IBP35（由Lactiplantibacillus plantarum和Ligilactobacillus salivarius组成的混合物）对巨噬细胞及环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫增强作用

《Food Science & Nutrition》：Immune-Enhancing Effects of IBP35, a Combination of Lactiplantibacillus plantarum and Ligilactobacillus salivarius, in Macrophages and Cyclophosphamide-Induced Immunosuppressed Mice

　　摘要

合理的益生菌组合应基于其联合配方的增强效果的证据，并通过体内疗效进行验证。在本研究中，我们使用体外实验和体内实验研究了IBP35的免疫刺激潜力，IBP35是由Lactiplantibacillus plantarum IDCC 3501和Ligilactobacillus salivarius IDCC 3551以1:1的比例组成的组合。在RAW 264.7巨噬细胞中，IBP35显著增加了一氧化氮的产生，其水平比单独使用任一菌株时高出25%–43%（p < 0.01–0.001）。IBP35还使TNF-α和IL-6的分泌增加了2.0–2.5倍（p < 0.001），表明巨噬细胞的激活得到了增强。我们使用环磷酰胺（CPA）诱导的免疫抑制小鼠模型评估了IBP35的效果。CPA处理显著降低了脾脏自然杀伤（NK）细胞的活性（46.43% ± 10.64% vs. 正常对照组的62.47% ± 9.53%，p < 0.05），而高剂量的IBP35显著提高了NK细胞的活性，达到了与正常对照组相当的水平（61.3% ± 7.93%，p < 0.05 vs. CPA）。在CPA处理的小鼠中，IBP35显著增强了ConA刺激的细胞因子产生，使IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平增加了2.0–3.0倍（p < 0.01–0.001）。巨噬细胞的溶酶体酶活性也显著升高（124% of control，p < 0.001）。组织学分析显示，IBP35减轻了CPA诱导的脾萎缩和淋巴组织耗竭。在健康小鼠中，IBP35调节了免疫反应，而没有引起过度炎症。总体而言，这些结果表明IBP35调节了先天性和适应性免疫反应，并在免疫抑制条件下支持免疫功能。

1 引言

免疫能力对于宿主防御感染、恶性肿瘤和环境压力因素至关重要。然而，免疫功能可能受到多种因素的干扰，包括衰老、慢性压力、感染、营养缺乏以及环磷酰胺（CPA）等化疗药物（Edelman和Zolla-Pazner 1989；Vivier和Malissen 2005；Zheng等人2020；Munteanu和Schwartz 2022；Zhu等人2024；Warrick等人2025）。这些免疫抑制状态与更高的发病率和恢复延迟有关（Khansari等人1990；Goodwin 1995；Guggilla等人2025），这促使人们越来越关注能够支持免疫功能的营养策略（Wu等人2019）。在饮食干预中，益生菌因其免疫调节特性而受到越来越多的研究。特定的菌株已被证明可以刺激巨噬细胞活性，促进自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性，并调节细胞因子的产生，从而最终影响先天性和适应性免疫反应（Galdeano等人2007；Azad等人2018；Guo和Lv 2023；Noh等人2022）。这些效应主要是通过与模式识别受体（如Toll样受体）的相互作用来介导的，从而导致下游免疫信号通路的激活（Chen等人2024）。然而，当前文献中仍存在几个关键的限制。首先，益生菌的效果具有高度的菌株特异性，即使是密切相关的菌株也可能表现出不同的免疫学特征（Drago等人2010；Van Hemert等人2010；Ahmad Kendong等人2021）。尽管如此，许多研究仍然依赖于物种或属级别的分类，从而导致忽略了种内多样性。这一限制尤为重要，因为即使在同一物种内，不同菌株在细胞因子诱导能力上也可能存在显著差异，这强调了在免疫调节筛选中进行菌株级别评估的必要性（Drago等人2010）。其次，尽管多菌株益生菌配方在商业上被广泛使用，但很少有研究严格评估了混合效果或菌株间的兼容性（McFarland等人2018）。实际上，单菌株和多菌株配方之间的效果差异可能源于复杂的菌株间相互作用。因此，应通过实验评估混合配方，而不能仅仅因为组合了单独有效的菌株就假设它们会提供更好的效果（Ouwehand等人2018；McFarland 2021）。为了应对这些挑战，迫切需要开发出有功能证据支持的合理组成的益生菌组合。在本研究中，我们开发了IBP35，这是一种由Lactiplantibacillus plantarum IDCC 3501和Ligilactobacillus salivarius IDCC 3551以1:1的比例组成的配方，这两种菌株因其各自的免疫刺激特性而被选中。初步发现表明，在测试条件下，该联合配方诱导的巨噬细胞激活指标（包括一氧化氮（NO）和促炎细胞因子的产生）高于单独使用任一菌株时的效果。我们首先在RAW 264.7巨噬细胞中评估了IBP35的免疫激活潜力，以评估其免疫调节活性。随后在CPA诱导的免疫抑制小鼠模型中测试了该配方，以研究其在免疫受损条件下的免疫反应增强能力。作为功能免疫指标，评估了NK细胞活性、T细胞细胞因子产生、巨噬细胞酶活性和脾脏组织病理学。本研究提供了支持IBP35免疫调节活性的综合细胞和体内证据。这些发现为基于证据的益生菌设计提供了科学基础，并支持进一步研究免疫调节方法。

