冷冻对骆驼肌纤维蛋白纳米结构及其技术功能特性的影响：来自原子力显微镜的见解

《Food Science & Nutrition》：Impact of Freezing on the Nanoarchitecture and Techno-Functional Properties of Camel Myofibrillar Proteins: Insights From Atomic Force Microscopy

　　摘要

本研究首次全面评估了长期冷冻储存后骆驼肌原纤维蛋白的纳米级和功能特性。通过结合原子力显微镜（AFM）、生化测定和电泳技术，研究了股二头肌和腰长肌在新鲜状态和冷冻保存状态（-20°C下保存1年）下的结构完整性、凝胶形成能力和蛋白质稳定性，包括模拟凝胶形成的加热后的情况。AFM显示，冷冻样品的结构发生了显著变化，特别是在腰长肌中，表现为表面粗糙度增加、纤维结构破坏以及横截面尺寸增大。这些纳米级变化伴随着溶解度的提高和表面疏水性的增强，同时硫化氢基团的活性显著降低，导致氧化、聚集以及凝胶基质的稳定性受损。相比之下，新鲜样品保持了紧凑均匀的网络结构，表面更加光滑，反映了更好的分子组织和功能完整性。SDS-PAGE分析证实了关键肌原纤维蛋白（如MHC、肌动蛋白、α-肌动蛋白、原肌球蛋白T和MLC）的逐渐降解，而冷冻保存的腰长肌样品还出现了额外的低分子量条带，表明发生了广泛的蛋白水解。这些结构变化与凝胶凝聚力的降低和潜在的水分保持能力下降有关，这些都是基于肌肉的食品系统中的关键质量属性。总体而言，本研究表明长期冷冻会导致肌原纤维蛋白的纳米级结构和功能显著不稳定，其反应程度取决于不同肌肉的组成。

1 引言

肉类是全球高质量膳食蛋白质的主要来源。在各种动物物种中，骆驼肉是一种有价值但未得到充分利用的蛋白质来源，尤其是在骆驼分布广泛的干旱和半干旱地区（Abduku等人，2025年）。除了营养价值外，消费者对骆驼肉产品的接受程度很大程度上取决于感官属性，如颜色、质地和风味，这些属性与肌肉蛋白质的结构和功能密切相关（Choi和Kim，2009年；Wu等人，2024年）。肌原纤维蛋白（MPs）主要由肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和原肌球蛋白T组成，约占总肌肉蛋白质的60%-70%（Xiong，1994年）。这些蛋白质不仅驱动肌肉收缩，还在决定加工肉制品的功能特性方面起着关键作用，特别是凝胶形成能力、水分保持能力（WHC）和质地特征（Sun和Holly，2011年）。肌球蛋白作为关键成分，构成了蛋白质凝胶的结构骨架，而肌动蛋白通过与肌球蛋白的相互作用来维持凝胶的完整性并提高嫩度（López-Bote，2017年；Wang等人，2020年）。鉴于其功能重要性，MPs对于基于肌肉的食品的功能表现至关重要，尤其是在质地、WHC和形成稳定凝胶基质的能力方面。这些宏观特性受蛋白质组装的纳米级组织结构的控制，而这种结构对环境压力（如冷冻和热处理）非常敏感（Foegeding和Davis，2011年）。冷冻和长期冷冻储存是常用的保鲜方法，旨在延长肉制品的保质期并保持其微生物和感官质量（Coombs等人，2017年；Coria-Hernández和Meléndez-Pérez，2024年；Li等人，2018年）。然而，这些过程也可能促进蛋白质变性、氧化和聚集，最终导致结构完整性的下降和功能性能的受损（Arokiyaraj等人，2024年；Xu等人，2020年）。了解这些分子变化，特别是在纳米/微观尺度上的变化，对于优化保鲜工艺和提高加工肉制品的质量至关重要。为了研究这些纳米级变化，采用了多种分析技术，包括X射线晶体学、拉曼光谱、圆二色性和电子显微镜，以阐明蛋白质构象和分子相互作用（Guo等人，2017年；Jiang等人，2025年；Ringe和Petsko，1986年；Wang、Sun等人，2017年；Xu等人，2011年）。其中，原子力显微镜（AFM）作为一种高分辨率成像工具脱颖而出。AFM能够实现纳米级蛋白质表面拓扑结构的三维（3D）可视化，并提供关于蛋白质构象、聚集和表面形态的定性和定量信息，且无需复杂的样品制备（Arredondo-Tamayo等人，2023年；Ding等人，2019年；Emam-Djomeh等人，2020年；Obeid和Guyomarc’h，2020年；Shi等人，2019a）。在食品蛋白质研究中，AFM已成功应用于牛奶、鱼类和多种肉类的蛋白质表征（Foegeding和Davis，2011年；Shi等人，2019b）。值得注意的是，它在分析直接影响蛋白质功能和食品质量的体积和形态变化方面表现出色（Fuentes-Perez等人，2013年）。然而，尽管AFM具有潜力，但在骆驼肉研究中的应用仍然不足，特别是在MPs的结构表征方面，这成为当前文献中的一个重要知识空白。本研究旨在通过使用AFM来研究从骆驼的股二头肌（BF）和腰长肌（LL）中提取的MPs的纳米级结构和热行为，比较新鲜样品和冷冻保存1年的样品（-20°C）。此外，还进行了补充的生化测定、溶解度、表面疏水性（SurH）和活性硫化氢（R-SH）含量分析，以及电泳分析，以将纳米级结构与功能和分子稳定性联系起来。这一综合分析框架为冷冻引起的结构变化提供了新的见解，有助于开发更好的骆驼肉和其他未充分利用的蛋白质资源的保鲜和加工策略。

