岩藻黄质通过直接靶向GRP78来恢复内质网（ER）的稳态并激活AMPK信号通路，从而改善代谢性脂肪性肝病（MASLD）

《Food Science & Nutrition》：Fucoxanthin Ameliorates MASLD by Directly Targeting GRP78 to Restore ER Homeostasis and Activate AMPK Signaling

　　**摘要**

确定生物活性膳食成分的直接分子靶点对于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的精准营养干预至关重要。岩藻黄质（fucoxanthin）是一种来自马尾藻（Sargassum fusiforme）的海洋类胡萝卜素，具有显著的降脂效果；然而，其精确的细胞内靶点和上游调控机制仍不清楚。在本研究中，我们利用药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）结合LC–MS/MS技术，确定了内质网（ER）伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是岩藻黄质的直接结合靶点。分子动力学（MD）模拟和细胞热位移测定（CETSA）证实了这种稳定的相互作用，主要通过ARG74残基处的氢键驱动。在ob/ob小鼠和棕榈酸诱导的HepG2细胞中，岩藻黄质处理显著减轻了肝脏脂肪变性并抑制了内质网应激。机制上，岩藻黄质-GRP78相互作用对于随后激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路是不可或缺的。值得注意的是，siRNA介导的GRP78敲低或AMPK的药理抑制完全消除了岩藻黄质的降脂和缓解内质网应激效果，证实了GRP78-AMPK轴的因果关系。这项研究阐明了一种新的靶点驱动机制，即岩藻黄质作为GRP78的配体来恢复内质网稳态并重新编程脂质代谢。这些发现将岩藻黄质-GRP78轴定位为针对MASLD的营养策略的特定治疗靶点。

**1 引言**

在过去十年中，全球生活方式和饮食模式的改变导致了代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，以前称为NAFLD/MAFLD）的发病率急剧上升（Yoon等人，2021年）。目前，MASLD影响了全球约38%的成年人群，已成为最常见的慢性肝病（Chan等人，2023年；Younossi等人，2025年）。该病的病理始于肝脏脂肪变性——即脂质代谢失衡——如果不加以管理，可能会进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、纤维化，最终发展为肝细胞癌（Huang、Wong等人，2025年；Kim等人，2023年）。尽管这一健康负担日益加重，但针对MASLD核心病理特征——肝脏脂质积累的批准药物疗法仍然很少，只有resmetirom最近被批准用于部分晚期纤维化患者（Noureddin等人，2024年；Wu等人，2025年）。虽然生活方式干预是管理的基石，但长期依从性往往较差。因此，迫切需要识别能够解决肝脏脂质沉积以阻止或逆转疾病进展的生物活性膳食成分。内质网（ER）的功能障碍是MASLD病理的主要驱动因素，内质网是控制分泌蛋白折叠、脂质生物合成和钙稳态的中心细胞器（Venkatesan等人，2023年）。在肝细胞中，尤其是与肥胖相关的游离脂肪酸（FFAs）的过量流入会导致慢性内质网应激（Bansal和Bansal，2024年）。为了应对这种情况，内质网会启动一种进化保守的途径——未折叠蛋白反应（UPR），通过增强蛋白折叠能力和促进自噬依赖的清除来恢复稳态（Christianson等人，2011年；Hotamisligil，2010年）。然而，在严重的脂肪变性情况下，这些保护机制迅速被压垮。这种适应不良的UPR通过诱导从头脂质生成（DNL）、改变线粒体活性和损害极低密度脂蛋白（VLDL）的运输来加剧疾病的进展（Celik等人，2023年；Song和Malhi，2019年）。至关重要的是，内质网伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）位于这一调控网络的顶端。在生理条件下，GRP78通过与跨膜应激传感器（IRE1、PERK、ATF6）结合来维持它们的静息状态。在脂质过载时，GRP78解离以处理错误折叠的蛋白质，从而触发UPR信号通路（Kettel和Karag?z，2024年；Shore等人，2011年）。因此，GRP78的功能障碍与肝脏脂质代谢的失调密切相关（He等人，2025年；Luo等人，2022年）。因此，旨在调节GRP78以恢复内质网稳态的药物策略代表了打破代谢过载与肝脏损伤之间联系的有希望的方法。海洋是具有代谢调节潜力的天然生物活性化合物的丰富来源（Wu等人，2023年）。岩藻黄质是一种在马尾藻等褐藻中丰富的海洋类胡萝卜素，已被证明在对抗肥胖和胰岛素抵抗方面具有显著效果（Li等人，2020年；Wu等人，2024年；Yusof等人，2022年）。我们之前的研究表明，岩藻黄质通过激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路来减轻肝脏脂肪变性（Yang等人，2024年），AMPK是细胞能量状态的主要传感器。然而，关于这一事件的确切分子启动机制仍存在关键知识空白。由于AMPK是一个胞质激酶复合物，亲脂性岩藻黄质分子如何触发其激活的机制仍不清楚。具体来说，尚未确定与岩藻黄质直接相互作用并传递其降脂信号的细胞内靶点，这限制了对其药理作用机制的理解。在这项研究中，我们采用了结合生物信息学、化学生物学和分子模拟的综合性方法来阐明岩藻黄质的直接作用机制。首先，临床数据集的转录组分析突出了内质网应激和AMPK信号通路在MASLD发病机制中的关键作用。基于这些发现，我们利用药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）结合质谱技术——一种无标记的靶点结合策略（Huang、Zhang等人，2025年）来筛选直接结合伙伴。我们确定了内质网伴侣蛋白GRP78是岩藻黄质的主要物理靶点。在这里，我们提供了岩藻黄质作为GRP78功能配体的首个证据。我们证明这种特定的相互作用稳定了内质网功能，并启动了有益的GRP78-AMPK信号通路，从而改善了肝脏脂肪变性。这项工作不仅阐明了岩藻黄质的靶点驱动机制，还将GRP78-AMPK轴定位为肝脏疾病的营养干预的可行靶点。

