酸盐系统种类、碱度、痕量离子可用性和水更新率等因素可能与自然条件不同。这些参数可能会影响离子活性、蛋白质离子化状态和牙齿表面的矿物-有机相互作用，从而独立于总体pH值影响矿物质吸收或涂层稳定性。此外，静态的实验室条件缺乏潮间带栖息地特有的动态化学波动，在那里周期性暴露于空气、淡水输入和生物驱动的pH值变化可能在维持齿舌齿材料特性方面起作用。因此，除了pH值之外的水质微妙差异可能与进食条件相互作用，从而影响维持个体的齿舌齿组成和机械性能。此外，实验设计无法完全区分齿舌齿形成期间产生的效应和形成后由于化学改变或弱化导致的效应，因为齿舌齿是在较长时间内产生的，并且仅在使用时才暴露。除了直接的海水暴露外，齿舌齿形成后的修改也可能受到齿舌齿唾液特性的影响。在其他软体动物中，唾液已被证明含有反应性化合物和交联剂，可以稳定或修改进食结构的有机基质，可能有助于 eruption后的强化或再矿化[73]。相反，某些分类群的唾液分泌物也可能是酸性的，可能会局部增强溶解或材料弱化[33]，[74]，[75]，[76]。目前，L. littorea的唾液化学成分和pH值尚不清楚。因此，唾液介导的过程可能在进食过程中调节齿舌齿材料特性，从而可能减轻或加剧酸化海水的效应，代表了环境pH值影响齿舌齿性能的另一个目前尚未解决的途径。未来的研究应结合受控进食实验和齿舌齿发育和更新的时间分辨分析，同时明确考虑海水化学和潜在的唾液介导的效应对 eruption后齿舌齿修改的影响。这样的实验最好在波动的pH值条件下进行，以更好地反映沿海环境特有的显著自然变异性，而不是恒定的实验室条件[7]，[77]。此外，在酸化条件下直接测量放牧率和摄食效率对于将齿舌牙齿的材料降解与生态表现联系起来非常有用，因为即使摄食活动保持不变，齿舌也可能受到损伤[18]。最后，通过对具有不同齿舌结构、摄食方式和不同元素吸收水平的腹足类动物进行比较研究[19]，可以进一步阐明酸化对软体动物摄食结构的普遍影响，并帮助识别能够抵御碳酸盐化学变化的特征。

5. 结论

本研究表明，海洋酸化可以通过改变齿舌牙齿的材料性质来显著损害Littorina littorea齿舌的功能完整性，而不是其整体形态或组织结构。暴露在较低pH值环境中会导致牙齿磨损加剧，同时硬度和刚性显著降低，尤其是在牙齿的外层涂层中。这些机械变化与特定处理条件下的元素组成变化密切相关，最显著的是在酸性条件下硅元素的流失，这突显了复合材料组织对齿舌性能的重要性。对照组和实验室饲养个体之间的差异进一步强调了齿舌牙齿的性质不仅受海水化学成分的影响，还受摄食条件的影响，从而突显了控制齿舌性能因素的复杂性。通过关注一种非钙化但机械要求较高的摄食结构，本研究将目前对海洋酸化影响的理解扩展到了壳体和骨骼元素之外。结果表明，酸化会削弱生物获取能量的关键工具，可能对个体适应性和生态相互作用产生潜在影响。这些发现强调了在评估生物体和生态系统对未来海洋条件的响应时，需要从更综合的角度考虑复合材料层面的降解、功能表现和环境现实性。

利益冲突声明

作者声明没有竞争利益。

伦理批准声明

不适用。

允许复制其他来源的材料

不适用。

生成式AI使用声明

在准备这项工作时，作者使用了OpenAI开发的人工智能（AI）语言模型ChatGPT（版本5.2）来改进手稿的语言。使用该服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

Wencke Krings：撰写——原始草稿、可视化、验证、监督、项目管理、方法论、研究、资金获取、形式分析、数据管理、概念化。

Henrik K. C. Schreiber：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、方法论、研究、形式分析。

Stanislav N. Gorb：撰写——审阅与编辑、验证、软件、资源、资金获取、概念化。

未引用的参考文献[42]、[65]。

数据可用性声明

有关机械性质和元素分析的数据可以在补充材料中找到。

资金声明

这项研究由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为470833544，资助对象为WK。