用于饲料和潜在食品应用的大豆乳清蛋白生产过程中微生物和有机污染物的来源

《Food Science & Nutrition》：Sources of Microbial and Organic Contaminants in the Production of Soybean Whey Protein for Feed and Potential Food Applications

　　摘要

大豆乳清废水（SWW）富含大豆乳清蛋白（SWP），但容易发生微生物引起的变质，这对环境和资源造成了挑战。本研究探讨了在通过气动浮选法回收SWP过程中，密封缓冲罐出水中出现变质现象的原因——变质的特点是具有刺鼻、酸味和腐臭的气味。宏基因组学、细菌多样性分析以及高效液相色谱（HPLC）分析显示，专性厌氧菌Megasphaera spp.在变质废水中占主导地位（丰度高达44%），它们消耗了乳酸（从进水中的10.2 g/L降低到出水中的2.7 g/L），并产生了有异味的丙酸和丁酸（分别高达3.6 g/L和4.3 g/L）。评估了三种缓解策略：（1）全规模高通量曝气——可能有效但能耗高且成本高昂；（2）局部曝气——成本低但抑制效果较弱；（3）使用益生菌Enterococcus faecium LBSW进行微生物干预，这种益生菌可以在缓冲罐中定植，仅在微生物控制失败时使用局部曝气。由于策略（3）在能源和成本方面的效率较高，因此被采纳，成功减少了污染并促进了SWP的回收。尽管E. faecium LBSW在食品应用中的生物安全性需要谨慎对待，但回收的SWP主要用作动物饲料，随后通过高温干燥和灭菌（>120°C）处理后也有潜力用于食品级用途。

1 引言

随着全球人口的快速增长，对营养尤其是蛋白质的需求也在增加（Aiking 2011；Kim等人2019）。作为最重要的动物饲料和人类消费蛋白质来源之一，大豆蛋白的工业生产规模在全球范围内不断扩大（Thrane等人2017；Messina 2022）。大豆乳清废水（SWW）是大豆蛋白分离（SPI）生产的副产品（Su等人2011；Wang和Serventi 2019），是一种营养丰富的液体——特别富含大豆乳清蛋白（SWP）（Yu等人1998；Qiu等人2019）。由于其出色的营养成分和多种应用，这种蛋白质成分在饲料和食品工业中备受重视（Feng等人2009；Lee等人2014）。因此，有效利用SWW已成为近年来饲料和食品工业关注的焦点（Feng等人2009；Lee等人2014）。目前，气动浮选系统是回收废水中的SWP的主要方法（Li等人2018；Zhou等人2020）。该技术以其高通量和效率而闻名，非常适合工业规模的操作。如图1A所示，在山东 Lvbang生物有限公司（专门从事SWW资源利用），气动浮选系统的前端是一个开放的密封缓冲罐（40 m × 20 m × 3 m，容积2400 m3，水温维持在约40°C，pH值为3–5）。缓冲罐的上游是来自SPI过程的SWW（进水）。罐底含有生物活性污泥，为微生物提供了定植场所。缓冲罐的下游称为出水，直接连接到气动浮选系统。进入气动浮选系统后，出水经过板框过滤或离心脱水（堆叠螺旋脱水）以分离固相。固相随后被干燥和灭菌（进气温度：120°C–180°C），并研磨成饲料级的okara。这种okara富含粗蛋白（25%–35% SWP）、纤维和益生元（如残余寡糖），使其成为高质量的动物饲料原料，也有潜力用于食品工业。然而，在SWP回收过程中，SWW废水经常出现微生物变质现象（一年中可发生四次），产生强烈的刺鼻和恶臭气味，污染了SWP产品（Chua和Liu 2019）（图1A）。这些问题不仅阻碍了SWP的生产，还影响了最终产品的质量和安全性，从而对饲料和食品工业构成了重大挑战。

2 材料与方法

2.1 材料、菌株和培养基

从中国滨州市山东Lvbang生物科技有限公司的SWW缓冲罐中收集了进水和出水样本（坐标：37°14′83″N 118°18′45″E）。所有有机酸均从Aladdin Reagent公司购买。Enterococcus faecium LBSW储存在我们的实验室，并存入中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 25,299（后续的全长16S rDNA测序确认其确实是Enterococcus faecium SF68）。使用MRS培养基分离和常规培养E. faecium LBSW。使用YCFA培养基从变质SWW中分离Megasphera sp. LY（Liu等人2007）。添加了10 g/L乳酸的MRS培养基用于其常规培养。所有Megasphera sp. LY的培养均在厌氧条件下进行。

