富含没食子酸的卡拉胶纳米颗粒对大鼠脑缺血/再灌注损伤的预防作用：氧化途径的调控

《Food Science & Nutrition》：Preventive Effect of Gallic Acid-Loaded Carrageenan Nanoparticles Against Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rat: Modulation of Oxidative Pathway

　　**摘要**

聚合物纳米载体为神经系统疾病提供了一种有前景的药物递送平台。本研究评估了负载没食子酸的卡拉胶纳米颗粒（GA-CG NPs）在全球性脑缺血/再灌注（I/R）损伤的大鼠模型中的神经保护作用。大鼠被随机分为四组：对照组、I/R组、单纯没食子酸组（GA组）和GA-CG NPs组。在I/R诱导前14天，GA和GA-CG NPs通过口服给药。I/R后，研究人员评估了抑郁样行为和认知功能、脑梗死体积、抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）的活性、谷胱甘肽（GSH）水平、多巴胺（DA）水平以及脂质过氧化（MDA）。与I/R组相比，GA-CG NPs预处理显著改善了行为障碍并减少了脑梗死体积。这种纳米颗粒制剂增强了抗氧化防御能力，提高了SOD、CAT、GPx、GSH和DA的水平，同时降低了MDA。值得注意的是，在所有测量参数中，GA-CG NPs显示出比单纯没食子酸更强的神经保护作用。这些发现表明，GA-CG NPs能够有效预防I/R引起的脑氧化损伤，可能成为治疗脑缺血并发症的有希望的策略。

**1 引言**

脑缺血的特征是大脑血液循环中断，导致神经功能缺陷、神经元细胞死亡和严重的身体残疾（Godinho等人，2018年；Yilmaz等人，2024年）。作为全球主要的死亡原因之一，缺血性中风患者经常经历严重的并发症，包括持续的神经功能障碍（Schimidt等人，2014年）、运动协调障碍（Tang等人，2016年）、认知障碍和抑郁（Deng等人，2020年）。虽然及时再灌注对于恢复氧气供应至关重要，但随后的再灌注阶段却通过缺血/再灌注（I/R）损伤加剧了组织损伤（Medeiros等人，2020年），这是一个涉及氧化损伤、炎症反应和细胞凋亡的复杂病理生理过程。I/R损伤的病理生理机制包括线粒体功能障碍、全身炎症激活、活性氧（ROS）的过度生成，从而导致氧化应激，最终引发程序性神经元死亡（Yaidikar等人，2014年）。氧化应激是I/R损伤后神经病理损伤的主要介质。再灌注期间ROS的过度生成超过了大脑的内源性抗氧化能力，导致神经元膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化。这种氧化损伤严重损害了膜完整性和细胞功能（Wu等人，2020年）。由于可氧化脂质水平升高、高氧气消耗和抗氧化酶活性不足，脑组织特别容易受到氧化损伤（Allen和Bayraktutan，2009年）。已经提出使用抗氧化化合物作为缺血/再灌注（I/R）损伤的辅助治疗（Keskin等人，2025年；Aladag等人，2024年）。没食子酸（GA）是一种存在于多种坚果、蔬菜和水果中的酚酸（Xiang等人，2024年；Cosme等人，2020年）。GA具有多种药理作用，包括抗氧化、抗转移、抗菌、抗糖尿病、抗炎和心血管保护作用（Alves等人，2016年；Bai等人，2021年）。由于其强大的抗氧化特性和管理氧化应激相关疾病（特别是神经退行性疾病）的治疗潜力，GA在过去十年中引起了广泛的科学关注（Bai等人，2021年；Bhuia等人，2023年）。然而，其酚类结构导致其在胃肠道中迅速代谢降解，严重限制了口服吸收和全身生物利用度（Zhang等人，2020年）。为了达到有效的大脑浓度，通常需要高剂量的GA（Mansouri等人，2013年），但这种方法引发了关于剂量依赖性神经毒性的担忧（Kim等人，2011年）。基于纳米载体的封装技术最近取得了进展，成为克服这些限制的有希望的策略，提高了GA及相关酚类化合物的递送效率和安全性（Queiroz等人，2019年；Yang等人，2020年）。基于多糖的纳米载体作为口服药物递送平台具有显著优势，包括可调的化学组成、多种反应性功能基团、优异的水溶性以及内在的生物活性（Zhang等人，2021年；Qureshi等人，2019年）。卡拉胶（CG）是一种从红藻中提取的天然线性硫酸化多糖，因其良好的特性而受到特别关注：低成本生产、无毒、完全可生物降解和优异的生物相容性（Qureshi等人，2019年；Mokhtari等人，2021年）。基于CG的纳米颗粒在胃肠道条件下表现出出色的药物保护能力，同时在全身循环中保持稳定性，显著提高了像GA这样的多酚类化合物的生物利用度。这种增强机制涉及改善的细胞/组织粘附性（Yang等人，2020年；Zhang等人，2021年；Dong等人，2021年）。高浓度的硫酸基团赋予了强烈的负表面电荷，使得药物-载体之间的静电相互作用更加牢固，从而显著提高了药物负载能力（Sathuvan等人，2017年；Liu等人，2015年）。本研究评估了GA-CG NPs对I/R引起的氧化损伤及其相关行为缺陷的大鼠模型中的神经保护潜力。