2 材料与方法

2.1 伦理声明

本研究使用的骆驼肌肉样本来自阿尔及利亚El Oued市授权屠宰场为常规商业肉类生产而宰杀的成年单峰骆驼。没有动物是专门为研究目的而被宰杀的，因此根据阿尔及利亚法律（法律88-08；执行法令95-363；1999年11月21日部长级命令），不需要伦理委员会的批准。所有屠宰程序均符合阿尔及利亚的清真法规，并遵循国际标准中的良好动物处理和福利实践（指令2010/63/EU）。

2.2 材料

样本来自七只年轻的雄性撒哈拉单峰骆驼（Camelus dromedarius，2-3岁，活体重125-250公斤）的腰长肌（LL，腰部区域）和股二头肌（BF，大腿后部）（“通常称为‘longissimus dorsi’的肌肉的推荐术语”，1990年）。根据阿尔及利亚的规定，仅使用雄性骆驼，因为雌性骆驼的屠宰是被禁止的。这些在当地被称为Hashi的年轻骆驼在宰杀前经过12小时的禁食，遵循清真程序，在阿尔及利亚Oued Souf的商业屠宰场进行宰杀（Al-Owaimer等人，2014年；Smili等人，2022年）。尸体在死后12小时内保持在12°C，随后在4°C下冷却24小时，以确保采样前的适当状态。冷却后，从每个尸体的腰椎中取出LL肌肉，从后肢中取出BF肌肉。对于每种肌肉类型，将七个尸体的组织切成大约15克的块，并分别彻底混合（LL独立混合；BF独立混合），以生成两个代表采样群体的不同复合肌肉批次。在每种肌肉类型内部均质化后，将混合材料分为两种保存处理：新鲜和长期冷冻。每种处理包括12个等份（每个约150克），并真空密封在Cryovac袋中。新鲜样本在4°C下冷藏24小时，然后立即进行分析；而冷冻保存的样本在-20°C下冷冻1年，然后在4°C下解冻16小时再进行长期稳定性分析（Park等人，2007年；Setyabrata和Kim，2019年）。对于每种肌肉-处理组合，进行了3-5次独立实验。在每次实验中，使用从相应混合肌肉批次中随机选取的一个真空密封部分进行分析。因此，后续的分析测量代表了对复合肌肉材料进行的技术/实验重复。