2 材料与方法

2.1 细菌菌株及其制备

L. plantarum IDCC 3501和L. salivarius IDCC 3551从Ildong Bioscience有限公司（韩国）的培养 kolec tion中获得。每种菌株分别接种到含有葡萄糖和酵母提取物的培养基中，并在37°C下培养16小时以达到最佳生长。培养后，通过4°C下3000×g离心10分钟收获细菌细胞，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤两次，并在121°C下高压灭菌15分钟进行热灭活。通过将样品接种到MRS琼脂上并在37°C下培养72小时，如果没有可检测到的菌落形成，则确认完全灭活。为了标准化剂量，每种热灭活的制备物在PBS中连续稀释，并使用Neubauer计数室（Marienfeld Superior，德国）确定细胞数量。根据计数的细胞数量，每种菌株制备物用PBS调整至最终浓度为1×10^8细胞/mL。为了制备IBP35，将L. plantarum IDCC 3501和L. salivarius IDCC 3551的热灭活悬浮液以1:1（v/v）的比例混合。表1中详细列出了用于比较分析的参考菌株和分离株。热灭活的细菌制备物用于体外实验，而活的IBP35制备物用于动物研究。

2.2 细胞培养和NO测定

小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞（韩国首尔细胞系库）在Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，补充了10%的热灭活胎牛血清（FBS；Gibco）和1%的青霉素-链霉素（Gibco），并在含有5% CO?的湿润培养箱中保持在37°C。细胞在70%–80%的汇合度下传代，并在一致的传代范围内用于实验。对于NO测定，细胞以1×10^5细胞/孔的密度接种到96孔板中并培养24小时。随后，RAW 264.7细胞用最终浓度为1×10^7细胞/mL的细菌悬浮液处理24小时，而PBS作为对照。收集培养上清液，并使用Griess试剂（Sigma-Aldrich，美国）定量亚硝酸盐浓度。简而言之，上清液与等体积的Griess试剂混合并在室温下避光培养10分钟。在540 nm处测量吸光度，并使用亚硝酸钠标准曲线计算NO水平（单位为μM）。

2.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）

为了定量细胞因子，RAW 264.7细胞以1×10^5细胞/孔的密度接种到96孔板中并培养18小时。向RAW 264.7细胞中添加IBP35，最终浓度分别为1×10^4、1×10^5、1×10^6和1×10^7细胞/mL，并培养24小时。然后收集培养上清液进行细胞因子分析。TNF-α和IL-6的水平使用市售的ELISA试剂盒（R&D Systems和Sigma-Aldrich，美国）根据制造商的协议进行测量。使用微孔板读数仪读取吸光度，并根据每个试剂盒提供的标准曲线计算细胞因子浓度。细胞因子浓度以pg/mL表示。

