修剪切口的位置会影响葡萄藤修剪伤口对Eutypa lata病原菌及自然枯萎病的易感性

《AUSTRALIAN JOURNAL OF GRAPE AND WINE RESEARCH》：Pruning Cut Position Affects the Susceptibility of Grapevine Pruning Wounds to Eutypa lata and Natural Dieback

　　**摘要**

**背景与目的**
葡萄藤的修剪伤口是导致主干病害（如Eutypa lata）的主要感染途径，Eutypa lata是全球性毁灭性疾病Eutypa枯萎病的致病菌。最近流行的修剪技术声称能够影响葡萄藤的病理和生理状况。本研究探讨了修剪切口位置是否会影响伤口对E. lata的易感性以及与自然枯萎病相关的木材染色程度。

**方法与结果**
在南澳大利亚的Shiraz葡萄园进行了三项试验，比较了以下两种修剪方法：(i) 保留长残端的短枝修剪；(ii) 使用树冠修剪或平切法进行长枝修剪。部分伤口被接种了E. lata的子囊孢子，其余作为未接种的对照组以评估自然感染情况。结果发现，保留残端或基部芽的修剪方法显著减少了E. lata的感染和木材染色现象。与去除基部芽的平切法相比，保留基部芽的树冠修剪方法产生的伤口更小，并且产生了更多的非结果枝。

**结论与意义**
这些研究表明，保留节间或基部芽的修剪方式可以限制E. lata的感染和自然枯萎病的发生，从而补充现有的主干病害管理策略。这是首次科学验证修剪切口位置对葡萄藤主干病害病原体感染影响的研究。未来需要使用更多品种、气候条件和病原体进行进一步研究以确认这些结果。

**1. 引言**
葡萄藤的修剪目的是为了获得理想的产量和用于葡萄酒生产的葡萄品质[1]。然而，修剪也为引起主干病害的真菌病原体提供了入侵途径[2]，其中Eutypa lata是导致Eutypa枯萎病的主要原因[3]。该病害对全球葡萄园造成了严重破坏[2, 4]。从死亡或被感染的木材中释放出的E. lata子囊孢子会感染新的修剪伤口[3]。修剪伤口对E. lata感染的易感性取决于修剪时间、木质部导管堵塞的程度、地区和气候条件[2, 5–7]。Eutypa枯萎病的发生率和严重程度受修剪方式（如长枝修剪或短枝修剪）的影响，修剪造成的伤口表面积越大，病害的发生率和严重程度越高[8–10]。然而，根据Poussard的原始研究，Simonit[11]和Dal[12]的修剪手册认为修剪切口本身就会引发自然枯萎病，而葡萄藤主干病害（GTDs）在枯萎病发生中起次要作用。此外，位于节间的硬化髓细胞层（称为“隔膜”[14]）被认为可以减少伤口后的脱水[15]并延缓枯萎病的进展（F. Dal，个人交流，2022年）[14, 16]。Lecomte等人[17]认为，主要针对1年生枝条的修剪方法（尽可能保留节上方的木材残端并减少对老枝条的切割）不利于引起GTDs的病原体感染，因为他们认为这种修剪方式能够维持树液流动路径[13]，而长枝修剪可能导致自然枯萎反应，进而加剧病害症状。随后，Faúndez-López等人[16]报告了修剪切口下方坏死木材的深度和面积与切口距离节间距离之间的直接关系；但他们未检查木材的微生物定植情况。在法国的一项比较研究中，发现接受重度（Guyot-Arcure）或轻度（Guyot-Poussard）修剪的葡萄藤中，重度修剪的葡萄藤更容易受到真菌病原体的感染[18]。特别是参与形成Escapathium（一种葡萄藤主干病害）的Phaeomoniella chlamydospora和Phaeoacremonium minimum在重度修剪的葡萄藤中更为常见。然而，无症状葡萄藤的木材腐烂程度并未受到修剪方式的影响[19]。Claverie等人[19]指出，不遵循树液流动路径的修剪方法会导致活组织和导电木材面积减少，以及永久性木材中的导电树液流量减半[20]。Galar-Martínez等人[20]发现，尊重树液流动路径的修剪方式可以促进幼葡萄藤的植被生长和产量增加，因为在切割处保留了“保护性”木材。Lafon[13]建议在修剪时使用“树冠修剪”，即在不破坏隔膜的情况下切除基部芽，以防止春季芽的萌发。最近，Simonit[11]推荐使用“树冠修剪”，即在靠近永久性木材的血管组织的枝条上保留基部芽，从而减少树液流动的中断和病原体定植的风险。保留的芽通常会在春季形成新枝条，维持树液流动，从而减小伤口大小并限制自然枯萎病[21]。Falsini等人[21]发现，在修剪1年和3年生枝条时保留基部芽可以促进受损导管的快速闭塞，表明基部芽在激活防御反应中起作用。尽管在活组织和死组织中都观察到了真菌菌丝，但未鉴定出具体真菌种类，因此建议未来研究确认自然感染和人工接种引起的真菌定植与防御反应之间的关系。本研究旨在探讨修剪切口位置对E. lata定植和伤口木材染色的影响，具体比较了短枝修剪时是否保留长残端，以及长枝修剪时是否保留树冠和基部芽；后者在去除1年生枝条时可能会损伤隔膜。

