pH值对Clitoria ternatea提取物的回收效率及花青素组成的影响，以及这些提取物作为食品保鲜中的脂质抗氧化剂的应用

《Food Science & Nutrition》：Effect of pH on recovery efficiency and anthocyanin composition of Clitoria ternatea extracts with application as lipid antioxidants in food preservation

　　**摘要**

本研究旨在探讨pH值对从C. ternatea花朵中提取的花青素提取效率、生物活性化合物及其潜在食品应用的影响。提取过程在1至13的pH范围内进行控制。结果表明，总花青素含量（TAC）在pH 3.0时达到峰值，而总多酚含量（TPC）和DPPH抗氧化活性在pH 7.0时达到峰值。通过紫外-可见光谱（UV–Vis）、扫描电子显微镜（SEM）和液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）进一步分析了这两种pH条件下的吸收光谱、细胞结构及花青素组成的差异。LC-HRMS分析揭示了花青素和黄酮类化合物的复杂谱型，包括槲皮素3-[2-O-鼠李糖基]芸香糖苷、飞燕草素-3-(顺式-p-香豆酰)葡萄糖苷、山柰酚3-(6-p-香豆酰)芸香糖苷、山柰酚衍生物、花青素-3-(p-香豆酰)葡萄糖以及无糖花青素，这些成分仅在花朵的自然pH值（6.8–7.0）下被检测到。观察到的组成差异与花青素在酸性条件下从黄酮离子形式向中性条件下醌类碱形式的结构转变有关。这些发现为理解pH依赖性的花青素行为提供了见解，并为优化特定食品应用的提取条件提供了指导。在pH 7条件下制备的花青素和多酚提取物被用于测试其在软糖中的脂质氧化抑制效果。结果表明，蝴蝶豌豆花青素作为功能性成分在食品系统中具有潜在应用价值，特别是作为具有抗氧化功能的天然色素。总体而言，本研究从机制上阐明了pH依赖性的花青素行为，并支持将中性pH值的C. ternatea提取物作为稳定且多功能成分用于含脂食品中。

**1 引言**

C. ternatea（俗称蝴蝶豌豆花）属于植物界、维管植物门、双子叶植物纲和豆科植物。它因其作为天然蓝色色素在食品、化妆品和制药领域的潜力而受到关注（Jamil等人，2018年；Marpaung等人，2017年）。该物种广泛种植于热带和湿润气候区，尤其是在东南亚（Mukherjee等人，2008年），具有高度适应性，在越南各地均有分布。其花朵，尤其是花瓣，富含酚类化合物和多种生物活性物质，包括生物碱、单宁、苷类、类固醇、皂苷、黄酮类和酚类（Mohan，2013年）。主要次级代谢物包括黄酮醇苷、鼠李素、槲皮素、酚酸、山柰酚和花青素（Jeyaraj等人，2021年；Vidana Gamage和Choo，2023年）。花青素因其鲜艳的色素沉着性和食用安全性而具有价值，但其在水环境中的稳定性较差，尤其是在温度、光照、pH值、金属离子和酶活性变化的情况下（Houghton等人，2021年）。由于其结构上的脆弱性——尤其是C环上的O1–C2键不稳定——花青素容易在食品加工和储存过程中发生降解，导致变色和功能丧失（Huang等人，2021年；Zang等人，2021年）。已有研究探讨了花青素在不同pH值和温度条件下的稳定性（Abdullah等人，2010年；Syahirah等人，2018年）。值得注意的是，添加稳定剂如低聚果糖可有效防止光降解（Escher等人，2020年）。花青素对pH变化的响应引起的结构转变与提取物颜色的变化密切相关。虽然在pH 4–6之间可能不会发生变色，在pH 0.5–13范围内不同温度下也不会形成棕色沉淀物，但酸性提取物比碱性条件下的储存稳定性更高。红色蝴蝶豌豆花青素提取物（CTAE）在27°C–37°C下60天内可保持70%–80%的色泽，在7°C下可稳定超过一年（Abdullah等人，2010年）。随着对天然食品添加剂需求的增加，人们开始探索植物来源的替代品以替代合成色素，尤其是那些兼具功能和美观效果的色素。花青素是一类水溶性黄酮类色素，因其作为天然色素和具有强抗氧化特性的生物活性化合物而受到关注。尽管花青素在水果和蔬菜中普遍存在，但大多数花青素呈现红色至紫色，而在食品系统中开发稳定的蓝色色素仍是一个持续挑战，因为蓝色色素在自然界中较为罕见，并且在pH值、光照和温度等变化条件下容易降解（Giusti等人，2023年；Houghton等人，2021年）。C. ternatea则是一个显著的例外。这种豆科植物富含ternatins，这是一种能够产生强烈蓝色的多酰基花青素亚类。与传统花青素不同，ternatins在酸性条件下结构更稳定，具有更好的热稳定性和光诱导降解抗性，使其非常适合应用于饮料和糖果等酸性食品中（Chusak等人，2018年）。此外，它们的两亲性质——半极性的糖苷和酰基基团——使其易于在水和脂质环境中分配，为含脂功能食品的应用提供了优势（Enaru等人，2021年）。脂质氧化是食品加工和保存中的一个主要挑战，这是一种复杂的自加速反应，会产生过氧化物、醛类和丙二醛（MDA）等活性物质，导致脂质食品的氧化稳定性、营养价值和感官特性下降（Dobarganes和Velasco，2002年；Halliwell和Gutteridge，1984年）。许多研究表明，多酚和花青素通过多种机制有效抑制脂质氧化，包括自由基清除、过渡金属螯合以及抑制脂氧合酶等氧化酶（Repetto和Boveris，2012年）。除了化学活性外，花青素还可能与生物聚合物基质形成更稳定的复合物。最新证据表明，花青素可以通过共价和非共价相互作用与果胶、明胶和琼脂等多糖结合，从而增强色素的保留和稳定性（Shi等人，2024年）。在此背景下，选择软糖作为模型系统来评估C. ternatea提取物（CTE）的功能性。这种产品类型提供了富含多糖的基质，有利于花青素与聚合物的相互作用，并模拟了实际储存和加工条件。该配方有助于评估花青素的稳定性和抗氧化能力，证明了CTE作为多功能成分的可行性。它既可作为天然色素，也可作为生物活性化合物，有助于开发清洁标签和增值功能食品。