2.2 采样与分析方法

由于缺乏关于SWW出水变质的具体微生物或化学原因的先验知识，最初根据可观察到的和一致的感觉特征对样本进行分组——特别是刺鼻、酸味和腐臭气味的强度（即变质），因为这是工业环境中的主要问题。一个由五名成员组成的训练有素的小组（所有成员在山东Lvbang生物科技有限公司工作超过3年）使用标准化的四点量表（? = 无，+ = 轻微，++ = 中等，+++ = 强烈）对所有样本进行了评估，然后对具有相同变质程度的样本进行了平均分组（表1）。这种表型分层使得能够有针对性地进行比较分析，以揭示潜在的微生物和代谢机制，这些机制随后通过宏基因组学和高性能液相色谱（HPLC）分析得到确认。表1显示了SWW进水和出水组的特征。

2.3 进水和出水SWW的高通量16S rDNA测序

所有用于高通量测序的样本均先在6000 × g的条件下离心，得到的固体在高温干燥冰上冷冻，然后进行高通量16S rDNA测序（16S rRNA基因扩增子测序）。使用ABI GeneAmp9700仪器和引物338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）通过聚合酶链反应（PCR）扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。测序由Illumina Miseq PE 300高通量测序仪在中国上海的Majorbio公司完成，并在Majorbio I-Sanger云平台上进行分析（http://www.i-sanger.com/）。数据已存入国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，访问号为BioProject PRJNA1012818。

2.4 霰弹宏基因组测序

为了构建配对末端文库，使用Covaris M220（Gene Company Limited，中国）将DNA序列随机片段化至平均长度约400 bp。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒（Bio Scientific，美国德克萨斯州奥斯汀）构建配对末端（PE）文库，并由Illumina Hiseq 2000平台（Majorbio公司，中国上海）进行测序，采用101 bp配对末端测序策略。质量低或模糊的序列读段被去除，然后将配对末端序列读段合并成标签。标签的平均长度约为170 bp。数据已存入NCBI，访问号为BioProject PRJNA1012830。宏基因组测序结果在Majorbio I-Sanger云平台上进行分析（http://www.i-sanger.com/）。

2.5 菌株分离

对于Megasphaera菌株的分离，将严重变质的SWW出水依次稀释并涂布在添加了10 g/L乳酸的YCFA琼脂培养基上，然后放入厌氧袋中密封，在40°C下培养7天，之后挑选出黑色绿色的菌落并纯化。使用基因组DNA分离试剂盒分离Megasphaera的基因组DNA，并用引物27F和1492R作为模板扩增16S rRNA基因。PCR产物经过纯化，与pEASY-Blunt载体连接后转入E. coli DH5α感受态细胞中。阳性转化子首先通过PCR筛选，然后由中国上海的Sangon Biotech有限公司进行测序。

2.6 Enterococcus faecium LBSW与Megasphera sp. LY的共培养

将E. faecium LBSW和Megasphera sp. LY两种菌株在MRS培养基中培养至光密度（OD600nm）为2.0，均在厌氧条件下进行。共培养系统中，Megasphera sp. LY的浓度分别为2%（v/v），E. faecium LBSW的浓度分别为0%、5%、10%或20%（v/v），培养液体积为500 mL，含有100 mL的SWW进水。每个组重复三次实验。在40°C下静态培养3天后，由一个训练有素的五人小组对每个组的变质气味进行评估，并记录变质气味的严重程度。此外，还进行了Ino-0（2% Megasphera sp. LY和0% E. faecium LBSW）和Ino-15（2% Megasphera sp.LY和15%的E. faecium LBSW被采样用于有机酸分析和宏基因组测序。