**2. 材料与方法**
在澳大利亚南部的Barossa和Eden Valley地区选择了Shiraz葡萄品种进行三项田间试验。选择Shiraz是因为其对E. lata的易感性较高，并且对澳大利亚葡萄酒产业具有重要意义[22, 23]。试验1和2分别在Nuriootpa研究中心（南纬34° 28′ 32.7″，东经139° 00′ 19.8″）和Torbreck Hillside葡萄园（南纬34° 35′ 24.6″，东经138° 53′ 46.3″）的13年和33年生短枝修剪葡萄园中进行，时间是在休眠期（2021年）。试验目的是研究保留残端对E. lata定植和自然枯萎病的影响。试验3在Henschke Eden Valley葡萄园（南纬34° 38′ 4.6464″，东经139° 4′ 22.4076″）的约40年生长枝修剪葡萄园中进行，时间也是在休眠期（2022年），目的是评估去除不需要的枝条（包括水芽）时使用树冠修剪和平切法对E. lata定植和自然枯萎病的影响。处理措施分别于2021年8月13日和2022年9月11–13日实施。

**2.1. 处理方法**
- **试验1和2**：将葡萄藤修剪成保留两个节间的短枝，形成1年生木材的“残端”，或去除节间组织形成“无残端”处理。使用修枝剪在第二个清晰、发育良好的复合芽上方一定距离处切割残端（图1(a)）。无残端处理则是在第二个清晰复合芽上方尽可能近的位置进行切割（图1(b)）。
- **试验3**：通过树冠修剪和平切法去除指定的2年生枝条上的1年生枝条。同时保留两个2年生枝条以维持葡萄园的果实产量。树冠修剪保留了基部芽和隔膜（图2(a)和2(b)），而平切法则去除了基部芽和隔膜组织（图2(c)和2(d)。

**2.2. 子囊孢子的制备与接种**
根据Sosnowski等人的方法[24]从受感染的死葡萄藤木材中提取E. lata的子囊孢子，并进行相应处理。接种前，将子囊孢子悬浮液在添加了硫酸链霉素（100 mg/L；Sigma-Aldrich，Castle Hill，新南威尔士州）的土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，以评估其发芽能力（试验1和2的存活率为88%–94%，试验3为91%–95%）。接种处理包括使用微量移液器将20 μL的孢子悬浮液滴在伤口表面。接种剂量根据果园中实际存在的病原体压力设定：试验1和2中每伤口接种100个孢子，而试验3中因病原体回收率较低而接种200个孢子。所需浓度通过将悬浮液稀释在无菌反渗透（SRO）水中并使用血细胞计数器进行计算。未接种的对照组仅使用SRO水处理，以确定自然感染下的背景回收率。所有类型的切割方法均采用统一的接种程序。接种在每次修剪日的结束时进行。整个生长季节内不再对葡萄藤进行进一步的伤口处理或枝条操作。2022年（试验1和2）和2023年（试验3），处理过的短枝和长枝在6月被从葡萄藤上移除，以便在实验室评估病原体的染色和定植情况。