**2 材料与方法**

**2.1 材料和化学品**

岩藻黄质（纯度≥95%）从马尾藻中分离并纯化，由宁波天虹生物科技有限公司（中国宁波）提供。棕榈酸（PA，#P5585）、牛血清白蛋白（BSA）和蛋白酶抑制剂混合物（#P8340）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国纽约州格兰德岛）。Pronase（#10165921001）购自Roche Diagnostics（德国曼海姆）。Pierce BCA蛋白测定试剂盒（#A55864）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。针对GRP78（#3177）、eIF2α（#9722）和磷酸化eIF2α（Ser51，#3398）的一抗购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。针对AMPKα（#ab32047）和磷酸化AMPKα（Thr172，#ab133448）的二抗购自Abcam（英国剑桥）。针对微管蛋白（#sc-47,724）和HRP标记的二抗购自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。所有其他使用的化学试剂均为分析级。

**2.2 MASLD相关数据集的生物信息学分析**

从基因表达组学数据库（GEO）中检索了MASLD患者和健康对照组的肝脏组织转录组数据集（访问号GSE48452）。使用GEO2R工具鉴定差异表达基因（DEGs），阈值设定为|log2 Fold Change|>1且调整后的P值<0.05。使用DAVID数据库（v6.8）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。进行基因集富集分析（GSEA）以识别显著富集的生物通路，统计显著性定义为标准化富集分数（|NES|）>1且假发现率（FDR）<0.05。

**2.3 细胞培养和处理**

HepG2人肝癌细胞来自美国类型培养物收集中心（ATCC，#HB-8065），并在含有10%（v/v）FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，置于含5% CO2的湿润环境中，温度为37°C。为了加载脂质，将棕榈酸储备溶液（100 mM DMSO）与无脂肪酸BSA（摩尔比6:1）结合制备工作溶液。细胞在存在或不存在岩藻黄质的情况下，以指示浓度处理100 μM棕榈酸24小时。根据需要，使用化合物C（AMPK抑制剂）或Thapsigargin（Tg，内质网应激诱导剂）作为药理工具。

