灵芝-8（LZ-8）抗炎活性的全面评估：体外实验及类风湿性关节炎动物模型研究

《Food Science & Nutrition》：Comprehensive Evaluation of the Anti-Inflammatory Activity of Ling-Zhi-8 (LZ-8) In Vitro and a Rheumatoid Arthritis Animal Model

　　摘要

类风湿性关节炎（RA）是一种由自身免疫反应引起的炎症性疾病。只有免疫调节剂或相关药物能够减缓RA的进展。灵芝-8（LZ-8）是从灵芝（Ganoderma lucidum）中提取的一种小分子蛋白质，具有抑制炎症的作用。本研究旨在探讨LZ-8在RA中的抗炎功能和免疫调节活性。通过使用大鼠RA动物模型和细胞模型来检验LZ-8抑制关节炎的抗炎效果。实验结果表明，LZ-8能够抑制白细胞介素（IL）-6的产生以及脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中环氧化酶-2（COX-2）的过度表达。这种抑制作用可能与LZ-8对MyD88介导的Jun N末端激酶-丝裂原活化蛋白激酶（JNK）信号通路的潜在抑制作用有关。给予较低剂量（3.125 mg/kg）的LZ-8注射9天后，RA动物模型中足底的炎症和肿胀有所减轻。LZ-8低剂量组（3.125 mg/kg）大鼠肢体趾部的病理损伤相对较轻。比较组织学病变发现，LZ-8高剂量组显示出滑膜增生减少，且三种剂量的LZ-8均减轻了关节软骨的损伤。此外，还观察到脾脏重量减轻以及CD4+IL-4+、CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+和CD4+CD25+ T细胞免疫群体的变化。总之，本研究表明LZ-8能够在CFA（完全弗氏佐剂）诱导的关节炎模型中减弱炎症和免疫反应，支持其作为治疗关节炎相关炎症疾病的免疫调节剂的潜力。

缩写

CFA：完全弗氏佐剂
CIA：胶原诱导的关节炎
COX-2：环氧化酶-2
DCs：树突状细胞
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基
ELISA：酶联免疫吸附测定
ERK：细胞外信号调节激酶
FBS：胎牛血清
FDR：假发现率
H&E：苏木精和伊红
IACUC：机构动物护理和使用委员会
IFN：干扰素
IL：白细胞介素
IRAK：IL-1受体相关激酶
JNK：Jun N末端激酶
LPS：脂多糖
LZ-8：灵芝-8
MAPK：丝裂原活化蛋白激酶
MMP-13：基质金属蛋白酶-13
NF-κB：核因子κB
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PVDF：聚偏二氟乙烯
RA：类风湿性关节炎
rLZ-8：重组灵芝-8
STAT3：信号转导子和转录激活因子3
TLR：Toll样受体
TNF：肿瘤坏死因子
TRAF6：TNF受体相关因子6