**2.3. 实验设计**
- **试验1和2**：每株葡萄藤随机施加四种处理（两种切割位置×两种接种剂量，即有/无子囊孢子），每个处理重复50次。为了避免结果混淆，未使用靠近研究区域的旧伤口短枝或节间较短的枝条。
- **试验3**：每株葡萄藤的指定2年生枝条上的节点随机施加四种处理（两种切割位置×两种接种剂量，即有/无子囊孢子），每个处理重复50次。1年生枝条从2年生枝条的顶端节点修剪成两个芽，以确保处理后的枝条仍具有水力活性。

**2.4. 伤口特征与染色评估**
- **试验1和2**：去除上一季的短枝（现为2年生木材）。
- **试验3**：去除处理过的枝条（现为3年生木材），并将其切成若干部分。每个重复样本用锋利的刀具削去树皮。然后沿髓部纵向切割短枝和长枝，使用喷洒了70%乙醇的修枝剪进行切割，并用纸巾擦拭以减少表面微生物的污染。
- 对于试验1和2，测量从隔膜向下到染色最远端的距离。为了评估近端膈膜阻碍染色进展的潜力，记录了染色在近端膈膜之前或处停止，或延伸超出膈膜的情况发生频率。在试验3中，记录了从冠芽中长出的不可计数枝条的数量，然后测量了修剪伤口的表面积，该面积按照Henderson等人[10]描述的方法计算为椭圆形的面积。接着，将枝条沿伤口中心纵向切开，以观察染色的范围，通过内部木材的变色长度来测量。标记出变色组织与看似活组织之间的近端边界，并测量该距离至伤口边缘的距离，这被称为“染色长度”。

2.5. E. lata的定殖评估

在完成生理测量后，每个木材样本都用2.5%次氯酸钠（White King；Pental Products，澳大利亚维多利亚州墨尔本）浸泡2分钟进行表面消毒，然后用SRO水冲洗[24]。从样本中切下大约2立方毫米的小块木材用于分离。在试验1和2中，分离点位于远端膈膜及下方2-3厘米处。在试验3中，分离点位于染色边缘及上方1厘米处。选择这些位置是为了确定病原体(a)是否存在以及(b)是否在一个生长季节内足够深入到永久性木材中。将五小块木材放置在添加了硫酸链霉素（100毫克/升）的PDA培养基上，每个位置一个9厘米的培养皿中，在大约22摄氏度的实验室温度下培养14天，光照周期为12小时。在7天和14天时，根据菌落形态特征检查木材样本中是否含有E. lata[3, 24]。

2.6. 数据分析

试验1和2的数据使用IBM SPSS V29.0.0.0统计软件包进行分析。检查了超出范围的数据值，并移除了分配错误或缺失值过多的样本。虽然枝条长度的度量数据分布均匀，但所有其他变量都显著偏斜。因此，对度量变量（染色长度，单位毫米）进行了Mann–Whitney U检验，对分类变量（发生率）进行了卡方检验。为了确定影响E. lata存在的最重要因素，使用两个因变量（处理方式：保留枝条或平切）进行了判别函数分析（DFA）。然而，DFA假设的正态性和方差齐性没有得到满足。因此，数据被汇总后，所有后续分析都使用了卡方检验。此外，还对试验1和2中的染色范围进行了方差分析。试验3的数据使用IBM SPSS V29.0.1.0统计软件包进行分析。检查了度量变量的正态性。所有度量变量（不可计数枝条的数量、伤口大小和染色长度）在总体上以及按切割类型或接种方式划分的组中都显著偏正。这违反了t检验的正态性假设。因此，所有独立组的分析都使用了非参数检验（Mann–Whitney U或Kruskal–Wallis）。对于接种处理的切割，构建了交叉表来评估E. lata定殖的发生率与切割类型之间的关系。