**2 材料与方法**

**2.1 C. ternatea 花朵**

新鲜C. ternatea花朵于早晨06:00至08:00之间从位于越南Tay Ninh省的D'PALFARM有限公司（北纬11°35′25″，东经106°9′24″）采集。该植物物种在越南科学技术研究院的热带生物学研究所进行了分类鉴定。采集后，使用热泵干燥机在41°C±1°C下干燥至水分含量达到12%–13%。干燥后的样品装入密封聚乙烯袋中，在冷却条件（10°C–15°C，避光）下储存，待提取使用。所有样品在干燥后1个月内使用完毕。提取前，将干燥的花朵研磨成粗粉以确保提取效率的一致性。

**2.2 化学品与设备**

**2.2.1 化学品**

购买的化学品包括：没食子酸（Acros，比利时）、Folin–Ciocalteu试剂（Sigma Aldrich，美国）、碳酸钠（Xilong，中国）、DPPH（2,2-二苯基-1-吡啶肼）（Acros，比利时）、Trolox（Sigma Aldrich，美国）、乙酸钠（Xilong，中国）、氯化钾（Xilong，中国）、浓盐酸（Xilong，中国）、HCl（Sigma Aldrich，美国）、NaOH（Sigma Aldrich，美国）。

**2.2.2 设备**

红外水分分析仪（ML-50，AnD，日本）、对流干燥机（UM400，Memmert，德国）、pH计（F20，Mettler Toledo，美国）、配备适用于非水体系的复合玻璃电极的pH计（EtOH电极，Metrohm，瑞士）、恒温水浴（WNE-29，Memmert，德国）、UV-Vis光谱仪25–1650-01-0406、真空泵（RV8，Edwards，德国）、Labconco FreeZone冷冻干燥系统（美国）、Q Exactive混合四极杆-轨道阱质谱仪（Thermo Finnigan，美国加州圣何塞）。

**2.3 样品制备与提取**

干燥的蝴蝶豌豆花朵按照先前验证的提取方法处理，以回收花青素和酚类化合物，并进行轻微修改以适应广泛的pH范围（Nguyen等人，2025年）。取3克干燥的蝴蝶豌豆花朵，使用含50%乙醇的混合溶剂体系在50°C下提取45分钟。提取介质通过适当的缓冲系统（KCl–HCl用于pH 1–2，醋酸缓冲液用于pH 3–6，磷酸盐缓冲液用于pH 6–8，碳酸盐缓冲液用于pH 9–11，NaOH缓冲液用于pH 12–13）调整pH值。提取前使用配备适用于非水体系的复合玻璃电极的校准pH计（EtOH电极，Metrohm，瑞士）验证每种提取介质的pH值，确保在含乙醇介质中能够准确测量pH值。提取后，混合物在真空条件下过滤，并使用旋转蒸发器（IKA RV 3系列，德国）在45°C和60 rpm下浓缩60分钟，得到最终水分含量约为35%–37%的浓缩提取物（CTE）。