1 引言

类风湿性关节炎（RA）是最常见的慢性炎症性疾病之一，常伴有自身抗体，并在病情最严重的患者中导致关节损伤和死亡率增加（Smolen等人，2016年）。当自身抗体滞留在关节的滑膜上时，白细胞会通过炎症反应清除这些自身免疫复合物。这种持续的炎症反应也是RA导致关节损伤的原因（McInnes和Schett，2011年）。RA滑膜炎的炎症反应来源于先天免疫细胞（树突状细胞[DCs]、单核细胞）和适应性免疫细胞（辅助T细胞-1、辅助T细胞-17和B细胞）。这些细胞和免疫复合物会在关节区域引发强烈的炎症反应，导致关节组织破坏（Liu等人，2013年；McInnes和Schett，2011年；Smolen等人，2007年）。灵芝-8（LZ-8）是从灵芝（Reishi蘑菇）中提取的一种常用的免疫调节蛋白，于1989年首次被发现并进行了表征（Kino等人，1989年）。LZ-8由110个氨基酸残基组成，大部分形成一个分子量约为24 kDa的同二聚体多肽（Huang等人，2014年；Yang等人，2014年）。LZ-8的每个单体包含一个N端α螺旋结构域和一个C端β折叠结构域，两者通过一个灵活的连接区相连（Huang等人，2014年）。LZ-8对免疫系统具有复杂的作用。在哮喘小鼠模型中，LZ-8能够调节信号转导子和转录激活因子3（STAT3）的激活，从而抑制Th17细胞的发育并减轻炎症（Liu等人，2020年）。灵芝的干提取物可以调节T淋巴细胞的功能，增加白细胞介素（IL）-10和肿瘤生长因子-β的表达，并促进Th2细胞的比例，表明LZ-8可能在调节Th1/Th2平衡和抗炎反应中发挥作用（Iser-Bem等人，2024年）。除了调节炎症反应外，LZ-8还能调节巨噬细胞中的免疫反应（Huang等人，2014年）。LZ-8激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的多个组分，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、Jun N末端激酶（JNK）和p38，从而促进DCs的成熟和激活，使DCs表现出更高水平的共刺激分子（如CD80、CD83、CD86）和细胞因子（如肿瘤坏死因子[TNF]-α、IL-6、IL-2、干扰素[IFN]-γ），从而调节免疫系统的效应（Lin等人，2009年）。LZ-8在细胞和动物实验中均具有抗炎作用。接受LZ-8治疗的非肥胖糖尿病小鼠没有出现糖尿病的累积发病率，而未治疗的小鼠发病率高达70%。LZ-8治疗还改变了T细胞亚群，表明LZ-8具有免疫调节作用（Kino等人，1990年）。在哮喘小鼠模型中，重组灵芝-8（rLZ-8）显著减少了肺部和炎症细胞的浸润。它通过降低IL-17水平并增加IL-10水平，以及向调节性T细胞转变来调节免疫反应。这些由rLZ-8调节的作用与STAT3和核因子κB信号通路的抑制有关（Liu等人，2020年）。在动物研究中，LZ-8通过增强调节性T细胞的功能来调节免疫反应，这些细胞在控制过度炎症中起着关键作用（Xiao等人，2020年）。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的结构成分，用于实验模型中模拟与RA相关的先天免疫激活和炎症反应（Akira和Takeda，2004年）。LPS主要通过免疫细胞上的Toll样受体4（TLR4）发出信号，激活NF-κB通路，促进促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达（Liu等人，2017年）。这些细胞因子也是RA中滑膜炎症的重要介质（Akira和Takeda，2004年；Liu等人，2017年）。在动物研究中，无论是全身还是关节内给予LPS都会加剧胶原诱导的关节炎（CIA），这是一种常见的RA模型，表现为白细胞浸润增加、滑膜增厚和骨侵蚀。因此，我们假设抗炎调节剂LZ-8可能有效缓解细胞和CFA（完全弗氏佐剂）诱导的单关节炎大鼠模型中的炎症反应。我们评估了LZ-8对免疫细胞的抗炎作用及其在这种佐剂诱导的关节炎模型中的抗炎特性，以研究其缓解类似关节炎的关节炎症的能力，这与CIA等全身模型不同。

2 材料与方法

2.1 细胞

小鼠RAW264.7巨噬细胞和人类软骨肉瘤SW1353细胞购自台湾新竹食品工业研究开发研究所（FIRDI）的生物资源收集与研究中心。细胞培养方案遵循证书提供的说明。简而言之，RAW264.7细胞在含有10%（v/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在37°C、5% CO2的培养箱中维持（Huang等人，2014年）。人类软骨肉瘤SW1353细胞在含有2 mM L-谷氨酰胺和10%（v/v）FBS的Leibovitz L-15培养基中培养，并在37°C的培养箱中培养。