**2.4 药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）测定**

DARTS测定用于识别岩藻黄质的直接蛋白靶点，方法如先前所述（Jia等人，2024年；Ren等人，2021年），并对目标检测进行了特定修改。简要来说，HepG2细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的M-PER缓冲液中裂解。裂解液通过离心（12,000 × g，15分钟，4°C）澄清，然后使用BCA蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度（调整最终浓度为2.5–5 μg/μL）。为了确定岩藻黄质的最佳浓度以结合靶点，进行了范围为0、50、100、200、500和1000 μM的初步实验。选择100 μM的浓度用于后续实验，因为它产生了最明显的GRP78保护条带，而没有引起非特异性结合或过饱和。细胞裂解液分成等份，并与岩藻黄质（最终浓度100 μM）或DMSO（空白对照）在室温下连续搅拌1小时，以促进配体-蛋白结合。为了确定最佳蛋白水解条件，进行了Pronase与蛋白比例范围为1:100、1:500、1:1000和1:2000（w/w）的初步实验。选择1:100（w/w）的比例用于最终实验，因为它产生了稳定的消化模式，同时有效保留了保护条带。随后，样品在室温下使用优化的Pronase浓度进行有限蛋白水解20分钟。通过添加蛋白酶抑制剂终止消化，然后加入5 × SDS-PAGE上样缓冲液并在100°C下煮沸10分钟。样品通过SDS-PAGE分离，并通过银染色观察差异条带。

**2.5 LC–MS/MS分析**

从岩藻黄质处理组中提取的受保护蛋白条带，在凝胶中用胰蛋白酶消化后，由中国北京Novogene公司的EASY-nLC 1200与Q Exactive HF-X质谱仪进行分析。原始数据使用Proteome Discoverer（Sequest HT）在UniProt人类数据库中搜索，FDR<1%。考虑了具有≥2个独特肽的蛋白质。根据肽得分和覆盖率对候选蛋白进行排名；GRP78因其最高得分和与生物信息学分析中识别的内质网应激通路的相关性而被选为最佳 hit。

**2.6 细胞热位移测定（CETSA）**

为了验证活细胞中的靶点结合，基于配体诱导的热稳定原理进行了CETSA。HepG2细胞用岩藻黄质（100 μM）或DMSO处理1小时。细胞收集后用PBS洗涤，并重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。细胞悬浮液分成等份，并在温度梯度（37°C–60°C）下分别加热3分钟，然后在室温下冷却3分钟。对于等温剂量-反应（ITDR）CETSA，细胞裂解液在固定温度（52°C）下与不同浓度的岩藻黄质孵育。加热后的裂解液在4°C下以20,000 × g离心20分钟以沉淀蛋白质。可溶性上清液使用抗GRP78抗体进行Western blotting分析。

**2.7 分子对接和分子动力学（MD）模拟**

人类GRP78蛋白的晶体结构从蛋白质数据库（PDB）中获取，或使用AlphaFold 3.0在特定结构不可用时进行建模。使用AutoDock Vina（v1.2.6）进行分子对接，以预测结合姿势和亲和力。选择结合能量最低的复合物进行MD模拟。MD模拟使用GROMACS（版本2022.4）进行，蛋白质使用Amber99sb-ildn力场，岩藻黄质使用通用Amber力场（GAFF）。复合物在立方盒子中用TIP3P水分子溶解，并通过添加Na+和Cl?离子使系统中性化。在能量最小化（最陡下降算法）和平衡（NVT和NPT集合各100 ps）后，进行了100 ns的生产运行，温度为300 K和1 bar。计算了轨迹分析，包括均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）以及氢键占据率。结合自由能使用基于稳定轨迹（最后35 ns）的分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法计算。