**2.4 化学测定**

**2.4.1 TPC、TAC、DPPH**

TPC值使用Folin-Ciocalteau比色法测定，方法基于Agbor等人（2014年）描述的一般原理，并进行了少量修改。将0.5毫升适当稀释的提取物与2.5毫升10倍稀释的Folin–Ciocalteu试剂混合，反应5分钟。随后加入2.0毫升7.5%（w/v）的碳酸钠溶液。混合物在室温下避光孵育30分钟，使用UV-Vis光谱仪在765 nm处测量吸光度。使用没食子酸绘制校准曲线，结果以每克干物质的没食子酸当量（mg GAE/g DM）表示。TAC值通过差分pH法测定（Fuleki和Francis，1968年）。提取物分别用氯化钾缓冲液（0.025 M，pH 1.0）和乙酸钠缓冲液（0.4 M，pH 4.5）稀释。使用UV-Vis光谱仪在520和700 nm处记录吸光度。TAC值以花青素-3-葡萄糖苷当量计算，基于分子量449.2 g/mol和摩尔吸光度26,900 L·mol?1·cm?1。抗氧化活性使用2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）自由基清除法测定，方法参考Brand-Williams等人（1995年）。在甲醇中制备DPPH溶液（0.1 mM）。取0.1毫升提取物与3.9毫升DPPH溶液混合，在室温下避光孵育30分钟。使用517 nm处测量吸光度。以Trolox为标准，结果以每克干物质的μmol Trolox当量（μmol TE/g DM）表示。所有测量均重复三次。

**2.5 结构与光谱分析**

**2.5.1 UV–Vis光谱**

使用光谱仪（Model 25–1650-01-0406）对pH值调整至1至13的C. ternatea提取物进行UV–Vis光谱分析。在250–700 nm波长范围内测量吸光度，光谱分辨率间隔为0.2 nm，使用1 cm石英比色皿，蒸馏水作为空白对照。样品适当稀释以确保吸光度值在线性检测范围内。花青素吸收特性和pH依赖性变化的光谱解释基于先前建立的花青素光谱行为（Giusti和Wrolstad，2001年）。

**2.5.2 扫描电子显微镜（SEM）**

在pH 3和pH 7下提取的残余固体干燥至约5%水分，使用双面导电胶带固定在铝制样品台上，并镀上一层薄金。使用高真空模式的常规扫描电子显微镜观察表面形态，加速电压为10 kV，工作距离约为10.8 mm。显微镜放大倍数范围为×100至×10,000，以评估细胞壁的破坏和结构变化。

**2.5.3 LC–HRMS分析**

花青素分析使用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱（HPLC）系统（Thermo Finnigan，美国加州圣何塞）和Q Exactive混合四极杆-轨道阱质谱仪（Thermo Finnigan，美国加州圣何塞）进行。色谱分离在Luna C18柱（150 mm × 2.00 mm，5 μm粒径；Phenomenex，美国）上进行，温度维持在30°C。流动相由溶剂A（乙腈）和溶剂B（0.05% v/v甲酸水溶液）组成，梯度洗脱程序如下：0–10分钟，98% B；10–18分钟，80% B；18–25分钟，40% B；25–30分钟，重新平衡至98% B。流速设置为0.3 mL/min。所有数据采集和处理使用Thermo Scientific Xcalibur软件进行。Q-Orbitrap质谱条件：Q Exactive质谱仪采用正电喷雾离子化（ESI）模式，全MS扫描范围为m/z 100–1500，分辨率为70,000（FWHM）。使用氮气作为鞘气和辅助气体。HESI参数如下：鞘气流量30 arbitrary units（arb）；辅助气体10 arb；扫描气体0 arb；S透镜射频水平50 V；毛细管温度32°C；辅助气体加热器温度30°C。MS/MS碎片化分析采用高能碰撞解离（HCD）技术进行，归一化碰撞能量（NCE）为20。氮气也被用作C-trap内的碰撞气体和喷雾稳定气体。分析前进行了外部质量校准，质量精度保持在5 ppm以内。花青素化合物的鉴定是基于其碎片化模式与先前报道的参考光谱进行比较得出的。半定量分析是通过计算各个花青素在总离子色谱图（TIC）中峰面积的百分比来进行的。

2.6 含脂肪的软糖应用

2.6.1 软糖制备
明胶在室温下浸泡在水中30分钟，然后通过加热至80°C溶解。同时，将糖和麦芽糖浆溶解在水中并加热至80°C直至均匀，之后加入明胶溶液。混合物冷却至大约60°C，然后分别加入不同比例的Anchor黄油（82.9%脂肪）和C. ternatea提取物（CTE），比例分别为0%、3%、6%或9%（w/w），以及0%、0.5%、1.0%、1.5%或2.0%（w/w）。CTE既作为天然蓝色色素，也作为抗氧化活性来源。轻轻混合后，加入柠檬酸以调整风味并增强稳定性。最终混合物倒入预冷却的硅胶模具中（4°C），静置3-4小时，脱模后继续在4°C下陈化20小时。然后将软糖包装在真空密封的PE–PA（聚乙烯-聚酰胺）袋中。成品分析了总花青素含量（TAC，mg/g糖果）、总多酚含量（TPC，mg/g糖果）和DPPH抗氧化活性（μmol Trolox当量/g糖果）。脂质氧化通过过氧化物值（PV）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）作为指标进行监测。所有参数在30°C下储存8周期间进行测量。每种配方都重复制备并分析三次以确保可重复性。