2.2 细胞活力和炎症反应

纯重组LZ-8购自台湾台北的Yeastern Biotech公司，并溶解在无菌水中（10 μg/mL）（Lin等人，2011年）。脂多糖（LPS）由Escherichia coli O26: B6和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物制备，购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical公司。小鼠IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的eBioscience公司（目录号#88-7064-88）。为了评估LZ-8对细胞活力的影响，将RAW264.7细胞（1 × 10^5细胞/mL）培养在96孔培养板上；在37°C的培养箱中孵育2小时；更换为含有1、5、10和25 μg/mL LZ-8的新鲜DMEM；并在37°C下孵育24小时。人类软骨肉瘤SW1353细胞的处理方法如前所述，但使用含有0.25、0.5、1.0和2.5 μg/mL LZ-8的新鲜Leibovitz L-15培养基。这两个实验都重复三次，每个样本进行四次技术重复。本研究中使用MTT测定法评估细胞增殖，并进行了台盼蓝染色排除实验。使用日本东京的Nikon Eclipse TS100显微镜拍摄图像。为了研究LZ-8对细胞炎症介质的影响，将RAW264.7细胞用0、5或10 μg/mL的LZ-8处理24小时，然后进行24小时的LPS处理（0.1 μg/mL）。根据制造商的说明，使用商业试剂盒检测细胞上清液中的IL-6浓度。使用Bio-Rad Laboratories公司（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）的裂解缓冲液收集并裂解RAW264.7细胞。从细胞裂解物中提取20微克蛋白质，通过10%（w/v）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿）。PVDF膜与抗环氧化酶-2（COX-2）抗体（1:1000稀释；目录号#610204，BD Biosciences，美国新泽西州弗兰克林莱克斯）、抗基质金属蛋白酶-13（MMP-13）抗体（1:1000稀释；目录号#ab315267，Abcam，英国剑桥）或抗MyD88抗体（1:1000稀释；目录号#mAb #50010，Cell Signaling，美国马萨诸塞州贝弗利）杂交，然后与碱性磷酸酶标记的抗大鼠或抗兔IgG（1:5000稀释；目录号#AP136A或AP132A，Sigma，美国密苏里州圣路易斯）反应。使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四唑底物（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）可视化目标COX-2蛋白。蛋白质信号通过密度计（Image Lab，Bio-Rad）进行测量和定量。

2.3 SW1353细胞的时间进程和MAPK蛋白磷酸化

人类软骨肉瘤SW1353细胞以2.25 × 10^5细胞/孔的密度接种在6孔板上。细胞培养24小时后，去除培养基。接着加入1 mL含有LZ-8的新鲜培养基。再培养24小时后，再次去除细胞培养基，并向每个孔中加入含有0.5 ng/mL IL-1β的无血清培养基。细胞分别培养0、15、30和60分钟。使用裂解缓冲液裂解细胞以收集细胞蛋白质，并通过Western blotting进行分析。

2.4 动物研究和实验设计

从台湾宜兰的BioLASCO Taiwan有限公司购买了33只8周大的雄性Sprague–Dawley大鼠（体重200–250克）。大鼠生活在12小时光照/黑暗周期、23°C–25°C和70%–75%相对湿度的环境中。提供常规实验室饮食（PANLAB SL，西班牙巴塞罗那）和淡水。所有程序均获得了农业技术研究所（IACUC，批准编号105131）和元培医科大学IACUC（批准编号10504）的批准。大鼠被分为六组（A–F）。A组（三只大鼠）作为空白对照组，既不接受诱导也不接受处理；选择这个最小的样本量是为了遵守动物福利的3R（替代、减少、优化）原则，同时建立正常基线。B、C、D、E和F组每组六只大鼠，根据先验功效计算，为了达到>80%的统计功效，通过右踝关节内注射0.1 mL CFA在动物研究第0天（D0）诱导炎症性关节炎。在D14–D22天，B组和C组的大鼠每天通过关节内注射0.1 mL无菌水和泼尼松龙（2.5 mg/kg，溶解在无菌水中；TaFong Pharmaceutical Co. LTD，DOI DOH制造编号010886）作为载体和阳性对照。D、E和F组的大鼠分别通过关节内注射0.1 mL含有LZ-8（溶解在无菌水中）的溶液，剂量分别为12.5、6.25和3.125 mg/kg，每天一次。选择这些剂量的依据是我们的初步研究和关于LZ-8体内有效剂量的先前文献。我们将12.5 mg/kg设定为最大剂量，以评估潜在的剂量依赖性治疗效果，并监测任何高剂量引起的免疫刺激效应或毒性。所有大鼠在D23天被处死。在D6天和D13–D23天，评估所有大鼠右后肢的体重、爪厚度、踝关节周长和关节炎评分。通过用苏木精和伊红（H&E）和甲苯胺蓝染色病理切片来评估大鼠右踝关节的病理变化。还评估了脾脏重量和脾细胞群体。IACUC批准了农业技术研究所动物技术实验室的动物实验（动物使用协议批准书，IACUC编号105131），并且动物护理是按照台湾农业委员会的“实验室动物护理和使用指南”进行的。