3 结果与讨论

3.1 宏基因组分析揭示厌氧环境是污水恶臭的驱动因素

由于在本研究开始时，导致污水恶臭的具体微生物及其代谢产物尚不清楚，我们采用了恶臭强度这一实际且与操作相关的表型指标来衡量恶臭的严重程度。在工业实践中，恶臭——其特征是刺鼻、酸败和腐烂的气味——是工艺失败的主要指标，并直接影响产品质量和环境合规性。为了确保一致性和减少主观性，所有样本在收集后立即由五名经过培训的评估人员进行评估。表1显示，每三个恶臭程度相同的样本被归为一组。基于传统的污水处理系统，我们对微生物群进行了研究（图1B）。需要指出的是，污水常常受到恶臭的污染，这会严重降低营养资源的回收率，并导致饲料和食品的经济损失。更严重的是，工厂周围和下游地区的空气和水体会受到污染。因此，我们使用微生物监测策略来追踪污染源（图1B）。对采样的污水进行显微镜检查发现，某些细菌存在于污水的进水阶段，并且在出水阶段这些细菌的数量有所增加。所有污水进水样本都没有恶臭，这可能归因于污水从上游的SPI生产线通过管道直接快速流入缓冲池。相比之下，出水样本表现出不同程度的恶臭。因此，我们怀疑某些特殊细菌与污水的恶臭污染有关，这些细菌群落的差异可能对此类恶臭具有启示作用。然后对八组采样的污水进行了细菌群落分析，并通过ANOSIM分析验证了分组的合理性（图S1）。经过质量过滤和修剪后，从16S rRNA基因扩增子测序中获得了总共1,030,346个序列，平均长度为421 bp。为了在极端表型下获得最清晰的功能基因差异，对严重恶臭的污水（CE组）和正常污水（UE组）的出水样本进行了宏基因组测序。这产生了平均库大小为13.23 Gbp（范围：12.06至14.4 Gbp）的序列，其中98.0%（范围：97.8%–98.3%）的碱基位于组装片段内（表S1）。接着，我们比较了两个宏基因组测序组之间前50个最丰富代谢途径基因（图2A）。显然，与CE样本相比，UE样本中某些代谢途径的基因丰度更高。氧化磷酸化代谢途径的基因丰度在UE中为1.38 × 10^6次读取，远高于CE中的3.59 × 10^5次读取。同样，在氧化磷酸化代谢中，负责将氧气还原为H2O的关键酶细胞色素氧化酶（EC7.1.1.9）的基因丰度在UE中为0.23%，而在CE中仅为0.0031%。结合在恶臭出水样本中检测到的溶解氧值下降（表1），我们推测恶臭污染的污水中可能存在厌氧环境。