2.6.2 感官评估
感官评估使用5点愉悦度量表（1=非常不喜欢，5=非常喜欢）由20名经过半培训的评估者在标准照明和食用条件下进行。评估前，评估者已经熟悉了评估程序。评估的属性包括颜色、风味、口感、质地和整体接受度。

2.7 质地分析（TPA）
使用质地分析仪（TA-XT Plus，Stable Micro Systems，英国）和运行Exponent Connect Lite版本7.0的Windows计算机来评估软糖样品的结构特性。TPA在以下条件下进行：压缩力为25 kg，测试速度为1 mm/s，应变水平设置为样品高度的50%（Bourne 1978）。

2.8 脂质氧化指数
过氧化物值（PV）是根据碘量滴定法测定的，该方法使用乙酸-异辛烷溶剂和碘化钾，并以淀粉作为终点指示剂，用硫代硫酸钠进行滴定（ISO-3960 2017）。

2.9 硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）
TBARS是基于丙二醛（MDA）含量的测定来计算的，使用TBARS指数。TBARS测定的原理是MDA与硫代巴比妥酸（TBA）之间的反应，形成一种在大约532 nm处具有强吸收的粉红色复合物。吸收强度与MDA的浓度成正比，从而反映了样品中脂质过氧化的程度。该方法按照Prasetyo等人的研究（2008年）进行。

2.10 展示研究结果
所有实验至少重复三次以计算平均值。结果以平均值±标准差的形式呈现。实验结果使用Statgraphics Centurion 19（X64版本）软件进行单因素方差分析（ANOVA）。数据表示为平均值±标准差（n=3）。实验结果之间的显著差异通过多重范围测试（p<0.05）进行比较。应用Tukeys HSD事后多重比较测试来确定均值之间的成对差异。

3 结果与讨论
3.1 pH值对TAC、TPC和DPPH抗氧化活性的影响
从D PALFARM有限公司（越南Tay Ninh省；北纬11°35′25″，东经106°9′24″）获得的新鲜C. ternatea花朵按照第2.3节所述的方法进行处理，并在pH范围1-13内进行提取。随后对这些提取物进行了总花青素含量（TAC）、总多酚含量（TPC）和DPPH抗氧化活性的分析。结果如图1所示。图1显示了pH值对TAC、TPC和DPPH抗氧化活性的影响。不同字母表示统计学上的显著差异（p<0.05）。数值以平均值±标准差（n=3）呈现。DM表示干物质。图1A表明，在pH 3和pH 7时观察到最高的TAC，表明花青素在高酸性（pH 3）和中性（pH 7）条件下更稳定。在pH 3时，花青素保持其分子结构、颜色，并导致较高的TAC水平。在pH 7时，尽管不如pH 3稳定，花青素仍保持显著的抗氧化活性，TAC也相对较高。在中间pH值（大约pH 5）时，TAC明显下降。pH 5时花青素的不稳定性可以解释为其位于水合-半酮醇平衡区域。在这个pH值下，黄素阳离子部分转化为无色的半酮醇和查尔酮形式，降低了发色团的完整性和表观TAC。相比之下，在碱性pH（9-13）下，花青素的稳定性显著下降，导致TAC显著减少，这是由于分子分解、颜色损失和抗氧化能力减弱。这些发现与Giusti和Wrolstad（2001年）以及Lee等人（2002年）的先前研究结果一致，这些研究强调了花青素在酸性到中性pH环境中的稳定性增强。图1B显示了在pH范围1-13内对蝴蝶豌豆花提取物的TPC进行评估。结果表明，在微酸性到中性pH范围（4-7）内TPC显著较高，最大含量出现在pH 7（39.667 mg GAE/g CK）。在较低的pH值（1-3）时，TPC明显较低，范围从8.439 mg GAE/g CK到30.375 mg GAE/g CK，表明酸性环境对多酚的稳定性和提取有负面影响。相反，在较高的pH值（8-13）时，TPC显著减少，最低值记录在pH 13（1.990 mg GAE/g CK）。这一趋势与先前的研究结果一致，表明酚类化合物的稳定性高度依赖于pH值。几种常见的酚类化合物，如绿原酸、咖啡酸和没食子酸，在高酸性或碱性条件下会发生结构降解，在极端pH值下不稳定性最为明显。相比之下，这些化合物在适中pH范围（特别是pH 4-7）内更稳定，这有助于它们的提取和保存（Friedman和Jürgens 2000）。图1C显示，在pH值1-7之间获得的提取物具有最高的DPPH抗氧化活性。然而，随着pH值超过7，抗氧化活性逐渐下降，尤其是在pH 11-13之间下降最为显著。这可能是由于敏感的多酚结构降解所致。碱性条件促进多酚的氧化和分解，导致功能性质下降，包括抗氧化活性和色素损失。因此，从C. ternatea中提取和保留多酚的最佳pH值似乎位于微酸到接近中性的范围（pH 4-7），这与Friedman和Jürgens（2000）描述的模式一致。图1的结果表明，C. ternatea中的花青素和多酚在pH 3和pH 7时表现出最高的稳定性，在微酸到中性条件下抗氧化活性最强。相比之下，碱性环境（pH 9-13）显著降低了这些化合物的稳定性和抗氧化能力。这些发现与先前的研究一致，表明pH范围4-7是提取蝴蝶豌豆花中多酚和花青素化合物的最佳范围（Fu等人2021）。定量结果表明，提取效率和组成谱型随pH值的变化而变化。pH 3时的最大TAC反映了黄素发色团的稳定，而pH 7附近的TPC和DPPH抗氧化活性峰值表明非花青素酚类和转化的花青素衍生物的回收率更高。这些数值趋势表明，提取行为是由色素稳定性、溶解度和pH驱动的结构变化的综合效应引起的。为了进行详细的分子表征，pH值的选择基于化学代表性而不仅仅是提取产量。pH 3和pH 7对应于两个相对稳定的花青素形式：黄素阳离子形式和部分稳定的醌类/中性形式——在这种形式下，发色团的完整性和分子身份得到充分保存，可以进行可靠的谱型分析。相比之下，中等和碱性pH条件有利于快速转化为查尔酮结构、水合产物和降解中间体。这种动态转变使得LC-HRMS的解释复杂化，并不反映与食品应用相关的组成状态。基于这些结果，进行了进一步的分析，包括SEM成像观察细胞结构、UV–VIS光谱确定吸收波长，以及LC-HRMS色谱鉴定pH 3和pH 7下的花青素化合物。这些高级表征为C. ternatea在食品相关应用中的应用提供了基础。