**2.8 动物实验**

雄性ob/ob小鼠（B6.Cg-Lepob/J，6周龄）和野生型C57BL/6J同窝小鼠购自Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.（中国北京）。小鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养，光照/黑暗周期为12小时。适应1周后，ob/ob小鼠随机分为两组（每组8只）：模型组喂食标准饲料，处理组喂食添加了0.2%（w/w）岩藻黄素的标准饲料。野生型小鼠作为正常对照。干预8周后，小鼠被安乐死，并收集肝脏组织，立即在液氮中冷冻。所有动物实验程序均获得了温州大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号：WZU-2023-030）。

2.9 生化分析
细胞内甘油三酯（TG）的测定使用的是酶试剂盒（南京建城生物工程有限公司生产），按照制造商的说明书进行操作。

2.10 HepG2细胞中的油红O染色
为了评估HepG2细胞中的脂质积累情况，首先将细胞用戊二醛固定10分钟，然后加入丙二醇处理10分钟。固定后，用油红O溶液对细胞进行染色10分钟。使用Leica DM300 LED显微镜捕捉图像，并通过Image Pro Plus软件对油红O染色区域进行半定量分析。

2.11 siRNA转染
针对人类GRP78的小干扰RNA（siRNA，sc-44261）和非靶向的随机对照序列购自Santa Cruz Biotechnology公司。按照制造商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将siRNA转染到HepG2细胞中。转染后48小时通过Western blot检测敲低效率，随后进行岩藻黄质处理。

2.12 定量实时PCR（qRT-PCR）
总RNA使用Tritazol试剂（Invitrogen）提取。cDNA的合成采用PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa，日本）完成。qRT-PCR在实时PCR系统上进行，使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）。相对基因表达水平通过2^-ΔΔct方法计算，以β-actin作为内参。引物序列列于表1中。

表1. qRT-PCR设计的引物对
基因
正向引物（5′至3′）
反向引物（5′至3′）

2.13 Western Blot分析
蛋白质裂解液在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中制备。等量的蛋白质（30–50 μg）通过SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜（Millipore）上。膜用5%脱脂牛奶封闭，然后在4°C下与特异性一抗孵育过夜，接着与HRP标记的二抗孵育。蛋白质条带使用Enhanced Chemiluminescence（ECL）试剂盒可视化，并通过ImageJ软件进行定量分析。

2.14 统计分析
所有数据以至少三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。统计差异使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。两组之间的比较采用非配对Student's t检验。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果
3.1 转录组分析揭示ER应激和AMPK信号传导是MASLD的关键病理节点
为了系统地解析MASLD的分子机制，我们对GEO数据集GSE48452进行了全面的生物信息学分析。差异表达分析显示MASLD患者与健康对照组相比具有独特的转录组特征。基因本体论（GO）富集分析表明，差异表达基因（DEGs）主要富集在与脂质代谢（例如，脂质储存、甘油脂代谢过程）和内质网（ER）应激反应（例如，对内质网应激的反应、未折叠蛋白的结合）相关的生物过程中（图1A,B）。与这些发现一致，KEGG通路分析突出了代谢通路、AMPK信号通路、NAFLD以及内质网中的蛋白质处理的显著变化（图1C,D）。详细的通路映射进一步显示了MASLD肝脏中AMPK信号通路的抑制（图1E,F）和UPR组分的激活。此外，基因集富集分析（GSEA）证实与脂质生物合成和PPAR信号传导相关的基因集显著富集，而氧化磷酸化受到抑制（图1G,H）。总体而言，这些转录组数据表明，内质网稳态失调和AMPK信号传导受损是MASLD的关键病理节点，这指导了我们后续的分子靶点搜索。为了实验验证这些生物信息学发现，我们检查了实验模型中关键标志物的表达模式。值得注意的是，在ob/ob小鼠和PA处理的HepG2细胞中观察到的HSPA5（GRP78）、DDIT3（CHOP）和FASN的上调趋势与人类MASLD数据集（GSE48452）一致，从而增强了我们后续机制研究的转化相关性。