**2 材料与方法**

**2.1 GA-CG NPs的合成**

首先，将5克氯化胆碱加入2.85克葡萄糖中，并将混合物加热至80°C（1小时），得到透明溶液。随后，在80°C下缓慢加入1克GA，并继续搅拌30分钟，得到均匀的蜂蜜状混合物。接着，在80°C下持续搅拌的同时将20克CG加入混合物中。反应混合物在这些条件下维持3小时，形成GA含量为34毫克/克的CG-GA NPs湿固体。

**2.2 特性分析**

使用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱（Bruker Tensor 27，德国卡尔斯鲁厄）对GA、CG和GA-CG NPs进行了特性分析。样品被制备成溴化钾（KBr）颗粒，并在500–4000 cm?1的光谱范围内进行分析。使用TESCAN MIRA III仪器通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）研究了GA、CG和GA-CG NPs的表面形态。

**2.3 动物**

所有动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南，并获得了马赞德兰大学动物伦理委员会的正式批准（批准代码：IR.UMZ.REC.1398.014）。在确保科学有效性的同时，尽一切努力确保动物福利并减少动物痛苦。成年雄性大鼠（Wistar品系，体重200–250克）从伊朗阿莫尔市的巴斯德研究所购买，并在标准化条件下饲养：环境温度维持在20°C–23°C，12小时光照/12小时黑暗周期，相对湿度为40% ± 5%。大鼠被随机分配到四个实验组（每组10只）：对照组、I/R组、单纯GA组（40毫克/千克）和GA-CG NPs组（40毫克/千克）。各治疗组在缺血/再灌注（I/R）诱导前连续14天接受每日口服给药。术后24小时进行行为评估，以评估神经功能缺陷（图1）。

**2.4 I/R手术**

I/R手术采用公认的双侧颈动脉闭塞（BCCAO）模型（Moghaddam等人，2020年）进行。简要来说，先夹闭两侧颈动脉5分钟以诱导缺血，然后释放夹子后进行5分钟的再灌注。这个闭塞-再灌注周期重复一次（总共2次5分钟缺血/5分钟再灌注）。最后，动物在标准条件下返回其饲养设施。

**2.5 术前和术后护理**

手术前大鼠禁食12小时。使用氯醛（350毫克/千克，腹腔注射）诱导麻醉。所有手术器械使用前均进行消毒。动物的体温通过加热垫维持在37°C ± 0.5°C。术后护理包括用抗菌药物清洗手术切口以防止感染，并将每只大鼠单独关在笼子中。此外，每天使用直肠温度计监测核心体温以确保适当的生理状态。最终，行为异常的大鼠（如腹泻和癫痫发作）被淘汰。

**2.6 行为测试**

**2.6.1 强迫游泳测试（FST）**

FST用于根据既定协议评估啮齿动物的抑郁样行为（Dalvi和Lucki，1999年）。将每只大鼠单独放置在一个透明的圆柱形水箱中（高度：45厘米；直径：20厘米），水中深度为30厘米（温度：23°C–25°C）。适应期后（2分钟），记录动物的行为4分钟。最后，由盲法观察者使用行为分析软件量化不动时间和爬升持续时间。