3.2 导致污水恶臭的微生物及其代谢产物

由于污染产生了酸性和腐烂的气味，我们进一步关注了参与有机酸代谢的基因。总体而言，CE组中丙酮酸代谢基因的读取数量（8.37 × 10^5）高于UE组（1.24 × 10^5）。在丙酮酸代谢基因中，对乳酸合成起决定性作用的乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27，LDH）的基因丰度在UE组中占比更高（0.36%），而在CE组中仅为0.079%（图2B），表明恶臭污水中发生了乳酸的消耗。此外，丙酸代谢（CE组中的读取数量为4.46 × 10^5，UE组中为1.04 × 10^5）和丁酸代谢（CE组中的读取数量为4.2 × 10^5，UE组中为1.56 × 10^4）的基因数量在CE组中也高于UE组。具体来说，EC2.8.3.1（丙酸-CoA：乳酸酰-CoA转移酶）的相对基因丰度在CE组中为0.092%，而在UE组中未检测到。在丙酸合成途径中，EC2.8.3.1催化乳酸转化为乳酸酰-CoA，并启动从乳酸开始的丙酸合成途径。它还负责将丙酸-CoA转化为丙酸，这是丙酸合成的最后一步（Prabhu等人，2012年）。同时，在编码丁酸合成关键酶的基因方面，CE组和UE组之间也观察到了类似的差异：丁酰辅酶A转移酶（EC2.8.3.8）和丁酰-CoA-乙酰乙酸-CoA转移酶（EC2.8.3.9）（Miller和Jenesel，1979年；Diaz-Gonzalez等人，1999年；Duncan等人，2002年）的相对丰度在CE组中为0.048%，而在UE组中仅为0.002%（图2B）。为了在宏观层面上验证这些基因差异，使用HPLC监测了每组污水中的有机酸含量（图4G）。UE样本中的乳酸平均含量为8.73 ± 0.97 g L^-1，而仅检测到少量丁酸（0.1 ± 0.01 g L^-1）和丙酸（0.33 ± 0.02 g L^-1）。值得注意的是，随着污染程度的增加，这些出水样本中的乳酸浓度呈规律性下降（SE组为6.68 ± 0.55，ME组为5.31 ± 0.41，CE组为2.65 ± 0.24 g L^-1）。相比之下，随着恶臭污染程度的增加，三个恶臭污染组中的丙酸浓度范围为1.15 ± 0.09至3.59 ± 0.28 g L^-1，是正常污水（UE组，0.33 g L^-1）的3.5至10.9倍。同样，与正常污水（UE组）相比，这些恶臭污水样本中检测到的丁酸含量高出12倍以上，并且随着恶臭污染程度的增加而逐渐积累（从1.24 ± 0.13增加到4.25 ± 0.2 g L^-1）。因此，所有证据都证实，污染污水中的恶臭物质是丙酸和丁酸，它们来源于乳酸代谢。为了识别产生丙酸和丁酸的微生物，对编码参与丙酸和丁酸合成关键酶的基因进行了物种条形图和功能贡献分析。严格厌氧的Megasphera菌属在CE样本中对EC2.8.3.1、EC2.8.3.8和EC2.8.3.9的基因丰度贡献了100%，表明丁酸和丙酸的积累归因于Megasphera的代谢（图2C）。这与先前的研究结果一致，即Megasphera可以通过厌氧发酵产生大量短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸和丙酸（Huang等人，2016年；Shahab等人，2020年），并伴有难闻的气味（O'Neill和Phillips，1992年；Yan等人，2014年；Simeoli等人，2017年）。因此，我们可以得出结论，污水中的Megasphera细菌的存在导致了污染，进而阻碍了后续的资源回收。

3.3 恶臭污水中的细菌群落动态

为了总结污水中细菌群落的变化规律并为污染控制提供思路，监测了不同组污水中的细菌群落。每组Alpha多样性指数的平均值记录在表S2中。Good's覆盖率值表明测序深度足以代表细菌的多样性水平。计算Shannon指数以比较每组在属水平上的物种多样性（Allen等人，2009年），并在正常和恶臭出水样本之间观察到了显著的细菌多样性差异（图3A–D）。在正常污水（UE）中，物种多样性显著低于相应的进水样本（UI）。相比之下，所有恶臭污水的细菌多样性都远高于其进水样本（p < 0.05）。这意味着这些恶臭污水中形成了更复杂的微生物群落，导致污水中的微生物污染并促进了恶臭的发生。进一步使用PCoA和NMDS分析在属水平上分析了各组之间的细菌群落差异。结果表明，恶臭污水组（SE、ME、CE）与正常污水组（UI、UE、SI、MI、CI）之间存在显著的群落差异，这可能是由于恶臭污水组中出现了新的菌属（图3E–F）。