2.4 动物研究设计和处理方案

从忠北国立大学（韩国清州）的实验动物研究中心获得了6周大的雄性BALB/c小鼠（20–23克），并在标准条件下饲养（21°C ± 2°C，相对湿度50% ± 20%，12小时光照/黑暗周期），自由进食和水。所有动物实验均获得了忠北国立大学动物护理和使用委员会的批准（批准号CBNUA-961-16-01）。经过1周的适应期后，小鼠被随机分配到六个组（每组n = 7只）：正常对照组（NC）、仅CPA组、CPA + IBP35组（1×10^5 CFU/天）、CPA + IBP35组（1×10^7 CFU/天）和仅IBP35组（1×10^7 CFU/天），以评估IBP35的潜在剂量依赖性效果。除了NC组外，所有组每天腹腔注射一次CPA（Sigma-Aldrich），剂量为100毫克/千克体重，连续3天（第0-2天）。IBP35通过口服灌胃每天给药一次，连续12天，剂量为10毫升/千克。在CPA + IBP35组中，IBP35的给药在第一次CPA注射前5天开始，并在整个研究期间持续（图1显示了研究时间线）。图1展示了IBP35给药和CPA诱导的免疫抑制的时间线。IBP35每天口服给药一次，连续12天。在CPA + IBP35组中，IBP35的预处理在第一次CPA注射前5天开始，并在整个研究期间持续。所有动物在第12天被处死进行终点分析。

2.5 体重和免疫器官指数

在基线（第0天）和研究完成时（第12天）记录小鼠的体重。处死时，收集脾脏和胸腺，擦干并称重。使用以下公式计算免疫器官指数：

2.6 脾细胞分离和增殖测定

脾脏在RPMI-1640培养基中无菌切除并通过40微米尼龙网机械分离，该培养基含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。使用商业裂解缓冲液（Hybri-Max；Sigma-Aldrich）裂解红细胞，剩余的脾细胞洗涤并重新悬浮在完整的RPMI培养基中。脾细胞以2×10^5细胞/孔的密度接种到96孔板中，并用脂多糖（LPS；20 μg/mL）或ConA（5 μg/mL）在37°C下刺激48小时。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo Molecular Technologies，日本）评估细胞增殖，并使用Microplate Reader（PowerWave XS；BioTek，美国）在450 nm处测量吸光度。

2.7 细胞因子分析

脾细胞在24孔板中以5×10^6细胞/孔的密度接种，并用LPS（20 μg/mL）或ConA（5 μg/mL）刺激48小时。然后收集培养上清液，并使用ELISA试剂盒（Komabiotech，首尔，韩国）分析IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，遵循制造商的说明。

2.8 脾NK细胞活性测定

脾效应细胞（5×10^5细胞/孔）与YAC-1靶细胞以50:1的效应比共培养4小时。使用CCK-8测定NK细胞介导的细胞毒性。NK细胞活性（%）使用以下公式计算：

2.9 巨噬细胞吞噬活性测定

通过腹腔注射3%硫代甘油酸盐（1毫升/小鼠）诱导腹腔巨噬细胞。72小时后，用含有10% FBS的冷RPMI-1640培养基冲洗收集腹腔渗出细胞。细胞接种到96孔板中，并用LPS（20 μg/mL）在37°C下刺激24小时。培养后，用0.1% Triton X-100裂解细胞，并使用p-硝基苯酚作为底物评估溶酶体酶活性。在405 nm处测量吸光度。巨噬细胞吞噬活性（%）使用以下公式计算：

2.10 组织学分析

脾组织在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，使用组织处理器（VIP-5 Jr；Sakura Finetek，日本）处理，包埋在石蜡中，并使用旋转切片机（RM2245；Leica Microsystems，德国）切成4微米的厚度。切片用苏木精和伊红（H&E）染色，并在光学显微镜（BX51；Olympus Optical Co., Japan）下检查组织学特征。主要观察包括淋巴组织耗竭、白髓萎缩和髓索结构。

2.11 统计分析

所有实验数据以平均值±标准差（SD）表示。对于体外实验，每个条件在独立重复中进行实验并在技术重复中测量。对于体内实验，图例中提供了每组的动物数量。使用Levene's检验评估方差的同质性。使用单因素方差分析（ANOVA）确定统计显著性，然后使用Dunnett's post hoc检验进行后续分析。在CPA模型中，仅CPA组作为参考对照，而在正常小鼠的分析中，NC组作为参考。统计显著性设定为p < 0.05。所有统计分析均使用GraphPad Prism 10（GraphPad Software，美国）进行。