2.5 大鼠的脾脏重量和脾细胞群体

大鼠被安乐死后，立即称量其脾脏重量，将其转移到装有冰块的层流罩中，切成小块，并放入无菌一次性注射器中。通过用注射器活塞挤压脾脏并使其通过尼龙网来研磨脾脏。脾细胞被悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。为了进行细胞内细胞因子染色（IL-4、IL-17和IFN-γ），分离出的脾细胞（1×10^6细胞/毫升）在存在蛋白质转运抑制剂（Brefeldin A，10微克/毫升）的情况下，用佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA，50纳克/毫升）和离子霉素（1微克/毫升）预处理4-6小时，温度为37摄氏度。处理和洗涤后，首先在黑暗中用荧光异硫氰酸酯标记的抗大鼠CD4抗体（克隆OX35，目录编号11-0040-81，eBioscience，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和PE标记的抗大鼠CD25抗体（克隆OX39，目录编号MA1-80772，Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行表面染色。随后，根据制造商的方案，使用商业化的细胞内固定和渗透缓冲液套装（eBioscience，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）对细胞进行固定和渗透。渗透后的细胞再用细胞内抗体进行染色，包括PE标记的抗大鼠IL-4抗体（克隆OX81，目录编号555082，BD Bioscience）、PerCP Cyanine5.5标记的抗大鼠IL-17抗体（克隆eBio17B7，目录编号45-7177-82，eBioscience，美国）和PerCP Cyanine5.5标记的抗大鼠FOXP3抗体（克隆FJK-16S，目录编号45-5773-82，eBioscience）。同时准备适当的同型对照和荧光减去一对照，以确定精确的门控边界并区分阳性染色和背景荧光。门控策略首先基于前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）特征识别活淋巴细胞群体，然后对CD4+群体进行门控，以确定特定细胞内细胞因子或转录因子表达亚群的频率。所有标记的细胞群体都使用流式细胞术（BD FACSCalibur，Becton, Dickinson and Company，美国新泽西州富兰克林湖）进行区分，并使用WinMDI（版本2.9）软件处理数据。

2.6 统计分析

对于体内研究，计算了每个处理组的样本量（n=6），以确保在5%的显著性水平（α=0.05）下至少有80%的统计功效，以检测主要的临床和组织学评分中的显著差异。最初使用单因素方差分析（ANOVA）对多个组进行统计比较，然后进行适当的后续测试。为了考虑由于同时测试多个终点（具体为脾脏重量、IL-6水平、MMP-13、COX-2以及四种T细胞亚群（CD4+ IL-4+、CD4+ IL-17+、CD4+ IFN-γ+和CD4+ CD25+ FOXP3+）而增加的第一类错误风险，应用了Benjamini-Hochberg程序来控制多个终点的假发现率（FDR）。FDR调整后的p<0.05被认为是统计学上显著的。

3 结果

3.1 LZ-8对细胞活力和炎症反应的影响

为了确定LZ-8是否对小鼠RAW264.7巨噬细胞或人类软骨肉瘤SW1353细胞具有细胞毒性，在培养基中添加了不同浓度的LZ-8。当RAW264.7细胞与LZ-8浓度<10微克/毫升孵育时，没有观察到细胞毒性效应（图1A）。同样，当培养基中的LZ-8浓度<0.5微克/毫升时，也没有观察到SW1353细胞的显著负面影响（图1B）。图1：在图查看器中打开

LZ-8对RAW264.7巨噬细胞（A）和软骨肉瘤SW1353（B）的细胞活力的影响。RAW264.7和SW1353细胞用LZ-8处理24小时。数据以平均值±标准差（n=4，技术重复）表示，并通过单因素方差分析进行分析。不同的字母表示两组之间的显著差异。为了检查LZ-8是否通过调节炎症介质的产生和表达来影响免疫反应，RAW264.7细胞先用固定浓度的LZ-8（5或10微克/毫升）预处理24小时，然后用LPS（0.1微克/毫升）刺激24小时。图2A和B的结果显示，与未经处理的对照组相比，LPS显著增强了IL-6的合成和COX-2的过表达。LZ-8预处理显著抑制了IL-6和COX-2的水平，分别降低了91%和63%（图2A和B）。除了在LPS刺激前用LZ-8预处理巨噬细胞外，我们还研究了当RAW264.7细胞与LZ-8共同培养24小时时，LZ-8是否对炎症反应有类似的抑制作用。我们的结果表明，当LZ-8的浓度>5微克/毫升时，LZ-8显著减少了LPS刺激的IL-6产生和COX-2表达（图2A和B）。