3.3 恶臭污水中的细菌及其代谢产物

由于污染产生了酸性和腐烂的气味，我们进一步关注了参与有机酸代谢的基因。总体而言，CE组中丙酮酸代谢基因的读取数量（8.37 × 10^5）高于UE组（1.24 × 10^5）。在丙酮酸代谢基因中，对乳酸合成起决定性作用的乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27，LDH）的基因丰度在UE组中占比更高（0.36%），而在CE组中仅为0.079%（图2B），表明恶臭污水中发生了乳酸的消耗。此外，丙酸代谢（CE组中的读取数量为4.46 × 10^5，UE组中为1.04 × 10^5）和丁酸代谢（CE组中的读取数量为4.2 × 10^5，UE组中为1.56 × 10^4）的基因数量在CE组中也高于UE组。具体来说，EC2.8.3.1（丙酸-CoA：乳酸酰-CoA转移酶）的相对基因丰度在CE组中为0.092%，而在UE组中未检测到。在丙酸合成途径中，EC2.8.3.1催化乳酸转化为乳酸酰-CoA并启动丙酸合成途径。它还负责将丙酸-CoA转化为丙酸，这是丙酸合成的最后一步（Prabhu等人，2012年）。同时，在编码丁酸合成关键酶的基因方面，CE组和UE组之间也观察到了类似的差异：丁酰辅酶A转移酶（EC2.8.3.8）和丁酰-CoA-乙酰乙酸-CoA转移酶（EC2.8.3.9）（Miller和Jenesel，1979年；Diaz-Gonzalez等人，1999年；Duncan等人，2002年），CE组中的相对丰度为0.048%，而在UE组中仅为0.002%（图2B）。为了在宏观层面上验证这些基因差异，使用HPLC监测了每组污水中的有机酸含量（图4G）。UE样本中的乳酸平均含量为8.73 ± 0.97 g L^-1，而仅检测到少量丁酸（0.1 ± 0.01 g L^-1）和丙酸（0.33 ± 0.02 g L^-1）。值得注意的是，这些出水样本中的乳酸浓度随着污染程度的增加而呈规律性下降（SE组为6.68 ± 0.55，ME组为5.31 ± 0.41，CE组为2.65 ± 0.24 g L^-1）。相比之下，随着恶臭污染程度的增加，三个恶臭污染组中的丙酸浓度范围为1.15 ± 0.09至3.59 ± 0.28 g L^-1，是正常污水（UE组，0.33 g L^-1）的3.5至10.9倍。同样，与正常污水（UE组）相比，这些恶臭污水样本中检测到的丁酸含量高出12倍以上，并且随着恶臭污染程度的增加而逐渐积累（从1.24 ± 0.13增加到4.25 ± 0.2 g L^-1）。因此，所有证据都证实，污染污水中的恶臭物质是丙酸和丁酸，它们来源于乳酸代谢。为了确定产生丙酸和丁酸的微生物，对编码参与丙酸和丁酸合成关键酶的基因进行了物种条形图和功能贡献分析。严格厌氧的Megasphera菌属在CE样本中对EC2.8.3.1、EC2.8.3.8和EC2.8.3.9的基因丰度贡献了100%，表明丁酸和丙酸的积累归因于Megasphera的代谢（图2C）。这与先前的研究结果一致，即Megasphera可以通过厌氧发酵产生大量短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸和丙酸（Huang等人，2016年；Shahab等人，2020年），并伴有难闻的气味（O'Neill和Phillips，1992年；Yan等人，2014年；Simeoli等人，2017年）。因此，我们可以得出结论，污水中的Megasphera细菌的存在导致了污染，进而阻碍了后续的资源回收。

3.3 恶臭污水中的细菌群落动态

为了总结污水中细菌群落的变化规律并为污染控制提供思路，监测了不同组污水中的细菌群落。每组Alpha多样性指数的平均值记录在表S2中。Good's覆盖率值表明测序深度足以代表细菌的多样性水平。计算Shannon指数以比较每组在属水平上的物种多样性（Allen等人，2009年），并在正常和恶臭出水样本之间观察到了显著的细菌多样性差异（图3A–D）。在正常污水（UE）中，物种多样性显著低于相应的进水样本（UI）。相比之下，所有恶臭污水的细菌多样性都远高于其进水样本（p < 0.05）。这意味着这些恶臭污水中形成了更复杂的微生物群落，导致污水中的微生物污染并促进了恶臭的发生。进一步使用PCoA和NMDS分析在属水平上分析了各组之间的细菌群落差异。结果表明，恶臭污水组（SE、ME、CE）与正常污水组（UI、UE、SI、MI、CI）之间存在显著的群落差异，这可能是由于恶臭污水组中出现了新的菌属（图3E–F）。