3.2 SEM
根据第2.5.2节的制备方法，对pH 3和pH 7下制备的CTE干燥植物材料进行了SEM成像。图2显示了观察到的微观结构差异。图2揭示了pH对C. ternatea花瓣细胞壁结构的显著影响。在pH 3（图2A）时，细胞壁受到更严重的破坏，而pH 7（图2B）时细胞壁基本保持完整。这种差异主要归因于酸性环境，它促进了果胶上羧基的质子化，特别是在同聚半乳糖醛酸（HG）区域。这种质子化导致钙介导的交联（Ca2+–果胶）解离，从而破坏了维持细胞壁完整性的多糖基质（Phyo等人2019）。此外，低pH条件增强了纤维素的水合作用并破坏了半纤维素的氢键，导致细胞壁结构更加“流动”和可折叠（Cosgrove 2000）。这种结构不稳定性与SEM图像中观察到的组织解体一致。这些发现强调了提取pH不仅影响生物活性化合物的回收效率，还影响植物组织的微观结构损伤程度。

3.3 UV–Vis吸收谱
图3显示了pH 3和pH 7下CTE的吸收光谱：
图3显示了CTE在pH 3和pH 7时的吸收光谱。在pH 3（图3A）时，CTAE呈现紫红色。在294 nm、366 nm和549 nm处观察到三个吸收峰，最大吸收出现在549 nm。在pH 7时，CTAE呈现亮蓝色，在295.4 nm、368 nm和618 nm处有吸收峰，最大吸收记录在581 nm（吸光度=2.911）。提取物的UV–Vis光谱在可见光区域（约520–550 nm）显示出特征性吸收，这与观察到的颜色强度和TAC值一致。这些UV–Vis结果与先前关于花青素pH依赖稳定性的研究一致。在pH 3时，花青素以黄素阳离子形式稳定，在520–550 nm范围内表现出强吸收。在pH 7时，发生 Bathochromic 移动，吸收峰移至570–620 nm范围，表明结构转变为醌类碱形式（Marpaung 2020）。

3.4 通过LC–HRMS分析花青素组成
LC-HRMS分析用于比较不同处理对C. ternatea组成的影响。植物化学物质的身份基于其MS/MS碎片化和与文献数据的比较进行验证。C. ternatea花提取物的浓度基于峰面积的百分比确定。结果在表1和图4中呈现，显示了pH 3和pH 7下CTE的LC-HRMS结果。在不同处理中鉴定出属于花青素组的七种化合物以及槲皮素和山柰酚的苷元。表1显示了pH 3和pH 7下通过LC-HRMS初步鉴定的花青素化合物组成。3.5 中性pH值下CTE在软糖中的应用