3.2 LZ-8对MyD88和MAPK激活的影响

为了确定LZ-8抑制巨噬细胞中IL-6和COX-2水平的机制，我们检查了LZ-8对RAW264.7细胞中MyD88表达的影响。与阴性对照相比，LPS刺激后MyD88的水平增加（图3A）。然而，用不同剂量的LZ-8预处理或共培养巨噬细胞显著抑制了LPS刺激的MyD88表达，分别降低了48%和42%（图3）。图3：在图查看器中打开

LZ-8对RAW264.7细胞中LPS诱导的MyD88表达水平（A）和LPS诱导的phospho-MAPK蛋白水平（B）的影响。RAW264.7细胞用LZ-8（0.1微克/毫升）或IL-1β（0.5纳克/毫升）处理24小时。IL-6浓度（A）通过酶联免疫吸附测定法在上清液中测量。COX-2（B）和MMP-13蛋白（C）的量使用β-Actin作为加载对照进行定量，并相对于这些对照进行表达。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示（n=3，生物重复），并通过单因素方差分析进行分析。p值使用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）程序进行了多重比较调整。不共享相同字母的值在p<0.05时显著不同。我们确定了LZ-8是否通过抑制基质中的MMP-13表达来调节炎症性软骨细胞。图2C显示，与未预处理相比，LZ-8预处理显著降低了MMP-13的表达，降低了多达45%。然而，与LZ-8共同处理并没有这种抑制效果。

3.3 LZ-8对MyD88和MAPK激活的影响

为了确定LZ-8抑制巨噬细胞中IL-6和COX-2水平的机制，我们检查了LZ-8对RAW264.7细胞中MyD88表达的影响。与阴性对照相比，LPS刺激后MyD88的水平增加（图3A）。然而，用不同剂量的LZ-8预处理或共培养巨噬细胞显著抑制了LPS刺激的MyD88表达，分别降低了48%和42%（图3）。图3：在图查看器中打开

LZ-8对RAW264.7细胞中LPS诱导的MyD88表达水平和LPS诱导的phospho-MAPK蛋白水平的影响。RAW264.7细胞用LZ-8处理24小时，然后用LPS（0.1微克/毫升）刺激24小时。MyD88蛋白（A）和p-p38、p-JNK、p-ERK（B）使用β-actin作为加载对照进行定量，并相对于该对照进行表达。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示（n=3，生物重复），并通过单因素方差分析进行分析。不共享相同字母的值在p<0.05时显著不同。LPS通过激活TLR/MyD88介导的MAPK信号通路来刺激炎症反应（Park等人，2009年）。我们进一步研究了LZ-8使MAPK失活是否在调节促炎介质中起核心作用。图3B显示，当LZ-8浓度为10微克/毫升时，LPS刺激的RAW264.7细胞中磷酸化的p38、JNK和ERK显著减少。然而，LZ-8对p38和ERK的激活仅有轻微减弱或没有影响。此外，Li等人最近报告称，MAPK信号的激活与软骨肉瘤细胞中的MMP过表达密切相关（Zeng等人，2017年）。因此，我们研究了LZ-8是否可以减少MAPK介导的炎症反应。图4A显示了SW1353细胞中IL-1β刺激的MAPK激活的时间过程分析。基于这些结果，我们选择30分钟作为MAPK激活的最佳时间。图4B的结果显示，与阴性对照相比，SW1353细胞中磷酸化的p38、JNK和ERK的水平在IL-1β刺激后增加。用LZ-8预处理细胞显著降低了pJNK的水平，降低了多达50%。然而，p38和ERK的磷酸化水平仅略有减少；然而，这些效应在统计学上并不显著。

3.4 各组大鼠的临床观察

在D6天和D13-D23天对大鼠进行了称重。将体重与治疗第一天（D14天）的体重进行比较。所有治疗组（B-F组）的体重在治疗后的3天（D15-D17天）内略有下降，然后缓慢恢复正常。在治疗期间（D14-D23天），各组之间的体重没有显著差异（p>0.05）（图5A）。