为了更深入地了解污水的细菌多样性，比较了这些组在属水平上的群落丰度。在正常污水中，乳杆菌菌株占主导地位，其在UE样本中的丰度为94.7%，远高于UI组中的39.0%（图4A）。相比之下，在恶臭污染程度增加的出水样本中，乳杆菌的丰度逐渐下降，从94.7%降至42.9%（图4F）。乳杆菌的减少与恶臭污水中乳酸浓度的下降相吻合（图4G）。与乳杆菌丰度的减少相反，专性厌氧的Mitsuokella和双歧杆菌，尤其是Megasphera，在恶臭污水中表现出显著的丰度（图4E）。在SE出水样本中，Megasphera的相对丰度占所有细菌的3.4%（图4B），然后在ME组（图4C）和CE组（图4D）中变得更加丰富，分别为13.6%和44.0%。双歧杆菌和Mitsuokella在UE样本中不存在，但在所有恶臭污水中都出现。然而，双歧杆菌的丰度（UE组：0%；SE组：19.3%；ME组：17.4%；CE组：4.3%）与Megasphera的趋势相反，而Mitsuokella的丰度（UE组：0%；SE组：3.1%；ME组：9.26%；CE组：1.2%）随着恶臭程度的增加没有规律性（图4E）。这表明Megasphera可以被认为是导致污水恶臭的唯一厌氧细菌。在污水进水和正常污水中，几乎没有Megasphera、双歧杆菌和Mitsuokella。结合恶臭污水中溶解氧值的下降（表1）和主要细菌群落的变化（图4B–E），可以推断恶臭污染的污水中发展出了类似的乳酸驱动的DF（暗发酵）系统（Lorenz和Gentile，2014年；Chen等人，2019年；Lacroux等人，2023年）。厌氧环境和乳酸为Megasphera菌属的生长创造了有利条件（Kung Jr和Hession，1995年；Mackie等人，2002年），从而导致恶臭污染的爆发（图2D和图S3）。因此，抑制Megasphera菌属的生长对于预防和控制污水中的恶臭污染至关重要。

图4显示了不同恶臭程度下污水进水和出水组中的细菌丰度以及有机酸含量。UI和UE组（A）、SI和SE组（B）、MI和ME组（C）、CI和CE组（D）在属水平上的细菌丰度。三种专性厌氧菌（E）和乳杆菌（F）在污水样本中的丰度。污水进水和出水样本中的有机酸含量（G）。UE代表无恶臭的污水组，SE代表轻微恶臭的出水组，ME代表中度恶臭的出水组，CE代表严重恶臭的出水组。每个组包含三个生物重复样本。?1、?2 和 ?3 分别代表同一组中的三个样本。

3.4 提出一种生物方法来抑制腐臭污水中的 Megasphera

基于对污水中微生物和基因的监测结果，很明显 Megasphera 是导致污水腐臭污染的罪魁祸首，因为它会产生丙酸和丁酸等酸性污染物（见图 S3）。因此，消除腐臭污染最经济且环保的方法是利用微生物相互作用来抑制 Megasphera 的生长。巧合的是，缓冲池底部沉积了大量的生物活性污泥（见图 1），这为益生菌提供了理想的定殖场所。因此，只需要一次性接种足够数量的具有表面定殖能力的 Megasphera 抑制益生菌即可建立其存在。关于选择能够定殖并抑制 Megasphera 的益生菌，我们进行了文献回顾。根据之前的研究，给哺乳猪喂食 E. faecium 后，哺乳猪肠道中的 Megasphera 数量显著减少（Li 等人，2017 年）。作为益生菌，E. faecium 具有在肠道表面定殖的能力，并广泛用作动物生产中的饲料添加剂；它可以产生细菌素和过氧化氢等物质（Moy 等人，2004 年；El-Ghaish 等人，2015 年），这些物质也可能抑制像 Megasphera 这样的严格厌氧菌。这些证据促使我们将实验室储存的 E. faecium LBSW（通过 16S rDNA 序列比对鉴定为 E. faecium SF68）引入到腐臭污染的细菌群落中。值得注意的是，虽然 E. faecium 是一种益生菌，但它也是一种机会性病原体，在饲料和食品工业中使用时需要谨慎考虑。然而，E. faecium SF68 已被证明是一种安全有效的益生菌制剂（Greuter 等人，2020 年）。它缺乏毒力因子，且研究通常未能在 E. faecium SF68 中检测到主要的肠球菌毒力基因（如 cyl、gelE 和 esp）（Eaton 和 Gasson，2001 年）。它通过定殖而不是侵袭发挥作用，被描述为一种“共生”菌株，能够在不侵入血液或深层组织的情况下与宿主和平共存（Ghazisaeedi 等人，2022 年）。因此，选择 E. faecium LBSW 应用于饲料工业是可行的。考虑到山东 Lvbang 生物科技有限公司的 SWP 生产线包括后续的干燥和灭菌步骤（见图 1），温度超过 120°C，持续时间约为半小时，任何残留的 E. faecium LBSW 在最终的蛋白质残渣中可能会被灭活。因此，生产的 SWP 有潜力应用于食品工业。尽管如此，为了完全符合食品行业的标准，未来的研究应进一步进行活菌检测和产品的成分分析。此外，建议在未来的研究中深入研究和开发新的、完全无毒的能够抑制 Megasphera 属的益生菌。