3 结果

3.1 IBP35在RAW 264.7巨噬细胞中的菌株特异性免疫激活和免疫调节活性

为了评估所选菌株的免疫刺激潜力，用热灭活的L. plantarum IDCC 3501、L. salivarius IDCC 3551和一种商业益生菌菌株LGG刺激RAW 264.7巨噬细胞。IDCC 3501和IDCC 3551诱导的NO生成显著高于LGG（分别为p<0.01和p<0.05），表明在这项检测中具有更高的免疫调节活性（图2A）。进一步与其它L. plantarum和L. salivarius菌株进行种内比较显示，IDCC 3501和IDCC 3551在其各自的菌群中引发了最强烈的NO反应（p<0.001），确立了它们的菌株特异性效力（图2B,C）。

图2：在图查看器中打开

菌株特异性免疫激活以及联合制剂在RAW 264.7巨噬细胞中的增强活性。（A）热灭活的L. plantarum IDCC 3501和L. salivarius IDCC 3551诱导的NO生成显著高于商业菌株L. rhamnosus GG。（B, C）IDCC 3501和IDCC 3551在其各自的物种中表现出最高的NO诱导活性，表明具有菌株特异性的免疫效力。（D, E）联合制剂（IBP35）在所有测试浓度下进一步增强了NO生成，表明相对于单一菌株在测试条件下的活性有所提高。数据以平均值±标准差（三个独立实验）表示。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验（post hoc test）进行。统计显著性设定为p<0.05。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。然后我们评估了IBP35的NO诱导作用，IBP35是IDCC 3501和IDCC 3551的1:1混合物。在所有测试浓度下，IBP35诱导的NO生成均高于任一单一菌株。在1×10^8细胞/mL时，IBP35使NO生成分别比IDCC 3551和IDCC 3501增加了约25%和43%（p<0.01和p<0.001；图2D,E）。此外，IBP35还以剂量依赖的方式显著增加了TNF-α和IL-6的分泌（图S1A,B），表明在测试条件下巨噬细胞的激活作用增强。

3.2 IBP35对体重和免疫器官指标的影响

为了评估IBP35是否影响CPA引起的淋巴器官变化，我们测量了体重和淋巴器官指标（脾脏和胸腺）。与正常对照组（NC）相比，CPA处理并未显著影响体重，但显著降低了脾脏（NC：3.47±0.32 vs. CPA：2.78±0.80 mg/g）和胸腺（NC：1.84±0.36 vs. CPA：1.15±0.24 mg/g）的指标（所有###p<0.001 vs. NC）。低剂量和高剂量的IBP35并未显著恢复这些参数，尽管观察到脾脏指标有轻微的恢复趋势。在健康小鼠中，IBP35未引起体重下降或淋巴器官毒性（表2）。

表2. IBP35对体重和免疫器官指标的影响。

组别
第12天的体重（g）
脾脏指数（mg/g）
胸腺指数（mg/g）

NC
22.68±1.24
3.47±0.32
1.84±0.36

CPA
22.00±1.14
2.78±0.80
###
1.15±0.24

CPA+IBP35（1×10^5 CFU/天）
21.71±0.89#
3.11±1.59#
1.17±0.28#

CPA+IBP35（1×10^7 CFU/天）
22.42±1.31
3.09±0.43#
1.10±0.24#

IBP35（1×10^5 CFU/天）
22.80±0.81
3.45±0.28
1.76±0.30

IBP35（1×10^7 CFU/天）
23.21±1.11
3.46±0.30
1.80±0.36

注：数据以平均值±标准差表示。体重（n=21），脾脏和胸腺指数（n=14）。#p<0.05和###p<0.001与NC组相比。

3.3 IBP35对脾细胞增殖的影响

在ConA和LPS刺激下评估了IBP35对脾细胞增殖的影响。在正常小鼠中，暴露于ConA和LPS的脾细胞表现出强烈的增殖反应，这种反应在低剂量和高剂量下都得到了IBP35的进一步增强（p<0.001 vs. NC；图3A,B）。这表明IBP35在生理条件下增强了T细胞和B细胞的反应性。