3.5 大鼠右后肢的炎症评估

评估了右后肢的爪厚和踝周长以确定炎症情况。大鼠右后肢爪厚和踝周长的每日变化率（%）是基于与治疗第一天（D14天）的比较。每个治疗组（B-F组）在治疗期间（D14-D23天）右后肢爪厚的变化没有显著差异。阳性对照组（C组）和给予100%纯LZ-8 12.5毫克/公斤的组（D组）的爪厚减少（图5B）。另一个炎症参数是每个测试组大鼠右后踝周长的每日变化（%），在治疗期间的D14天到D23天进行了比较。用泼尼松龙治疗的阳性对照组（C组）右后踝的肿胀显著减轻。阳性对照组（C组）右后肢的踝周长显著减少（图5C）。

3.6 大鼠右后踝的组织学评估

根据Wang等人（2005年）描述的方法评估了RA的病理评分：评分0表示正常；评分1表示病理面积<1/2；评分2表示病理面积≥1/2（图6A）。评估了包括滑膜增生、炎症细胞浸润和软骨侵蚀在内的病理变化。使用每只大鼠的三次病变评估的总分来比较各组大鼠之间的病理变化。在治疗期间（D14-D23天），E组（LZ-8 6.25毫克/公斤）和F组（LZ-8 3.125毫克/公斤）的RA病理评分低于载体组（B组），并且在D22天F组的评分显著降低。LZ-8 3.125毫克/公斤组的大鼠在治疗期间的RA病理评分最低（图6B），右后肢的胫距关节病理损伤也最低。图6：在图示查看器或PowerPoint中打开

通过类风湿性关节炎病理评分来评估大鼠右踝关节的病理变化。(A) 使用苏木精和伊红染色（上图）以及甲苯胺蓝染色（下图）显示右后肢胫距关节纵向切面的病理病变。原始放大倍数为40倍。滑膜增生、炎症细胞浸润和软骨侵蚀的评分列在表格中。(B) 每组大鼠的类风湿性关节炎总评分的每日评估。治疗组（D、E、F组）的类风湿性关节炎病理评分与溶剂对照组（B组）进行了每日比较（*p<0.05）。

3.6 大鼠的脾脏重量和脾细胞群体

脾脏中的炎症反应增加了体重，表明存在全身性炎症反应。在D、E和F组中，脾脏重量与治疗剂量呈正相关（图7）。空白对照组（A组）、阳性对照组（C组）和3.125 mg/kg LZ-8组（F组）的脾脏重量显著低于B组（溶剂对照组）。相比之下，F组的脾脏重量与A组和C组没有显著差异。D组（LZ-8，12.5 mg/kg）的大鼠脾脏重量显著高于C组（阳性对照组，泼尼松，2.5 mg/kg）的大鼠。E组（6.25 mg/kg）的大鼠与B组和C组之间的脾脏重量没有显著差异，但这两个治疗组的炎症程度不同。这表明C组的大鼠在泼尼松治疗后的第14天到第23天恢复了接近正常的脾脏重量。D组（LZ-8，12.5 mg/kg）的大鼠从第14天到第23天的炎症减少情况与C组相似。

3.7 大鼠的脾细胞群体

通过检测脾细胞上特定细胞标记物的抗体来确定脾细胞群体。测试并鉴定了大鼠脾细胞中的CD4+、CD25+和FoxP3+细胞群体（图8A）。B组大鼠脾细胞中CD4+IL-4+细胞的百分比显著高于C组大鼠以及E组和F组大鼠（图8B）。B组大鼠脾细胞中CD4+IL-17+和CD4+IFN-γ+细胞的百分比高于C组、D组、E组和F组大鼠（图8C,D）。D组大鼠脾细胞中CD4+CD25+FoxP3+细胞的百分比高于B组、C组和F组大鼠（图8E）。

图7：各组大鼠的脾脏重量。数据以平均值±标准差表示（n=3–6）。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估统计显著性。p值使用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）程序进行了多重比较调整。*p<0.05和**p<0.01表示与溶剂对照组（B组）相比有显著差异。