3.5.1 C. ternatea软糖的配方设计
根据LC-HRMS结果初步鉴定出的黄酮苷的酰基化作用，有助于解释CTE天然颜色的保持。基于这些发现，本研究的下一阶段将CTE（在其自然提取pH值（约6.8–7.0）下制备）应用于主要由葡萄糖糖浆、明胶和琼脂组成的食品基质中。这些成分促进了黄酮-聚合物复合物的形成，从而形成了一个结构网络，能够包裹花青素分子或限制它们与氧气和金属离子的接触，进而提高了颜色的稳定性（Duan等人，2022年）。CTE被作为天然色素和抗氧化剂添加到软糖中，丰富了产品的生物活性化合物。本研究优化了软糖生产的成分比例，并根据水分含量、pH值、总糖分、还原糖分、TPC（Total Phenolic Content）和DPPH抗氧化活性，在两个月的储存期间评估了产品品质。CTE的成分组成见表2。

表2. CTE的化学组成。

| 单位 | CTE |
|------|------|
| 水分 | % |
| 36.06±0.98 |
| QTTN/KT3 136:2016 |

| 蛋白质含量 | g/g DM | 0.339±0.012 | Kjeldahl方法 |

| 碳水化合物含量 | g/g DM | 0.651±0.003 | QTTN/KT3 317:2022 |

| 灰分含量 | % | 0.345±0.013 | AOAC 942.05, 923.03 |

| TPC | mgGAE/g DM | 135.81±0.081 | ISO 14502-1:2005 |

| TAC | mg/g DM | 6.81±0.005 | AOAC 2005.02 |

通过初步的配方筛选试验，确定了CTE（0%–1.5%，w/w）和脂肪（0%–9%，w/w）的适宜浓度范围，以确定软糖制备的技术可行性窗口。在最初的试验中，过高的CTE含量会导致颜色过深和轻微的收敛性，而过高的脂肪含量则会导致口感油腻、分层以及凝胶均匀性降低。因此，选定的范围被认为适合评估CTE和脂肪对产品质量和氧化稳定性的综合影响。本研究中使用的软糖配方见表3，初步筛选的详细结果见表S1，表中显示超过1.5% CTE或9%脂肪的配方会导致不可接受的感觉和结构特性。

表3. CTE软糖的配方。

| 成分 | % |
|------------|--------|
| 糖 | 32.5–33.0 |
| 葡萄糖糖浆 | 10.4–11.0 |
| 明胶 | 11.0 |
| 水 | 35.0–40.0 |
| CTE | 0–2.0 |
| Anchor黄油 | 0–9.0 |

3.5.2 感官评估
基于初步筛选中确定的技术可行浓度范围，进行了正式的感官评估，以确定CTE和黄油在软糖配方中的最佳含量。制备了含有不同浓度CTE（0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，w/w）和黄油（0%、3%、6%、9%，w/w）的软糖样品。感官评估结果表明，CTE和脂肪的含量显著影响了软糖的感官质量（图5A,B）。CTE添加组的样品在颜色、风味和整体可接受性方面得分显著高于含有1.5%和2.0% CTE的样品（p<0.05），后者的颜色较深且味道略有收敛。相比之下，所有CTE含量组的质地评分保持一致，表明CTE含量并未显著影响软糖的结构完整性。总体而言，1.0% CTE的含量被认为是最佳的，它提供了自然的颜色、可口的味道和令人满意的质地平衡。关于脂肪含量，含有6% Anchor黄油的样品在味道（4.20±0.55）、质地（4.60±0.55）和整体可接受性（4.80±0.50）方面获得了最高的评分，表明口感更佳且黄油香味更和谐。虽然3%脂肪的样品香气令人愉悦，但其味道和质地并不理想。值得注意的是，6%脂肪的配方并未对花青素的颜色稳定性产生负面影响，并被认为保持了最佳的整体感官质量。根据这些发现，最佳配方确定为含有1.0% CTE和6.0%黄油，并被选为进一步评估物理化学参数的样本，包括TPA（Total Phenolic Content）、TPC、DPPH抗氧化活性、PV（Polar Viscosity）和TBARS（Turbidimetric Absorbance at 540 nm）在60天储存期内的变化。