3.2 确定GRP78作为岩藻黄质的直接细胞靶点
为了建立脂质积累的细胞模型，我们首先评估了棕榈酸（PA）在HepG2细胞中的细胞毒性。100 μM PA处理24小时并未引起显著的细胞毒性（细胞存活率>90%；图S1），因此选择这一浓度用于后续实验以诱导脂质积累而不引起大量细胞死亡。此外，岩藻黄质处理并未显著改变体内的体重或食物摄入量，进一步支持其对脂质代谢的直接影响。虽然我们之前的工作已经确定岩藻黄质是一种AMPK激活剂，但其直接的上游靶点尚不清楚。为了鉴定岩藻黄质结合蛋白，我们采用了药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）测定（图2A）。将HepG2细胞裂解液与岩藻黄质（100 μM）孵育后进行有限的蛋白酶消化，发现一个大约70–100 kDa的明显保护性条带（图2B，箭头所示）。质谱分析鉴定出几种潜在的岩藻黄质结合伴侣。GRP78因其最高的肽覆盖率和得分以及与生物信息学预测的一致性而被选为最佳候选者。为了在细胞背景下验证这种物理相互作用，进行了细胞热位移测定（CETSA）。岩藻黄质处理显著增强了GRP78在温度梯度（37°C–60°C）下的热稳定性（图2C），并且在52°C时以浓度依赖性方式增强（10^-3至102 μM，图2D），提供了有力的生化证据。

3.3 岩藻黄质直接靶向并热稳定GRP78
（A）用于鉴定岩藻黄质结合蛋白的药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）测定工作流程示意图。（B）DARTS测定的代表性银染SDS-PAGE凝胶。HepG2细胞裂解液与岩藻黄质（Fux，100 μM）孵育1小时，然后用蛋白酶（1:100比例）消化20分钟。黑色箭头指示了通过质谱鉴定为GRP78的78 kDa附近的保护性蛋白条带。（C）细胞热位移测定（CETSA）。用Fux（100 μM）处理的HepG2裂解液在指定的温度梯度（37°C–60°C）下加热。Western blot显示在Fux存在下GRP78的热稳定性增强。（D）等温剂量-响应（ITDR）CETSA。裂解液在固定温度（52°C）下用逐渐增加的Fux浓度（10^-3至102 μM）处理，证实了GRP78的剂量依赖性稳定。为了阐明这种相互作用的分子基础，我们进行了分子对接和分子动力学（MD）模拟。对接分析预测岩藻黄质占据GRP78中的一个特定口袋，结合能为-5.87 kcal/mol（图3A）。100 ns的MD模拟证实了该复合物的稳定性（图3B），通过平衡后的RMSD（图3C）、降低的回转半径（图3D）和结合区域的微小局部波动（图3E）得到验证。机制上，氢键分析确定ARG74是维持相互作用的关键残基（图3F）。基于稳定轨迹（65–100 ns）的MM/PBSA计算得出结合自由能为-19.43 kcal/mol，其中ARG74、ILE190和THR151的贡献最大（图3G,H）。吉布斯自由能图显示了一个单一的深度能量最小值，证实了岩藻黄质-GRP78复合物的热力学稳定性（图3I）。

3.4 岩藻黄质缓解ob/ob小鼠和棕榈酸负荷肝细胞的肝内ER应激和脂肪变性
接下来，我们使用瘦素缺乏的ob/ob小鼠研究了靶向GRP78是否能在体内带来治疗益处。Western blot分析显示，与WT对照组相比，ob/ob小鼠的GRP78蛋白水平显著升高，反映了慢性ER应激。岩藻黄质处理（饮食中添加0.2%的岩藻黄质，持续8周）显著降低了肝细胞中的GRP78表达（图4A），并显著减少了eIF2α的磷酸化比率（p-eIF2α/eIF2α），这是UPR激活的标志（图4B）。一致地，qRT-PCR分析表明岩藻黄质抑制了关键UPR标志物DDit3（CHOP）和Ern1（IRE1）的肝mRNA表达（图4C,D）。