图3：在图查看器中打开

IBP35对正常和免疫抑制小鼠脾细胞增殖的影响。（A, B）在正常小鼠中，与NC组相比，IBP35处理后脾细胞对ConA（T细胞丝裂原）和LPS（B细胞丝裂原）的增殖反应在低剂量和高剂量下均显著增强。（C, D）在CPA处理的小鼠中，脾细胞增殖显著减少，证实了免疫抑制的成功诱导。IBP35处理显示出轻微的恢复趋势，尽管变化没有达到统计显著性。数据以平均值±标准差（每组七只动物）表示。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验（post hoc test）进行。统计显著性设定为p<0.05。###p<0.001。在CPA处理的小鼠中，脾细胞增殖显著受到抑制，证实了免疫抑制的成功。尽管IBP35处理导致了轻微的增殖恢复，但其效果未达到统计显著性（图3C,D）。

3.4 IBP35对正常和CPA处理小鼠先天免疫功能的影响

3.4.1 NK细胞活性

CPA处理显著降低了脾细胞中的NK细胞活性，与NC组相比（NC：62.48%±9.53% vs. CPA：46.43%±10.64%，p<0.05；图4A）。高剂量的IBP35显著提高了NK细胞活性，与CPA组相比（61.31%±7.93%，p<0.05 vs. CPA），接近NC组观察到的水平。在正常小鼠中，IBP35处理以剂量依赖的方式增加了NK细胞活性；然而，这些变化未达到统计显著性（图4B）。

图4：在图查看器中打开

IBP35对正常和CPA处理小鼠先天免疫功能的影响。（A）CPA处理显著降低了脾脏NK细胞活性，与正常对照组（NC）相比，而高剂量的IBP35显著提高了活性，达到与正常对照组相当的水平。（B）在正常小鼠中，IBP35以剂量依赖的方式增加了NK细胞活性，尽管变化未达到统计显著性。（C）IBP35还增强了LPS刺激后腹膜巨噬细胞中的溶酶体酶活性，高剂量组观察到显著增加，表明吞噬功能有所改善。数据以平均值±标准差（每组七只动物）表示。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验（post hoc test）进行。统计显著性设定为p<0.05。#p<0.05，###p<0.001 vs. NC；*p<0.05 vs. CPA。

3.4.2 巨噬细胞溶酶体酶活性

为了评估吞噬准备情况，我们测量了LPS刺激的腹膜巨噬细胞中的溶酶体酶活性。IBP35处理以剂量依赖的方式增加了酶活性，高剂量组显示出显著增强（124.32%±4.31%，p<0.001 vs. NC；图4C）。这些结果表明在测试条件下巨噬细胞的活性有所增加。

3.5 正常和CPA处理小鼠的细胞因子谱

3.5.1 正常小鼠中的细胞因子调节

在ConA刺激下，IBP35处理显著上调了正常小鼠中的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）（p<0.001），表明向促炎T细胞反应转变（图5A–C）。IL-6也上调了，而IL-4则表现出双相模式——低剂量下降，高剂量上升（图5D,E）。相比之下，在LPS刺激下，IBP35产生了不同的模式，表现为IFN-γ水平轻微增加，TNF-α、IL-2和IL-6水平下降，IL-4水平无显著变化（图5F–J）。

图5：在图查看器中打开

IBP35对ConA或LPS刺激下正常小鼠脾细胞中的细胞因子调节。（A–E）在ConA刺激下，IBP35显著增加了Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平，以及IL-6，而IL-4表现出双相模式。（F–J）在LPS刺激下，IBP35轻微增加了IFN-γ水平，同时降低了TNF-α、IL-2和IL-6的水平，对IL-4水平没有影响。数据以平均值±标准差（每组七只动物）表示。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验（post hoc test）进行。统计显著性设定为p<0.05。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。