3. 结果

3.1. 保留枝条与不保留枝条的比较

在试验1和2中，不保留枝条进行修剪时，染色延伸超出远端膈膜的情况比保留枝条时更常见，分别为52%和36%，而保留枝条时分别为20%和17%（试验1 p < 0.001；试验2 p = 0.022；图3(a)和3(b)）。在两个试验中，不保留枝条修剪后染色超出远端膈膜的平均长度分别为11毫米和10毫米，显著大于保留枝条时的5毫米和5毫米（试验1 p(1-tailed) = 0.015；试验2 p(1-tailed) = 0.016）。图3(a)和图3(b)显示了不保留枝条修剪和保留枝条修剪后的染色发生率（%，蓝色）和平均染色长度（毫米，橙色）。星号表示p < 0.05?或p < 0.001??的处理组间存在显著差异。白色条形代表染色长度的95%置信区间。在两个试验中，染色更可能在近端膈膜之前或处停止（分别为29%和25%），而不是延伸超出膈膜（分别为4%和2%；p < 0.001）。对于定殖情况，在试验1和2中，当伤口接种了100个孢子时，E. lata在远端膈膜处或更远处的检出率分别为15%和19%，而未接种时分别为2%（p < 0.001）和6%（p = 0.036）。然而，由于E. lata的检出率相对较低，将未接种（即自然感染）和接种处理的数据合并，比较了不保留枝条修剪和保留枝条修剪后病原体的总检出率。在试验1中，不保留枝条修剪后，E. lata在远端膈膜处（10%）或下方2-3厘米处（13%）的检出率高于保留枝条修剪时（分别为2%（p = 0.019）或3%（p = 0.013）（图4(a)和图4(b)）。在试验2中，不保留枝条修剪后，E. lata在远端膈膜处的检出率为7%，而保留枝条修剪时为8%（p = 0.788）。然而，不保留枝条修剪后，E. lata在远端膈膜下方2-3厘米处的检出率为7%，而保留枝条修剪时为1%（p = 0.045）（图4(c)和图4(d)）。图4(a)和图4(d)显示了不保留枝条修剪和保留枝条修剪后，E. lata在远端膈膜处（蓝色）及远端膈膜下方约2-3厘米处（橙色）的检出情况。星号表示p < 0.05的处理组间存在显著差异。ns = 无显著差异。数据将试验1和2中远端膈膜处及远端膈膜以下的E. lata检出率合并，以研究病原体存在与染色之间的关系。无论是否存在病原体（23%–54% vs 36%–61%），染色发生的概率相同（p > 0.05）。

3.2. 冠部切割与平切的比较

春季时，冠部切割产生的不可计数枝条平均数量为1.13个（标准差=0.97；图5(a)），显著多于平切产生的0.06个（标准差=0.29；图5(b)）。不同切割类型产生的不可计数枝条数量存在显著差异（p < 0.001），其中50%的冠部切割伤口产生一个或多个不可计数枝条，而90%的平切伤口没有产生枝条。冠部切割的伤口表面积显著较小（p < 0.001，图5(a)为50平方毫米，图5(b)为181平方毫米）。图5显示了冠部切割（a）和平切（b）产生的不可计数枝条数量及伤口表面积。冠部切割（c）和平切（d）造成的内部染色情况。图5(e)显示了E. lata从冠部切割和平切切割中的检出情况。星号表示p < 0.01的处理组间存在显著差异。冠部切割伤口导致的染色长度较短。虽然50%的冠部切割伤口的染色长度不超过6.5毫米，但50%的平切伤口的染色长度超过10毫米（图5(c)和图5(d)）。Mann–Whitney检验表明这种染色长度的差异具有显著性（p(2-tailed) = 0.005）。对接种处理的卡方分析显示，冠部切割伤口被E. lata定殖的可能性显著较低（p = 0.006，而平切伤口为23%；图5(e)）。检查了E. lata从木材中检出情况与病原体存在之间的关系。在50%的E. lata被分离出的伤口中，染色长度超过9毫米，而在50%未分离出E. lata的伤口中，染色长度超过7毫米。Mann–Whitney检验确认这种染色长度的差异不显著（p(2-tailed) = 0.721）。