3.5 岩藻黄质减轻ob/ob小鼠和棕榈酸负荷肝细胞的肝内ER应激和脂肪变性
接下来，我们使用瘦素缺乏的ob/ob小鼠研究了靶向GRP78是否能在体内带来治疗益处。Western blot分析显示，与WT对照组相比，ob/ob小鼠的GRP78蛋白水平显著升高，反映了慢性ER应激。岩藻黄质处理（饮食中添加0.2%的岩藻黄质，持续8周）显著降低了肝细胞中的GRP78表达（图4A），并显著减少了eIF2α的磷酸化比率（p-eIF2α/eIF2α），这是UPR激活的标志（图4B）。一致地，qRT-PCR分析表明岩藻黄质抑制了关键UPR标志物DDit3（CHOP）和Ern1（IRE1）的肝mRNA表达（图4C,D）。为了在体外验证这些发现，我们使用了棕榈酸（PA）诱导的HepG2细胞模型。PA处理显著上调了GRP78蛋白水平和ER应激基因标志物（HSPA5、ATF6、DDIT3、ERN1）。岩藻黄质干预逆转了这些变化（图5A–F）。此外，当细胞受到Thapsigargin（Tg）这种强效ER应激诱导剂的挑战时，岩藻黄质显著减弱了Tg诱导的GRP78上调和细胞内甘油三酯积累（图5G）。这些结果证实岩藻黄质在体内和体外都能直接对抗ER应激。

3.6 GRP78-AMPK信号通路对岩藻黄质治疗效果至关重要
最后，我们阐明了岩藻黄质-GRP78相互作用、AMPK激活和脂质调节之间的因果关系。我们使用siRNA在HepG2细胞中敲低GRP78的表达（图6A）。在对照细胞中，岩藻黄质有效减少了PA诱导的脂质积累；然而，在GRP78被敲低的细胞中，这种降脂效果完全消失，脂质沉积反而加剧（图6B,C）。基因表达分析显示，GRP78的敲低消除了岩藻黄质下调脂生成基因（SREBP1C、FASN）的能力，而其对上调脂肪酸氧化基因（PPARα、CPT1）的影响仍然存在（图6D–G）。GRP78的敲低作用逆转了Fux对PA诱导的脂质积累的保护效应。(C) 细胞内TG水平的定量。(D–G) 脂质代谢基因的相对mRNA表达：脂肪酸氧化基因PPARα (D) 和CPT1 (E)；脂质生成基因SREBP1C (F) 和FASN (G)。数据以平均值±标准差（n=3）表示。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns，无显著差异。比例尺=25 μm。重要的是，我们发现GRP78对于岩藻黄质诱导的AMPK激活是必需的。虽然岩藻黄质增加了PA处理细胞中的p-AMPK水平，但在GRP78敲低细胞中这种激活作用被消除了（图7A）。相反，用Compound C抑制AMPK会逆转岩藻黄质抑制GRP78表达和内质网应激标志物的能力（图7B–F），并阻止甘油三酯含量的减少（图7G）。图7在图查看器中打开。

GRP78-AMPK轴对于岩藻黄素的治疗效果至关重要。(A) p-AMPK和总AMPK的Western印迹。GRP78敲低（siGRP78）阻止了PA处理细胞中Fux诱导的AMPK磷酸化。(B, C) AMPK抑制对内质网应激的影响。细胞先用Compound C（10 μM）处理，然后进行PA + Fux处理。Western印迹显示GRP78水平（B）和p-eIF2α/eIF2α比率（C）。(D–F) 内质网应激基因的相对mRNA表达：ATF6 (D), ERN1 (E), 和DDIT3 (F)。Compound C处理阻断了这些基因的下调。(G) 细胞内TG水平的定量。AMPK抑制消除了Fux的降脂效果。数据以平均值±标准差（n=3）表示。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。综上所述，这些数据描绘了一个新的信号通路，其中岩藻黄素通过物理方式与GRP78结合，触发AMPK激活，从而缓解内质网应激并抑制脂质生成。这证实了GRP78是调控岩藻黄素在代谢性脂肪肝（MASLD）中治疗效果的关键上游调节因子。