4 讨论

本研究的主要发现是LZ-8在CFA诱导的大鼠类风湿性关节炎模型中表现出抗炎作用，通过抑制促炎介质的产生和表达来实现，这与小鼠巨噬细胞和人软骨细胞中JNK-MAPK信号通路的下调有关，从而产生抗炎效果。在RAW264.7细胞中，我们证明LZ-8显著抑制了LPS刺激的促炎IL-6的产生并下调了COX-2的表达。这些结果与先前使用LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬细胞、BV-2小胶质细胞和四氯化碳诱导的大鼠模型中报告的LZ-8的抗炎特性一致（Huang等人，2014年）。这些结果与先前关于类风湿性关节炎抗炎作用的研究结果相似（H. Liu等人，2020年）。在研究LZ-8的免疫调节机制时，我们的结果显示LZ-8治疗与MyD88蛋白丰度的减少和JNK-MAPK磷酸化的降低有关。MyD88作为TLR信号传导的关键适配蛋白，在LPS刺激的炎症发展中起着关键作用（Deguine和Barton，2014年）。例如，LPS与TLR4结合后，MyD88会自发招募并激活一系列下游激酶，包括IL-1受体相关激酶-4（IRAK-4）、IRAK-1和TNF受体相关因子6（TRAF6），随后导致MAPK和NF-κB细胞信号通路的激活，触发多种炎症介质的过度表达和产生（J. Chen等人，2020年）。本研究的结果表明LZ-8可能对关节炎症也有类似的作用。LZ-8调节MAPK信号通路，包括p38、JNK和ERK，从而影响免疫细胞功能，并可能对关节炎等炎症性疾病产生治疗效果（Lin等人，2009年）。PI3K信号通路在类风湿性关节炎的发病机制中起着重要作用（Gonzalez-Lopez de Turiso等人，2012年）。我们的结果还证实LZ-8通过MAPK通路发挥抗炎作用，减少了关节炎相关的病变，这一点通过病理变化得到了证实。虽然这些结果表明LZ-8具有免疫调节特性，但关于其直接用于开发类风湿性关节炎相关免疫调节营养素或补充剂的任何声明都需谨慎对待。在建立其真正的治疗意义之前，仍需要包括详细疗效、毒理学和免疫原性数据在内的全面临床前研究。在类风湿性关节炎等慢性全身性炎症疾病中，许多免疫细胞，包括Th1、Th2、Tregs、自然杀伤细胞甚至B细胞都参与炎症反应（Weyand和Goronzy，2021年）。Th1细胞释放炎症细胞因子（如IFN-γ、TNF-α和IL-1β）以促进炎症的发生。然而，Th2细胞产生的IL-4可以减弱类风湿性关节炎中的抗炎细胞因子反应（Ruterbusch等人，2020年）。在本研究中，使用流式细胞术监测了LZ-8处理大鼠脾脏中的Th1、Th2和Treg细胞。我们发现，接受泼尼松治疗（C组）和LZ-8治疗（D-F组）的大鼠脾脏中的Th1（CD4+IFN-γ+）和Th2（CD4+IL-4+）细胞显著低于诱导大鼠（B组）。诱导大鼠和治疗后大鼠中的Tregs（CD4+CD25+FOXP3+）没有差异。脾细胞中Th1、Th2和Treg细胞的特征与胶原诱导的关节炎耐受性动物模型中观察到的相似（Yuan等人，2024年）。炎症的抑制可能与CD4+ T细胞平衡的调节有关（Yuan等人，2024年）。LZ-8通过增强淋巴细胞和巨噬细胞中TNF-α的表达或产生来激活免疫反应（Huang等人，2014年）。这种抗炎FIP通过减少LPS激活的BV-2小胶质细胞中的TLR4介导的NF-κB信号传导来抑制炎症反应（Chen等人，2017年）。类似地，据报道Trametes versicolor或Hericium erinaceus的FIPs可以抑制LPS激活的巨噬细胞并抑制炎症细胞因子的产生（Diling等人，2017年）。在rLZ-8处理的大鼠中观察到破骨细胞分化的抑制和凋亡的促进，从而减少了骨吸收。这种效应可能是通过调节RANK-TRAF6-JNK信号通路来实现的，该通路有可能防止类风湿性关节炎中常见的骨破坏（Ruan等人，2019年）。在糖皮质激素诱导的骨质疏松症大鼠模型中，rLZ-8处理的大鼠显示出对小梁骨形态的骨丢失预防作用，这一点通过H&E染色观察到。