**2.6.2 尾部悬挂测试（TST）**

TST按照Cryan等人（2005年）的协议执行。简而言之，将动物尾部悬挂在距离水面60厘米的位置。6分钟的测试在标准化条件下进行，期间动物的行为被录像记录。最后4分钟内，由盲法观察者使用自动化行为分析软件量化不动时间。

**2.6.3 新物体识别测试（NORT）**

NORT用于使用开放场地装置（40 × 40 × 60厘米）评估啮齿动物的认知障碍。该测试包括三个步骤：适应空盒子、使用两个相同物体（X1和X2）的训练试验以及长期记忆（LTM）。在LTM步骤中（训练步骤后24小时），大鼠暴露于一个熟悉的物体X和一个形状独特的新型物体Y 5分钟。物体检测定义为用鼻子触碰或嗅探物体，通过计时器测量。坐在物体上不被视为检测（de Lima等人，2011年）。

**2.7 脑梗死体积分析**

深度麻醉后，动物被安乐死，其大脑立即取出并浸入冷盐水中（4°C）15分钟。大脑被冠状切成4片（厚度2毫米）。随后，脑切片在2% 2,3,5-三苯基四唑ium氯化物（TTC）溶液中染色，并在37°C下孵育30分钟。染色后，所有切片在标准化光照条件下进行数字摄影。使用ImageJ软件（版本1.8.0，NIH）通过计算未染色（缺血）组织相对于总脑体积的百分比来量化脑梗死体积（Khoshnazar等人，2020年）。

**2.8 生化分析**

**2.8.1 多巴胺定量**

根据Guo等人（2009年）的光谱法测定大脑中的多巴胺（DA）水平。简要来说，混合物包含100微升脑组织上清液、100微升5毫摩尔铁氯化物（FeCl?）和100微升5毫摩尔铁氰化钾（K?[Fe(CN)?]），用蒸馏水稀释至最终体积25毫升。在25°C下孵育30分钟后，通过735纳米处测量DA的吸光度。最终，根据标准曲线确定DA浓度，并归一化到总蛋白含量后，以纳克/毫克蛋白表示。

**2.8.2 抗氧化状态评估**

皮质和海马组织（150–200毫克）在0.1摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，pH值为7.4，然后在4°C下以13,600 × g离心30分钟。所得上清液用于生化分析。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性按照Genet（Genet等人，2002年）的程序进行测定。CAT的反应混合物包含10毫摩尔H?O?在50毫摩尔PBS（pH 7.0）中以及20微升上清液。CAT的吸光度在25°C下读取120秒，其酶活性定义为每分钟每毫克蛋白分解的H?O?的微摩尔数。SOD的酶活性在420纳米处通过光谱法测定120秒，并定义为抑制焦性没食子酚自动氧化所需的量。SOD测定的反应混合物包含20微升上清液，加入0.1摩尔EDTA、0.48摩尔焦性没食子酚和50毫摩尔PBS（pH = 7）。GPx活性按照Rotruck等人（1973年）的程序测定。200微升上清液加入GPx反应混合物中，其中包含0.4摩尔PBS（pH = 7.0）、0.4摩尔EDTA和50毫摩尔GSH，预先在37°C下孵育5分钟；然后加入H?O?并在37°C下孵育1分钟。GPx活性在340纳米处读取，一个单位的GPx定义为氧化1纳米摩尔GSH所需的酶量。GSH水平的测定按照Fukazawa和Tokumura的方法进行，GSH的吸光度在412纳米处读取，并以毫克GSH/克蛋白表示（Fukuzawa和Tokumurai，1976年）。GSH的反应混合物包含20微升上清液，加入1.1毫升0.25摩尔PBS（pH = 7.4）和130微升0.04% DTNB（5,5-二硫代苯甲酸），并用蒸馏水调整混合物至最终体积1.5毫升。样品蛋白含量的测定使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准（Bradford，1976年）。

**2.8.3 脂质过氧化测定**

使用Esterbauer和Cheeseman（1990年）描述的方法测定脂质过氧化的指标——丙二醛（MDA）水平。对于MDA测定，将200微升上清液加入1毫升0.67%硫代巴比妥酸和0.5毫升20%三氯乙酸中。MDA和硫代巴比妥酸之间的显色反应在535纳米处通过光谱法定量，并以微克/毫克蛋白表示。