4 讨论

随着代谢性脂肪肝（MASLD）的患病率不断增加，迫切需要发现能够同时解决肝脂肪变性和细胞器功能障碍的新治疗药物（Yang等人，2025年）。尽管岩藻黄素作为代谢调节剂显示出潜力，但其在内肝细胞中的确切分子靶点尚未明确。在这项研究中，我们结合了多组学分析、化学蛋白质组学和分子模拟，首次证明GRP78是岩藻黄素的直接功能靶点。我们证明岩藻黄素通过物理方式与内质网伴侣蛋白GRP78结合，从而激活AMPK信号通路，恢复内质网稳态并重新编程脂质代谢。这种以靶点为导向的机制使岩藻黄素区别于非特异性抗氧化剂，并将GRP78-AMPK轴定位为MASLD治疗的关键接口。鉴于内质网应激在MASLD进展中的核心作用，确定GRP78为岩藻黄素的靶点尤为重要。在脂毒性条件下，内质网的适应能力被超出，导致“适应不良的UPR”反应，加剧脂质生成和炎症（Lebeaupin等人，2018年；Shang等人，2025年）。GRP78位于这一调控网络的顶端，控制IRE1、PERK和ATF6的激活。我们的数据显示，岩藻黄素不仅抑制下游的内质网应激标志物（例如CHOP、p-eIF2α），还通过稳定GRP78本身起作用。鉴定出的关键结合位点ARG74位于GRP78的核苷酸结合域（NBD）中。我们的对接结果表明，岩藻黄素的结合可能会引起NBD的构象变化。有趣的是，实验数据表明岩藻黄素并不抑制ATP酶活性，这表明它作为调节剂而非竞争性抑制剂发挥作用。值得注意的是，分子动力学模拟显示岩藻黄素结合到GRP78的特定口袋上。与传统的化学伴侣蛋白（例如TUDCA/PBA）主要作为溶剂稳定剂不同（Alotaibi和Alkhammash，2025年；Freitas等人，2023年），岩藻黄素似乎作为一种特定的配体来调节GRP78的构象。这种“类似配体的”行为表明其在纠正内质网功能障碍方面具有更强大和特异的作用机制。我们的发现提出了一个关键的理论问题：内质网中的GRP78与主要位于细胞质的AMPK之间的空间协调。尽管GRP78（BiP）传统上定位于内质网腔内，但我们的结果明确表明GRP78敲低会消除岩藻黄素诱导的AMPK磷酸化，从而确立GRP78作为这一信号通路中不可或缺的上游调节因子。为了解释这种拓扑分离，我们提出了一个“构象信号”模型，该模型由GRP78的动态性质促进。在代谢应激下，GRP78已知可以与跨膜内质网传感器相互作用，甚至转移到细胞质和细胞表面（Makio等人，2024年）。我们假设岩藻黄素与GRP78的NBD结合会诱导特定的构象变化，通过两种可能的非排他性机制触发下游信号传导。一种可能的途径涉及钙-CaMKKβ轴。GRP78是内质网钙（Ca2+）储存的主要门控蛋白（Daverkausen-Fischer和Pr?ls，2022年）。岩藻黄素的结合可能调节GRP78与内质网钙释放通道（如IP3R）的相互作用，导致Ca2+可控地“泄漏”到细胞质中。这种局部增加的细胞质Ca2+随后会激活CaMKKβ，这是一种典型的上游激酶，它在Thr172位点磷酸化AMPK（McAloon等人，2024年）。另一种可能是GRP78作为分子支架，与内质网定位的跨膜蛋白（如PERK或IRE1）相互作用。岩藻黄素可能稳定GRP78-跨膜复合物，从而将LKB1从内质网边缘招募到细胞质中，促进其与AMPK复合物的相互作用（Marcondes-de-Castro等人，2023年）。值得注意的是，我们观察到岩藻黄素不抑制GRP78的ATP酶活性，这表明它调节而不是阻断伴侣蛋白的功能循环，同时保留其基本的生理作用并增强其应激缓解能力。