3.5.2 CPA处理小鼠中的细胞因子反应

CPA处理显著抑制了ConA诱导的细胞因子生成。然而，特别是高剂量的IBP35显著增加了IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和IL-4的生成，与仅CPA组相比（图6A–E）。IFN-γ和IL-6的水平以剂量依赖的方式显著增加，TNF-α的水平高于仅CPA组。相比之下，IL-2的水平显著低于正常水平，并且仅部分恢复，IL-4的变化很小（图6F–J）。在LPS刺激下，IBP35增加了IFN-γ和IL-6的水平，而对IL-2和IL-4的影响有限。

3.6 脾脏的组织病理学评估

H&E染色显示CPA诱导了脾脏萎缩，伴有白髓减少和淋巴组织耗竭（图7B）。相比之下，IBP35处理组保持了白髓区域，并减轻了结构改变，与仅CPA组相比（图7C,D）。用IBP35处理的正常小鼠的脾脏没有组织病理学异常，支持了IBP35给药的安全性（图7E,F）。

图7：在图查看器中打开

正常和免疫抑制小鼠的脾脏代表性组织病理学图像。来自（A）NC，（B）CPA，（C）CPA+IBP35低剂量，（D）CPA+IBP35高剂量，（E）IBP35低剂量，（F）IBP35高剂量的代表性H&E染色切片（放大倍数，×100）。