4. 讨论

对伤口后E. lata的染色模式和定殖特征的表征表明，修剪葡萄藤时保留枝条或基部芽可以减少定殖和自然枯萎的发生率，优于不保留枝条和平切伤口。这些发现支持了修剪时保留长枝条或基部芽对藤蔓健康有益的假设。在试验1和2中，保留一年生枝条的枝条可以减少远端膈膜以下组织中E. lata的检出率，而不保留枝条的修剪则没有这种效果。在试验1中，保留枝条时，远端膈膜处的病原体检出率也降低了，但在试验2中则没有这种效果。一个可能的解释是不同葡萄园之间节间长度的差异，导致枝条长度不同，这可能影响了膈膜处的定殖可能性。需要进一步实验来确定抑制定殖的最小枝条长度。此外，在试验3中，从平切下的木质组织中比从保留基部芽的枝条中更频繁地检出病原体。无论是否接种了病原体的子囊孢子，这项研究中2%至19%的伤口中都检出了E. lata。这与澳大利亚先前报道的未接种修剪伤口的检出率0%–17%[26–28]相当，而Sosnowski等人[24]和Ayers等人[28]报告的7月至8月中旬接种伤口的检出率为41%–76%。鉴于接种物的活力足够，这里观察到的较低检出率可能部分反映了伤口表面的可变性和接种时间。由于本研究中的修剪要求切口与膈膜平行，导致伤口与地面的角度各异，有些伤口使得孢子悬浮液从伤口滴落或沉积不均匀。在季节末期（本例中为9月）进行修剪也可能降低了E. lata的感染概率，这与南澳大利亚阿德莱德山地区的报告一致[29]。春季较为温暖的条件可以促进伤口愈合，因为这会增加木质化和栓皮质的生成[6, 30]。在未来的实验中，如果选择更合适的短枝，在仲冬进行接种，并增加重复次数，可能会有助于阐明病原体从远端隔膜处恢复的情况，并且还可以评估不同长度的残枝，以确定一个可能减少或防止E. lata定殖的最小长度。保留残枝可能通过两种方式来降低E. lata在相关组织中的发生率。E. lata在木材中的生长速度较慢，平均每月仅4-146毫米[31]，这一时间与本研究使用的时期相似。这里保留的长残枝可能比E. lata在木材中的生长速度更快地干燥，从而将病原体困在干燥的木材中。这一推测得到了试验1中从这两个位置分离出的病原体数量较少的结果的支持。然而，在试验2中，远端隔膜处的病原体恢复率高于距离隔膜2-3厘米处的恢复率，这表明E. lata可能通过了残枝，但被隔膜阻碍了其生长，正如F. Dal（个人交流，2022年）所提出的。在试验3中，保留基部芽的伤口处分离出E. lata的频率较低，这也表明两种类型的伤口处葡萄组织形态的差异可能影响了病原体的定殖，这可能是由于隔膜的存在与否或基部芽的存在所致。Falsini等人[21]报告称，在保留基部芽的伤口下方，导管中形成了大量的木质化物质，而在没有残枝的切割中则没有这种现象，这可能阻碍了E. lata在导管中的传播[6]。此外，与平切相比，截顶切割后的伤口表面积较小，为E. lata的自然接种提供了更小的感染场所[10]。这些发现支持了这样一个假设：在修剪葡萄藤时保留隔膜可能有助于限制 trunk 疾病病原体在木材中的定殖[11, 32]。葡萄藤的木质部导管在节间内表现出显著的重排，其弯曲度增加、不规则性增强，并且许多导管的管腔在切片顶部和底部变得不明显[33]。当在长残枝或截顶切割伤口附近的组织中保留隔膜时，不连续的导管结构可能会限制E. lata菌丝延伸到永久性结构中的能力，从而将病原体隔离起来。此外，隔膜可能起到自然脱落区的作用，加速伤口愈合过程，并减轻因移除一年生枝条或老枝造成的伤害影响。保留基部芽的截顶切割可能加速伤口愈合过程[21]，因为葡萄藤会优先利用这些活跃生长的部位，而不是缺乏相邻生长点的伤口部位（本研究中的平切部分）。进一步的研究可以通过接种各种真菌病原体、组织学观察、培养分离以及分子检测和定量分析[18]，来探究隔膜在限制修剪伤口下方组织中真菌传播中的作用。尽管沿短枝长度观察到的E. lata恢复率的变化表明隔膜可能对病原体起到天然屏障的作用，但结果并不支持Faúndez-López等人[16]提出的隔膜能阻止自然衰退进展的假设。自然衰退（通过染色来衡量）确实会穿过隔膜，尽管这种情况很少见。由于本研究中发现E. lata的存在对染色没有明显影响，任何染色现象都被归因于对伤害的生理反应和非病原性真菌[34]。虽然染色现象较少见，但在不保留残枝的修剪后比保留残枝的情况下更为常见且范围更广。这似乎支持了通过保留残枝可以最小化“自然衰退”的假设[11, 12, 16, 35]。同样，截顶切割造成的染色长度比平切切割更短，但本研究尚未明确染色受到抑制的具体机制。隔膜的完整性变化以及修剪伤口的大小与其与自然衰退之间的关系需要进一步研究。非计数枝条出现的模式表明，截顶切割比平切切割更有利于枝条的生长，正如Lafon[13]所描述的那样，少数导致非计数枝条出现的平切切割可能保留了一些芽。相比之下，一些修剪者采用Lafon[13]推荐的平切方法来去除这些芽，以减少生长季节后枝条的密度。这不仅能够降低劳动力成本，还能减少春季产生的绿色枝条伤口数量，从而降低感染风险。有证据表明，移除绿色枝条造成的伤口容易受到葡萄藤 trunk 疾病（GTD）病原体（包括E. lata）的感染[36, 37]。关于截顶切割和平切切割在效益和成本方面的相对优势，虽然超出了本研究的范围，但值得进一步研究。