3.5.3 存储8周后的TPA质地分析
由于感官评估表明含有超过1.0% CTE的配方不太受欢迎，因此质地分析集中在较低且实际相关的浓度范围（0%–1.0%）上。中间浓度（0.2%和0.6%）被包括在内，以便更清楚地评估CTE对软糖基质机械性能的剂量依赖性效应。在第0周和第8周，使用TPA仪器评估了包括CTE在内的质地属性，如硬度、弹性、粘附性和咀嚼性，以评估CTE在储存过程中对软糖系统机械结构的影响。制备了含有0.0%、0.2%、0.6%和1.0% CTE（w/w）的配方，固定黄油含量为6%，这是通过感官优化确定的。图6显示，随着CTE浓度的增加，软糖的硬度显著降低。1% CTE样品的硬度值最低（1341.59 ± 253.69 g），显著低于0% CTE的阴性对照（2022.52 ± 112.59 g）。这种降低可能归因于CTE中的生物活性化合物（例如花青素、多糖）与明胶网络之间的相互作用，这些相互作用干扰了凝胶化过程。弹性显示出浓度依赖性的增加，1% CTE样品达到了最高的值（1.21 ± 0.03 mm）。这表明CTE可能作为一种功能性添加剂，通过与其与明胶的灵活相互作用来增强凝胶基质在变形后的恢复能力（Garrido等人，2015年）。相比之下，0% CTE的阴性对照显示出显著较低的弹性值，在整个8周的储存期间保持稳定。CTE含量还强烈影响了粘附性，随着提取浓度的增加而增加。1% CTE样品的粘附性最高（-79.07 g·sec）。这种增加可能是由于CTE成分（如花青素）的亲水性，它们可以增加表面湿度并提高粘性（Ozcan等人，2024年）。储存后的粘附性变化很小，表明在密封条件下表面结构是稳定的。随着CTE浓度的增加，咀嚼性降低，这可能是由于多酚化合物对明胶网络的破坏性作用，减少了弹性和凝胶的凝聚力。0.6% CTE样品的咀嚼性最低，而阴性对照显示最高。储存8周后，所有样品的咀嚼性都有轻微的降低（< 8.5%）。总体而言，在密封储存8周后，观察到的质地参数变化可以忽略不计。这些发现表明，富含CTE的软糖的凝胶结构随时间保持稳定。此外，CTE有助于将质地特性调整为更柔软、更有弹性和更灵活的一致性，这与消费者的感官偏好相符。图6展示了储存8周后CTE脂肪强化软糖的TPA结果。列上不同的字母表示统计学上的显著差异（p < 0.05）。数值以平均值±标准差表示（n = 3）。添加了1.0% CTE的软糖在所有测试配方中显示出最佳的质地特性。它具有最高的弹性、最低的硬度和最高的、稳定的粘附性，从而提供了柔软、有弹性和令人愉悦的咀嚼口感。所有质地参数在8周的储存期间保持稳定。因此，1.0% CTE被认为在提高和维持软糖产品的感官质量方面是有效的。选择这一浓度来监测储存8周期间TAC、TPC和DPPH抗氧化活性的变化。

3.5.4 储存期间的生物活性
图7（A、B、C）展示了添加了1.0% CTE的软糖在8周储存期间TPC、TAC和DPPH抗氧化活性的变化。结果显示这三个指标都逐渐下降，TPC从2.58 mg GAE/g糖果下降到1.41 mg GAE/g糖果（约45.3%的减少），TAC从0.10 mg/g下降到0.05 mg/g（约50%的损失），DPPH抗氧化活性值从14.12 μmol TE/g下降到7.80 μmol TE/g（约44.8%的减少）。这种下降趋势归因于酚类化合物由于暴露于热、光和氧气而降解，以及它们参与自由基清除机制。此外，明胶和酚类化合物之间的相互作用可能限制了这些化合物的生物活性，导致储存期间含酚类化合物的软糖产品中TPC、TAC和DPPH抗氧化活性值的下降（Qi等人，2023年）。因此，加入1% CTE可以增强初始的生物活性值，并有助于在长期储存期间更好地保持这些特性。