4 讨论

益生菌及相关微生物制剂已被广泛研究作为可能有助于维持免疫稳态和调节宿主免疫反应的膳食方法（Kaur和Ali 2022；Liu等人2022；Abbaszadeh等人2024）。越来越多的证据表明，选定的菌株可以影响先天性和适应性免疫反应，包括巨噬细胞激活、细胞因子生成和自然杀伤（NK）细胞活性（Galdeano等人2007；Azad等人2018；Guo和Lv 2023；Noh等人2022）。然而，益生菌的效果强烈依赖于菌株，即使是密切相关的菌株也可能产生不同的免疫谱型（Drago等人2010；Kim 2018；Yoo等人2020；McFarland等人2018）。与此概念一致，我们的菌株水平比较显示，Lactiplantibacillus plantarum IDCC 3501和Ligilactobacillus salivarius IDCC 3551表现出比同一物种内其他菌株更强的免疫刺激活性，从而支持这些IDCC菌株在测试条件下的更高功能效力。尽管单一益生菌菌株的生理益处已被广泛认可，但菌株组合的效力尚未完全明确。组合不同益生菌菌株通常用于提高有益效果；然而，仅凭物种或菌株水平的信息无法始终预测制剂水平的结果，因此需要通过透明报告特定终点效应来进行实证评估（McFarland等人2018）。先前的研究主要集中在单一菌株上，而在物种和制剂水平上的比较有限。在这项研究中，我们开发了IBP35，这是一种定义明确的L. plantarum IDCC 3501和L. salivarius IDCC 3551的1:1制剂，并使用体外和体内指标评估了其免疫调节活性。我们比较了每个物种内的多个菌株，然后评估了定义明确的制剂在测试条件下的特定终点效应。巨噬细胞NO生成和细胞因子分泌是体外常用的先天免疫激活指标。在这项研究中，IBP35以剂量依赖的方式增加了NO、TNF-α和IL-6的生成，并显示出比任一单独菌株更高的巨噬细胞激活指标，表明IBP35制剂在测试条件下的活性高于单一菌株处理。与之前的制剂水平观察结果一致，混合物效应并不总是可以从单个组分中轻易推断出来。例如，一种三菌株混合物（ID-JPL934）在RAW 264.7巨噬细胞中比单独测试的每个菌株更有效地抑制了LPS诱导的NO和促炎细胞因子的产生（Choi和Moon 2023）。同样，一种混合的Bacillus subtilis–Lactobacillus sakei发酵产物在RAW 264.7巨噬细胞中诱导了更强的NO生成，并增加了TNF-α和IL-6的分泌（Yoon等人2025）。总之，这些发现支持IBP35引发了一致的巨噬细胞激活效应，并强调可测量的免疫反应可能因菌株和制剂而异，这与益生菌免疫学中的菌株特异性概念一致（McFarland等人2018）。然而，需要进一步的研究来明确制剂水平活性的决定因素，并提高不同制剂和实验设置之间的可重复性。环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型提供了一个有用的框架，用于评估IBP35在受损条件下的免疫调节作用。在我们的研究中，CPA降低了NK细胞活性并抑制了丝裂原刺激的细胞因子生成。在这些条件下，高剂量的IBP35显著增加了NK细胞活性，接近正常对照组的水平。组织学上，IBP35减少了CPA处理小鼠的淋巴组织耗竭。同时，我们的结果强调了免疫调节效应依赖于终点。尽管NK活性和几个免疫指标在CPA处理的小鼠中显示出更明显的变化，但脾细胞增殖指标显示出轻微差异。这种特定于终点的模式在益生菌免疫学中并不罕见，因为不同免疫成分的响应性可能因刺激类型、免疫状态和测量结果而异（Mohamadzadeh等人，2005年；McFarland等人，2018年）。在其他由环磷酰胺（CPA）诱导的免疫抑制模型中也观察到了类似的模式（Salva等人，2014年；Kim等人，2023年；Ma等人，2023年）。例如，一种三菌株复合益生菌在中等和高剂量下增加了多种免疫指标和血清细胞因子水平，而干扰素γ（IFN-γ）仅在最高剂量下显著增加，这表明配方效果可能因检测指标和给药条件而异（Ma等人，2023年）。同样，在一个由CPA诱导的模型中，Limosilactobacillus fermentum菌株混合物对NK细胞毒性和脾细胞增殖表现出最高效果，而CD4+/CD8+ T细胞比例没有显著变化，进一步支持了检测指标依赖性的反应（Kim等人，2023年）。因此，这些发现表明IBP35可能在免疫抑制条件下优先影响选定的功能性免疫指标，其反应强度因终点和剂量而异。细胞因子分析进一步揭示了IBP35的免疫调节特性。在正常小鼠中，IBP35在ConA刺激下增强了Th1相关细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）的产生，并同时增加了IL-6水平。相比之下，在LPS刺激下，IBP35降低了TNF-α、IL-2和IL-6水平，而在较低剂量下适度增加了IFN-γ水平。这种双向调节与早期观察结果一致，即乳杆菌菌株可以对Th1/Th2平衡和先天细胞因子输出产生高度依赖情境的效果，有时促进Th1极化，在其他情况下通过差异性激活抗原呈递细胞和T淋巴细胞来抑制过度活跃的炎症反应（Mohamadzadeh等人，2005年）。在经过CPA处理的小鼠中，IBP35相对于仅使用CPA的对照组增加了ConA诱导的细胞因子产生，表明在这种刺激背景下反应性有所改善。总体而言，这些发现表明IBP35以受宿主免疫状态影响的方式调节免疫指标。IBP35处理后观察到的免疫激活可以解释为巨噬细胞和抗原呈递细胞（APCs）的早期细胞因子反应与下游适应性免疫输出之间的联系。在这项研究中，IBP35增加了RAW 264.7巨噬细胞中的NO、TNF-α和IL-6水平，这些介质的表达通常由涉及NF-κB和MAPK等经典通路的先天免疫基因程序调控（Tabarsa等人，2020年；Lee等人，2022年）。像IBP35这样的益生菌制剂可能含有免疫原性细胞相关分子，包括脂壁酸（LTA）、胞外多糖（EPS）和肽聚糖，这些分子可以通过模式识别受体（如TLR2/6和NOD样受体）参与先天免疫感知，这些受体最终影响NF-κB/MAPK调控的转录程序（Angelin和Kavitha，2020年；Pavelj?ek等人，2021年；Furnari等人，2025年）。例如，乳杆菌衍生的胞外多糖已被证明可以在RAW 264.7巨噬细胞中激活NF-κB/MAPK信号通路（Gao等人，2022年），而乳杆菌衍生的脂壁酸已被报道可以调节TLR–MyD88–MAPK/NF-κB信号通路（Zhang等人，2023年）；此外，几种乳杆菌菌株已被证明可以通过NF-κB和MAPK通路在RAW 264.7巨噬细胞中诱导iNOS/NO和细胞因子的表达（Park等人，2025年）。TNF-α可以促进炎症细胞因子和趋化因子的产生，并支持早期免疫细胞的招募，同时增强树突状细胞的成熟、抗原呈递和T细胞激活所需的共刺激信号。IL-6在先天免疫和适应性免疫之间起着关键桥梁作用，并可以影响B细胞抗体的产生和T细胞的分化环境。因此，IBP35处理后观察到的这些巨噬细胞/APC相关细胞因子可能通过细胞因子介导的相互作用，有助于ConA刺激下Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）的增加以及活体中观察到的NK活性变化。相比之下，LPS刺激下的独特细胞因子模式（TNF-α/IL-6降低，IFN-γ变化轻微）可能反映了刺激依赖性的炎症细胞因子输出调节。然而，需要通过直接的机制研究来确认潜在的通路。这项研究的另一个优势是在健康和免疫抑制两种情况下都评估了免疫调节作用。在健康小鼠中，IBP35调节了免疫指标，没有明显的毒性或过度炎症病理学的证据，这体现在没有体重减轻、没有明显的淋巴器官毒性以及IBP35组脾脏组织学未见异常。这些观察结果支持在实验条件下，免疫指标的可测量变化可以在没有明显炎症损伤的情况下发生。这项研究有几个局限性。首先，给药时间相对较短（12天），需要更长期的研究来评估其持久性和安全性。其次，体内评估仅限于单一小鼠品系/性别和单一免疫抑制模型；在更多模型和免疫挑战中的验证将增强其普遍性。第三，没有进行机制验证和微生物组/代谢物分析，限制了关于潜在通路和微生物群介导作用的结论。最后，由于一些终点在CPA处理的小鼠中显示出轻微或无显著效果，结论应保持终点特异性，避免对所有免疫结果的泛化。为了支持临床转化，还需要确定在小鼠模型中观察到的免疫指标变化是否可以在人类中转化为具有临床意义的结果。此外，反应可能因目标人群的健康状况和个体基线特征而异。因此，需要进一步的临床研究，明确定义临床相关的终点，并指定明确的目标人群和使用条件。总体而言，这项研究的发现提供了基础证据，表明IBP35在细胞检测和CPA诱导的免疫抑制小鼠模型中表现出多方面的免疫调节活性，从而支持进一步的机制和转化研究。