这项研究进一步阐明了岩藻黄素如何打破“脂毒性-内质网应激的恶性循环”。在MASLD中，脂质过载触发内质网应激，进而通过SREBP-1c（SREBF-1c）的激活促进新的脂质生成，形成正反馈循环（Ke等人，2025年；Li等人，2023年）。我们发现GRP78-AMPK轴具有双重效应：（1）“代谢救援”：激活的AMPK磷酸化ACC并下调SREBP-1c/FASN，切断脂质合成并促进脂肪酸氧化（PPARα/CPT1）；（2）“内质网强化”：通过减少内质网膜上的脂质负荷并可能直接调节UPR信号，GRP78的稳定恢复了蛋白质折叠能力。当我们用Compound C抑制AMPK时，岩藻黄素缓解内质网应激的能力丧失，表明代谢改善是解决内质网应激的先决条件，或者至少与其紧密相关。这种对代谢和应激反应的协同“双重打击”支持了岩藻黄素的强大疗效。尽管有这些有希望的发现，但仍需考虑一些局限性。虽然我们使用DARTS和CETSA确认了岩藻黄素-GRP78的相互作用，但未来的结构生物学研究（如X射线晶体学）将有助于可视化精确的结合界面。此外，虽然我们使用了ob/ob小鼠和细胞模型，但在肝特异性GRP78敲除小鼠中验证这一机制将进一步增强体内因果关系的结论。尽管如此，我们的发现具有直接的转化应用价值。它们表明，补充富含岩藻黄素的海藻或纯化的营养补充剂可以作为预防MASLD的有效策略。此外，这里鉴定出的GRP78结合口袋可以作为设计高亲和力合成配体的模板，用于治疗与内质网应激相关的代谢疾病。为了未来的临床转化，实现这一剂量确实需要浓缩的岩藻黄素补充剂或提高生物利用度的制剂。值得注意的是，岩藻黄素已显示出良好的安全性，没有毒性副作用或基因毒性/致突变性（Zhang等人，2024年），先进的纳米技术提高了其生物活性和治疗效果（Wang等人，2025年）。这些发现支持其进一步临床开发的潜力，尽管更高剂量需要额外的安全性评估。我们发现的转化可行性将取决于确定人体中的最小有效剂量和开发具有改善口服生物利用度的制剂。总之，这项研究揭示了一种新的分子机制，其中岩藻黄素作为GRP78的靶向AMPK激活剂。通过直接与GRP78结合，岩藻黄素调节治疗反应，缓解内质网应激并纠正脂质代谢功能障碍。这些发现不仅阐明了岩藻黄素的药理学基础，还突出了GRP78-AMPK轴作为MASLD营养和药物干预的可靶向靶点。

作者贡献

程 Wang：项目管理和资源协调。张静贵：资源协调和资金获取。文正顺：正式分析、数据可视化。洪亮：资金获取、写作-审稿和编辑、项目管理和监督、资源协调。陈斌斌：监督、资源协调、项目管理和监督。童海斌：写作-审稿和编辑、资金获取、资源协调、项目管理和监督。张瑞芬：软件使用、数据管理、验证、正式分析。吴宇：软件使用、方法学设计、验证。张琳：写作-初稿撰写、概念构思、方法学设计、数据可视化、软件使用。王超：数据可视化、项目管理和资源协调。

致谢

本研究得到了国家卫生健康委员会能力建设和继续教育中心慢性病管理研究项目（编号GWJJMB202510024127）、中央政府层面的关键项目：贵重中药资源的可持续利用能力建立（编号2060302）、温州新品种培育的重大科技项目（编号ZX2024003-4）、浙江省“三农九方”科技合作计划（编号2025SNJF041）以及海南省自然科学基金（编号822QN453）的财政支持。

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者索取，如需合理请求即可提供。