**2.9 统计分析**

所有数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现。统计比较是使用SPSS软件（版本25.0；IBM公司）中的一元方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验进行的，用于多重比较。概率值p < 0.05被认为是统计学上显著的。

3 结果

3.1 SEM分析

图2展示了CG和GA-CG纳米粒子的扫描电子显微镜（SEM）显微照片。CG样品表现出特征性的聚集现象，并且表面光滑，这与预期一致。相比之下，GA-CG纳米粒子显示出明显的纳米级特征，并且分布相对均匀，表明GA成功整合到了CG基质中。这种形态学证据表明CG和GA成分之间的结合是有效的。

3.2 FT-IR光谱分析

纯GA的FT-IR光谱（图3）在1024、1243、1447、1544、1621、1708和3059 cm^-1波数处显示出特征性峰，以及在3400 cm^-1范围内的宽峰。这些峰分别对应于醚键和酸性C-O键的伸缩振动、O-H键的弯曲振动、单键和双键C-C键的伸缩振动、C-O键的伸缩振动、C-H键的伸缩振动，以及酚类和酸性O-H键的伸缩振动。

3.3 GA-CG纳米粒子对梗死体积的影响

如图4所示，TTC染色脑切片的定量分析显示实验组之间的梗死体积存在显著差异。与对照组相比，I/R组（p < 0.001）和GA处理组（p < 0.001）都表现出更大的未染色区域，表明有广泛的缺血损伤。值得注意的是，GA-CG纳米粒子的预处理显著减少了梗死体积（p < 0.01）。此外，GA-CG纳米粒子组的损伤明显小于单独使用GA的组（p < 0.05），这证明了该纳米制剂的增强神经保护效果。

3.4 GA-CG纳米粒子对NORT中辨别指数的影响

为了评估实验组的记忆和学习障碍，分析了NORT中的辨别指数。与对照组相比，I/R组和GA组的辨别指数显著下降（p < 0.001和p < 0.01）。GA和GA-CG纳米粒子的预处理显著提高了辨别指数（p < 0.01和p < 0.001）。此外，GA-CG组与GA组相比也有显著差异（p < 0.05）。

3.5 GA-CG纳米粒子对TST和FST中不动时间的影响

图6A和B显示，与对照组相比，I/R组（p < 0.001）和GA组（p < 0.01）在TST中的不动时间显著延长。GA在FST中的预处理以及GA-CG纳米粒子在两种测试中的预处理显著缩短了不动时间（p < 0.001）。此外，GA-CG纳米粒子组与GA组相比，不动时间的减少更为显著（p < 0.05）。

3.6 GA-CG纳米粒子对FST中游泳和攀爬时间的影响

在FST中，I/R组和GA组的游泳时间显著缩短（p < 0.001）（图7A）。攀爬时间在I/R组、GA组和GA-CG纳米粒子组中也显著减少（p < 0.001、p < 0.01和p < 0.05）（图7B）。然而，GA-CG纳米粒子的预处理显著增加了游泳和攀爬时间（p < 0.001）。这些结果表明GA-CG纳米粒子的预处理改善了I/R引起的抑郁样行为。

3.7 GA-CG纳米粒子对多巴胺能神经传递的影响

如图8A和B所示，与对照组相比，I/R组的皮质（p < 0.05）和海马组织（p < 0.001）中的多巴胺（DA）水平显著降低。此外，与对照组相比，GA组的海马DA水平也显著下降（p < 0.05）。然而，GA组的皮质（p < 0.05）和GA-CG纳米粒子组在两种组织中的DA水平显著增加（p < 0.01）。

3.8 GA-CG纳米粒子对大脑抗氧化酶活性的影响

根据表1，在I/R大鼠的皮质中，CAT（p < 0.001）、SOD（p < 0.01）和GPx（p < 0.001）的抗氧化活性与对照组相比显著下降。尽管GA组的SOD和GPx活性显著降低（p < 0.05和p < 0.001），但GA预处理显著提高了皮质组织中的CAT活性（p < 0.001）。GA-CG纳米粒子的预处理显著提高了皮质组织中CAT（p < 0.001）、SOD（p < 0.05）和GPx（p < 0.01）的活性。与GA组相比，GA-CG纳米粒子组在SOD和GPx活性的增加方面有显著差异（p < 0.05）。此外，在I/R大鼠的海马中，这些酶的活性显著降低（p < 0.01）。GA-CG纳米粒子的预处理显著提高了CAT（p < 0.05）、SOD（p < 0.01）和GPx（p < 0.05）的活性。