本研究显示LZ-8的抗炎作用涉及骨骼及相关组织（Yang等人，2020年）。我们的病理检查显示，接受LZ-8治疗的大鼠右后肢胫距关节的病理损伤减少，表现为病理评分降低。这些大鼠还表现出轻微的炎症，表现为右后踝厚度和周长的轻微变化，表明LZ-8对类风湿性关节炎引起的关节损伤具有抗炎作用。我们总结了我们的发现，证明LZ-8在CFA诱导的单关节炎大鼠模型中减弱了炎症和免疫反应，并在RAW264.7巨噬细胞中观察到了抗炎效果。LZ-8抑制了促炎反应并显著降低了MAPK的激活，这与关节炎相关关节病理的改善有关，这一点通过组织病理变化得到了证实。此外，LZ-8抑制了淋巴细胞和巨噬细胞产生的炎症细胞因子，可能减少了炎症性关节炎中常见的骨吸收和关节破坏。关于剂量-反应关系，体内实验显示最低剂量的LZ-8（3.125 mg/kg）在改善临床和组织学评分方面优于较高剂量（12.5和6.25 mg/kg）。LZ-8剂量与脾脏重量之间存在正相关，高剂量组（12.5 mg/kg）的脾脏明显更重。这种剂量依赖性的疗效和脾肿大表明LZ-8具有复杂的双重免疫调节特性。在先前的研究中（Lin等人，2009年；Zeng等人，2017年），LZ-8表现出抗炎作用，但也可以激活MAPK信号通路，促进树突状细胞的成熟和活化，上调共刺激分子和促炎细胞因子如TNF-α和IL-6。我们假设在较高剂量下，LZ-8的免疫刺激特性占主导地位，导致全身性免疫过度激活，表现为脾脏重量增加和潜在的脱靶毒性，最终抵消了其在关节中的局部抗炎益处。相反，较低剂量（3.125 mg/kg）似乎实现了最佳的治疗窗口，有效降低了炎症信号传导而不引发过度的、适得其反的免疫刺激。本研究的显著局限性在于LZ-8精确调节的分子靶点和信号通路尚未完全明确。具体来说，由于没有进行功能丧失（例如MyD88敲低/敲除）或药理学（例如SP600125对JNK）实验，因此无法确定LZ-8与MyD88-JNK信号通路之间的直接因果关系。T细胞调节和长期免疫反应的详细机制需要进一步研究。需要进一步的研究来明确LZ-8的免疫调节作用涉及的具体受体、细胞内通路和免疫细胞相互作用。例如，对接受LZ-8处理的T细胞和巨噬细胞的转录组分析有助于识别与免疫调节相关的差异表达基因和通路。此外，研究模式识别受体和T细胞受体（包括TLR-和MyD88相关信号）下游的信号通路可能提供进一步的机制见解。纵向的体内研究对于评估LZ-8的持续免疫调节效果至关重要，这些研究将有助于了解其持久性和治疗潜力。因为我们的研究使用了CFA诱导的单关节炎模型而不是全身性CIA模型，因此将这些发现直接应用于人类类风湿性关节炎需要谨慎。因此，未来的广泛研究将需要关注LZ-8的全面疗效、脱靶毒理学和体内免疫原性，以评估其在炎症性关节炎模型中的持久性和作用范围。

5 结论

总之，LZ-8通过调节免疫细胞和抑制炎症，至少部分地显著减少了CFA诱导的炎症反应。然而，免疫细胞相互作用的精确机制需要进一步研究。

作者贡献

Shao-Wen Hung：方法学、研究、资源获取、数据管理、初稿撰写、可视化、资金筹集。Cheng-Yao Yang：概念化、方法学、验证、数据管理、审稿和编辑、项目管理、资金筹集。Po-Jung Tsai：可视化、正式分析、研究、初稿撰写、验证。Lu-Te Chuang：概念化、方法学、验证、资源获取、审稿和编辑、监督、项目管理、资金筹集。

致谢

作者感谢Yun-Shan Ho在蛋白质分析方面的技术支持，以及Ruei-Chen Hung在动物实验方面的协助。

资金支持

本研究得到了科技部的资助（项目编号NSC 106-2320-B-264-001-）和National Chung Hsing大学的资助（项目编号108GP04376），对此我们表示感谢。伦理声明

本研究遵循了农业技术研究院（批准编号105131）和元培医科大学IACUC（批准编号10504）批准的动物使用协议进行。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

数据获取声明

支持本研究结果的数据可应合理要求向相应作者索取。