3.5.5 脂质氧化（PV，TBARS）
如图8所示，使用过氧化物值（PV）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）作为氧化标志物，评估了CTE软糖在8周储存期间的抗氧化活性。阴性对照由不含任何抗氧化添加剂的糖果组成，而阳性对照添加了0.2%（w/w）的维生素E。实验样品的CTE浓度分别为0%、0.5%和1%（w/w）。PV水平在初始储存阶段（第0-3或4周）增加，表明形成了过氧化物，随后由于这些初级氧化产物的降解而下降。阴性对照在第三周达到了最高的PV值（3.48 meq/g），突显了在没有抗氧化剂的情况下明显的脂质氧化。相比之下，1% CTE样品在较晚的时间点（第5周）达到了较低的PV峰值（2.77 meq/g），甚至低于维生素E阳性对照（第4周的2.83 meq/g），表明相对于维生素E，CTE提供了相当或更好的脂质保护。关于TBARS，所有样品在储存期间都显示出总体增加，反映了诸如丙二醛（MDA）等次级氧化产物的逐渐形成。然而，1% CTE样品在第8周记录了最低的TBARS值（0.2189 μg MDA/g），低于阳性对照（0.2636 μg MDA/g）和阴性对照（0.3018 μg MDA/g）。1% CTE样品的TBARS抑制率在第4周达到最高（42.50%），而阳性对照为31.25%，并在第8周仍然显著有效（27.45% vs 12.66%）。这些发现与先前的研究一致，表明富含酚类的植物提取物可以通过中和自由基和抑制过氧化链反应来延缓脂质氧化。因此，CTE表现出比维生素E更高的抗氧化效力，并在更长的时间内保持其保护效果，特别是在1%浓度下。这突显了其作为食品保存中天然抗氧化剂的潜力（Athukorala等人，2005年；Teets和Were，2008年）。图8展示了储存8周后CTE软糖的PV和TBARS值。进一步分析显示，在室温条件下，8周储存期间总花青素含量（TAC）、总酚类含量（TPC）和DPPH抗氧化活性逐渐下降。其中，花青素降解最快，仅保留了初始浓度的73.40%，其次是DPPH（74.48%）和TPC（80.88%）。这些结果证实花青素是抗氧化活性的主要贡献者，但也是最容易降解的，主要通过氧化、糖苷水解以及暴露于光和温度。这种降解趋势与先前的报告一致，表明TAC在30天内损失了约20%（Abdullah，2008年；Vidana Gamage等人，2021年）。此外，添加蔗糖似乎稳定了花青素，延长了半衰期并减少了TPC和DPPH抗氧化活性的损失。这可能也反映了更稳定的多酚类化合物的存在，如黄酮醇，它们在花青素含量下降时有助于维持抗氧化活性（Marpaung和Rizki，2020年）。尽管这项研究表明CTE作为中性pH软糖中的天然色素和抗氧化剂在改善氧化稳定性方面的有效性，但仍有一些工业方面的考虑。与其他蓝色色素如螺旋藻藻蓝蛋白和Genipin基色素相比，CTE通过酰基化花青素和额外的抗氧化功能提供了更好的颜色稳定性。然而，花青素仍然对氧气、光和长时间加热敏感，这可能限制了某些食品系统中的稳定性。CTE的监管批准、允许的使用水平和标签要求因地区而异，这突显了成分标准化和合规性的需求。可扩展性也需要关注，包括提取产量、溶剂回收、原材料变异性和生产成本。虽然乙醇-水提取适用于绿色加工，但工业应用需要工艺优化。最后，花青素的性能取决于基质。尽管软糖系统提供了相对保护的环境，但在饮料、乳制品或高温加工食品中的稳定性可能会有所不同。CTE在软糖系统中的抗氧化性能与其在整个研究期间观察到的组成特性和稳定性行为一致。尽管储存期间花青素含量逐渐下降，但提取物仍有效抑制了脂质氧化，这通过降低的PV和TBARS值得到体现。这表明抗氧化活性不仅依赖于花青素，还得到了共存酚类化合物的支持，从而随时间持续提供抗氧化保护。总的来说，需要进一步的研究来支持工艺放大、法规协调和特定基质的稳定策略，以促进更广泛的工业应用。

4 结论
本研究展示了pH在从C. ternatea中提取和稳定花青素化合物方面的关键影响，C. ternatea是一种富含生物活性成分的天然来源。结果表明，pH 3是最优的，可以最大化TAC，而pH 7则有利于提取TPC和DPPH抗氧化活性。UV-Vis光谱、扫描电子显微镜（SEM）和高分辨率质谱（LC-HRMS）显示，在pH 3和pH 7获得的提取物之间存在显著的结构和组成差异，特别是酰基化花青素衍生物和黄酮醇糖苷的存在。在中性pH（6.8-7.0）下获得的提取物在储存过程中表现出更好的生物活性和天然颜色保持能力。值得注意的是，在1%的浓度下，提取物对脂质氧化的抑制作用比0.2%的维生素E更强，这通过显著较低的过氧化物值（PV）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）得到证明，同时提供了长期的脂质保护。这些发现突显了C. ternatea作为天然色素在富含脂质的食品系统中具有有效抗氧化功能的潜力，有助于开发基于植物衍生生物活性化合物的清洁标签功能性食品。

作者贡献
Thi Anh Dao Dong：概念化、研究方法、写作 - 审查和编辑、验证、监督、正式分析、原始草稿的撰写。
Ng?c Anh Le：研究方法、软件、数据管理、正式分析、研究。
Thi Thu Tra Tran：研究方法、研究、数据管理、正式分析、验证。
Kha Duyen Nguyen：研究、原始草稿的撰写、研究方法、验证、软件、正式分析、数据管理、资源、可视化。

致谢
我们感谢胡志明市技术大学（HCMUT）和VNU-HCM对这项研究的支持。

资金
本研究没有接受外部资助。

利益冲突
所有作者都已阅读并同意手稿的发表版本。作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
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