5 结论
这项研究表明，IBP35（由L. plantarum IDCC 3501和L. salivarius IDCC 3551组成）在多个免疫指标上表现出免疫调节活性。体外实验中，IBP35显著增强了巨噬细胞的激活、NO的产生和促炎细胞因子的释放，其巨噬细胞激活指标高于任一单独菌株在测试条件下的表现。体内实验中，IBP35改善了CPA诱导的免疫抑制小鼠的多种免疫指标，包括细胞因子产生、NK细胞活性、巨噬细胞酶活性和脾脏组织学特征；然而，脾细胞增殖仅显示出轻微且不显著的改善。总体而言，这些发现表明IBP35可能是免疫支持的潜在候选者。它能够在生理条件下调节免疫反应，并在免疫抑制条件下改善选定的免疫指标，这支持其作为功能性成分的进一步研究。未来的研究应通过长期评估、剂量范围研究和有针对性的机制研究来扩展这些发现。此外，为了支持临床转化，需要进行使用明确定义的、具有临床意义的终点的人类研究，并考虑人群健康状况和基线免疫特征的差异。如果在转化背景下得到验证，IBP35可以促进日益发展的免疫营养领域，并在健康和免疫功能受损的人群中支持免疫功能。

作者贡献
Jin Seok Moon：概念化、项目管理、撰写——审阅和编辑。Han Bin Lee：撰写——初稿、调查、正式分析。Jinho Lee：方法学、数据管理。Kyuho Jeong：资源提供、监督。Young Hoon Jung：验证、可视化。

致谢
本工作得到了Ildong Pharmaceutical Co. Ltd.（韩国首尔）的支持。

利益冲突
Han Bin Lee、Jinho Lee和Jin Seok Moon隶属于Ildong Bioscience Co. Ltd. Kyuho Jeong隶属于Ildong Pharmaceutical Co. Ltd. 其他作者均声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理请求从相应作者处获得。