3.5 提出的生物相互作用方法的有效性

为了模拟腐臭污染，我们从腐臭的废水中分离出了 Megasphera sp. LY（其 16S rDNA 与 Megasphera elsdenii 100% 相同），并将其接种到污水进水中。当 Megasphera sp. LY 的接种量为 2%（体积比）且 E. faecium LBSW 的接种量为 0% 时，经过 3 天的共同培养后，污水进水变得严重腐臭（标记为 Ino-0）。预期地，当 E. faecium LBSW 的接种量为 5%–20% 时，Megasphera 菌株的生长显著受到抑制，腐臭气味也明显减轻（见图 5A、B）。特别是在添加了 15% 或更多 E. faecium LBSW 后，经过 3 天的共同培养后，观察到了完全抑制（将这种共同培养标记为 Ino-15）。尽管 E. faecium LBSW 的接种比例相对较高，但在实际工业应用中，单次接种就足以在缓冲池底部的活性污泥中建立定殖，从而无需后续补充。

3.5 提出的生物相互作用方法的有效性

为了模拟腐臭污染，我们从腐臭的废水中分离出了 Megasphera sp. LY（其 16S rDNA 与 Megasphera elsdenii 100% 相同），并将其接种到污水进水中。当 Megasphera sp. LY 的接种量为 2%（体积比）且 E. faecium LBSW 的接种量为 0% 时，经过 3 天的共同培养后，污水进水变得严重腐臭（标记为 Ino-0）。预期地，当 E. faecium LBSW 的接种量为 5%–20% 时，Megasphera 菌株的生长显著受到抑制，腐臭气味也明显减轻（见图 5A、B）。特别是在添加了 15% 或更多 E. faecium LBSW 后，经过 3 天的共同培养后，观察到了完全抑制（将这种共同培养标记为 Ino-15）。尽管 E. faecium LBSW 的接种比例相对较高，但在实际工业应用中，单次接种就足以在缓冲池底部的活性污泥中建立定殖，从而无需后续补充。

3.5 提出的生物相互作用方法的有效性

为了模拟腐臭污染，我们从腐臭的废水中分离出了 Megasphera sp. LY（其 16S rDNA 与 Megasphera elsdenii 100% 相同），并将其接种到污水进水中。当 Megasphera sp. LY 的接种量为 2%（体积比）且 E. faecium LBSW 的接种量为 0% 时，经过 3 天的共同培养后，污水进水变得严重腐臭（标记为 Ino-0）。预期地，当 E. faecium LBSW 的接种量为 5%–20% 时，Megasphera 菌株的生长显著受到抑制，腐臭气味也明显减轻（见图 5A、B）。特别是在添加了 15% 或更多 E. faecium LBSW 后，经过 3 天的共同培养后，观察到了完全抑制（将这种共同培养标记为 Ino-15）。尽管 E. faecium LBSW 的接种比例相对较高，但在实际工业应用中，单次接种就足以在缓冲池底部的活性污泥中建立定殖，从而无需后续补充。

3.5 提出的生物相互作用方法的有效性

为了模拟腐臭污染，我们从腐臭的废水中分离出了 Megasphera sp. LY（其 16S rDNA 与 Megasphera elsdenii 100% 相同），并将其接种到污水进水中。当 Megasphera sp. LY 的接种量为 2%（体积比）且 E. faecium LBSW 的接种量为 0% 时，经过 3 天的共同培养后，污水进水变得严重腐臭（标记为 Ino-0）。预期地，当 E. faecium LBSW 的接种量为 5%–20% 时，Megasphera 菌株的生长显著受到抑制，腐臭气味也明显减轻（见图 5A、B）。特别是在添加了 15% 或更多 E. faecium LBSW 后，经过 3 天的共同培养后，观察到了完全抑制（将这种共同培养标记为 Ino-15）。尽管 E. faecium LBSW 的接种比例相对较高，但在实际工业应用中，单次接种就足以在缓冲池底部的活性污泥中建立定殖，从而无需后续补充。

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