5. 结论
保留残枝或基部芽可以减少修剪后E. lata的恢复率，这可能与隔膜的完整性或基部芽对伤口愈合反应的影响有关。保留残枝或基部芽后，染色现象（即自然衰退）也得到了限制，尽管其因果机制尚不清楚，需要进一步研究。这里的发现支持在短枝修剪时保留藤节，在移除不需要的枝条时保留基部芽的做法。这种方法补充了现有的GTD管理措施，不需要对葡萄藤的结构或棚架进行重大改变，并且可以降低E. lata的感染率。然而，应通过使用不同的品种、病原体、木材年龄和气候区来进一步验证这种方法的有效性，以评估其在管理GTD方面的潜力。

致谢
作者感谢Nigel Blieschke（Torbreck Wines）、Roger Maywald（SARDI—Nuriootpa研究中心）和Adam Pietsch（Henschke Wines）允许进入葡萄园进行试验。Swinburne科技大学? Andi Garing提供了统计支持。Tarita Furlan和Matthew Ayres（SARDI）提供了实验室支持和建议。

资金支持
阿德莱德大学为Daniel K. March和Samuel P. B. Parker的荣誉研究项目提供了支持，并由Eileen S. Scott进行了指导。南澳大利亚研究与发展研究所也提供了支持，包括Mark R. Sosnowski的指导，以及葡萄园和实验室设施的使用和消耗品的供应。阿德莱德大学通过Wiley - 阿德莱德大学协议与澳新大学图书馆协会的合作，促进了开放获取出版。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。