3.9 GA-CG纳米粒子对大脑MDA和GSH水平的影响

根据表2，I/R组的皮质和海马区的MDA水平显著升高（p < 0.01和p < 0.001）。GA-CG纳米粒子的预处理显著降低了MDA水平（p < 0.05和p < 0.01）。相反，GA组的皮质和海马区的GSH含量与对照组相比显著降低（p < 0.05和p < 0.001）。GA-CG纳米粒子的预处理显著提高了这两种组织中的GSH水平（p < 0.05）。

4 讨论

本研究表明，GA-CG纳米粒子的预处理显著减少了I/R损伤后大鼠的梗死体积和神经行为结果。这些神经保护作用与抑制皮质和海马的氧化损伤有关。GA-CG纳米粒子的治疗效果可能源于CG能够提高GA的生物利用度、溶解度和血脑屏障穿透性。SEM分析确认GA-CG纳米粒子分散均匀，表明其溶解度优于游离GA。先前的研究表明，将多酚包封在多糖中可以减轻胃肠道中的降解和氧化（Yang等人，2020年；Liang等人，2017年）。体外研究证实CG能有效保护姜黄素免受消化酶的破坏，从而防止其在胃肠道中的降解（Alavi等人，2018年）。鉴于这些保护特性，基于多糖的药物递送系统显著提高了活性化合物的生物利用度，增加了它们到达大脑的可能性（Tosi等人，2008年）。为了评估I/R引起的脑损伤，我们使用了广泛验证的BCCAO模型（Wahul等人，2018年；León-Moreno等人，2020年）。BCCAO模型被广泛接受用于诱导可重复的缺血，并能很好地模拟人类脑梗塞。许多报告表明，即使在BCCAO模型中短暂的阻塞（2分钟）也足以对海马、尾状核和新皮质造成损伤，并引发氧化应激和行为障碍（León-Moreno等人，2020年；Kimura等人，2025年）。该动物模型可以研究能量代谢、磷脂变化和组织病理学变化。此外，BCCAO模型还能有效诱导缺血和再灌注，适合测试神经保护剂，并具有长期恢复的优势（Farkas等人，2007年；Orsu和Srihari，2022年）。血流阻断导致大脑中的葡萄糖和氧气不足，引发无氧代谢、乳酸积累和能量衰竭以及氧化应激。再灌注会破坏线粒体内的氧化还原平衡，导致自由基的过度产生（Saliu等人，2021年；Kaushik等人，2020年）。作为主要的防御机制，SOD催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2。随后，H2O2通过CAT和GPx被清除，这表明这些抗氧化酶在有效清除ROS方面具有关键的协同作用（Jena等人，2023年）。值得注意的是，GSH是一种关键的内源性抗氧化剂，能够直接中和多种ROS（Higashi等人，2021年）。大量的实验证据表明，植物疗法中的抗氧化剂可以增强内源性抗氧化防御，促进ROS的清除，并恢复氧化还原平衡（Wu等人，2010年）。特别是，GA的抗氧化和神经保护特性因其预防或缓解神经系统疾病的潜力而受到高度重视（Shabani等人，2020年）。与现有研究结果一致，我们的研究证实，脑缺血/再灌注（I/R）损伤显著破坏了大鼠大脑的氧化还原平衡。值得注意的是，GA-CG纳米粒子的预处理通过调节CAT、SOD和GPx的抗氧化活性以及抑制脂质过氧化，有效减轻了氧化应激。这些结果与Zhao等人的研究（2020年）一致，他们报告称，壳聚糖包裹的GA在I/R损伤后增强SOD和GPx活性方面比游离GA更有效。考虑到海马体及其与皮层在认知记忆中的功能整合，I/R引起的海马体神经元氧化损伤直接导致了缺血后的认知障碍（Schimidt等人，2014年；Wahul等人，2018年）。我们的NORT研究发现，GA-CG纳米粒子的预处理显著减轻了I/R介导的记忆功能障碍，这从显著改善的区分指数中可以看出。先前的研究表明，GA在小鼠东莨菪碱诱导的遗忘模型中表现出抗遗忘作用，主要通过其抗氧化活性实现。值得注意的是，将GA封装在Tween-80包覆的壳聚糖纳米粒子中进一步增强了这种神经保护效果，可能是通过提高大脑的生物利用度（Nagpal等人，2013年）。支持这一观点的是，体内生物分布研究显示，封装在聚己内酯接枝的寡卡拉胶中的姜黄素在大脑中的浓度显著升高，表明基于CG的递送系统可以有效促进生物活性化合物穿过血脑屏障（Youssouf等人，2019年）。累积的研究结果表明，线粒体功能障碍引起的氧化应激在I/R损伤后的细胞凋亡中起主要作用。除了直接的神经毒性作用外，ROS还激活了多种细胞死亡途径（Kaushik等人，2020年；Chan，2001年）。在本研究中，我们通过TTC染色测量的梗死体积来量化细胞损伤。我们的发现表明，GA-CG纳米粒子的预处理显著减轻了脑梗死，表现为I/R损伤大鼠冠状脑切片中未染色（白色）区域的显著减少。先前的研究表明，壳聚糖包裹的GA在减轻I/R损伤后的脑梗死方面比游离GA具有更强的神经保护作用（Zhao等人，2020年）。单胺类神经递质，尤其是多巴胺（DA），被认为在调节情绪行为中起关键作用（Feng等人，2014年）。缺血引起的多巴胺水平下降促进了中风后的抑郁发生（Medeiros等人，2020年）。这种减少可能与多巴胺能神经元的退化有关，这些神经元对氧化应激非常敏感（Kaushik等人，2020年）。此外，脂质过氧化会破坏细胞膜的完整性，导致DA的外流（Fan等人，2021年）。我们的结果表明，I/R损伤显著降低了皮层和海马体的DA浓度，而GA-CG纳米粒子的预处理有效恢复了多巴胺能的平衡。中风后的抑郁行为通过FST和TST进行评估。GA-CG纳米粒子的预处理显著缩短了两种行为范式中的不动时间，同时增加了FST中的主动应对行为（攀爬和游泳），表明抑郁样症状得到了缓解。这些发现与现有证据一致，证明GA能够调节多巴胺能神经传递并发挥抗抑郁作用（Nagpal等人，2012年；Can等人，2017年）。先前的研究表明，封装在介孔二氧化硅纳米粒子中的GA具有抗抑郁特性，这一点通过使用利血平诱导的抑郁模型在FST中观察到的不动时间减少得到了证实（Fahmy等人，2022年）。观察到的抗抑郁效果与SOD活性的增强、GSH和多巴胺水平的升高以及脂质过氧化的减少（表现为MDA的降低）相关。这些发现共同表明，GA-CG纳米粒子的治疗效果源于CG介导的GA在大脑组织中的生物利用度的提高。

5. 前景
纳米技术的应用已成为实现可控药物释放和增强中枢神经系统（CNS）靶向效率的有希望的策略。我们的研究表明，与游离GA相比，GA-CG纳米粒子在对抗I/R损伤方面提供了更强的神经保护作用，主要是通过减轻氧化应激介导的损伤。虽然这些结果突显了纳米制剂的治疗潜力，但需要在更多模型和更长的时间内进行进一步研究，以确认其在脑血管和神经退行性疾病中的转化潜力。此外，还应研究长期安全性、更广泛的剂量范围和互补的分子途径，以评估其临床应用性。

作者贡献
Akbar Hajizadeh Moghaddam：撰写、审稿和编辑、监督、资金获取。
Parisa Jahani Bahnamiri：项目管理、撰写-原始草案准备、方法学。
Sedigheh Khanjani Jelodar：正式分析、监督、验证。
Zohre Fendereski Jaz：方法学、资源。
Parisa Nasiriansari：方法学、资源。
Vahid Hasantabar：方法学、正式分析。

致谢
作者衷心感谢伊朗马赞德兰大学（Babolsar）理学院动物科学系提供的机构支持。

资金
作者没有需要报告的内容。

伦理声明
所有动物实验均获得了马赞德兰大学动物伦理委员会的批准（批准代码：IR.UMZ.REC.1398.014）。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。由于隐私或伦理限制，这些数据不对外公开。