2.3 肌原纤维蛋白的制备

肌原纤维的分离按照Park等人（2007年）和Hu等人（2021年）描述的程序进行。所有制备步骤都在4°C以下进行。解冻并切碎的LL和BF肌肉组织与4体积（w/v）的分离缓冲液混合，该缓冲液包含3.9 mM KH2PO4、6.1 mM KHPO4、0.1 mM NaCl、2 mM MgCl2和4 mM EDTA，pH值为7.0。混合物在T10 Basic S25匀浆器（IKA Co.，德国）中匀浆30秒。接下来，将肌肉匀浆物在4000 g下离心15分钟，然后弃去上清液。得到的沉淀物用4体积的相同分离缓冲液清洗三次，使用上述相同的混合和离心条件。随后，肌原纤维沉淀物用4体积的0.1 mM NaCl再清洗三次，最后一次清洗时，通过四层纱布过滤MP悬浮液（MPS）以去除结缔组织。MP分离物（MPI）分散在含有0.1 mM NaCl的溶液中，并在4°C下过夜储存以供进一步分析。此外，冷冻保存1年的样本也按照上述MP分离的相同程序进行处理。

2.4 蛋白质溶解度的分析

MPS在8000 g下离心15分钟。使用Bradford方法通过分光光度计（Thermo Scientific Helios Zeta UV–Vis）测定蛋白质浓度。然后，蛋白质溶解度（S%）定义为上清液中的蛋白质浓度（Cafter）与原始MPS中的蛋白质浓度（Cbefore）的比率（Wang、Xiong和Sato，2017年）；计算公式如下：

2.5 表面疏水性的测定

表面疏水性（SurH）使用溴酚蓝（BPB）作为疏水探针进行测定，方法参考Chelh等人（2006年）和Zheng等人（2019年），并进行了一些修改（Chelh等人，2006年；Zheng等人，2019年）。将MPS调整至2 mg/mL的浓度。然后，向1 mL MPS中加入20 μL BPB溶液（1 mg/mL），在室温下搅拌20分钟。混合物在2000 g下离心15分钟。测量上清液的吸光度（Asample）。为了测定对照吸光度（Acontrol），使用0.1 mM NaCl代替MPS。SurH通过结合的BPB浓度表示，计算公式如下：

2.6 活性硫化氢含量的测定

活性硫化氢（R-SH）含量根据Ellman等人（1961年）的方法测定。为此，将5 mL稀释的MPS与100 μL 5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB，10 mM，pH 8.0）混合。混合物在室温下避光放置30分钟，然后离心。测量上清液的吸光度（412 nm）。稀释后的MPS浓度使用Bradford方法测定。R-SH含量根据摩尔消光系数（?）= 13,700 M?1 cm?1计算，公式如下：

2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE用于根据Maqsood等人（2015年、2016年、2018年）的方法测定MPs的结构变化，但进行了一些修改。首先，准备SDS-PAGE运行缓冲液（25 mM Tris、250 mM glycine、0.1% (w/v) SDS）和样品加载缓冲液（1 M Tris–HCl缓冲液，pH 6.8、4% (w/v) SDS、20% (v/v) glycerol、0.2% (w/v) BPB、10% β-mercaptoethanol）。使用一个蛋白质标准品（17–250 kDa）作为蛋白质标记物。混合物在沸水中加热5分钟以完全溶解蛋白质，然后在室温下冷却。将5 mg/mL的样品（10 μL；包括加载缓冲液）加载到每个孔中。使用4%丙烯酰胺堆积凝胶和12%丙烯酰胺分离凝胶进行SDS-PAGE。染色和脱色过程中使用Coomassie Brilliant Blue R-250、乙醇和醋酸。使用Bio-Rad Gel Doc XR+成像系统（Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚）对凝胶图像进行成像。使用Bio-Rad的Image Lab版本5.1软件分析凝胶图像。

2.8 原子力显微镜

使用AFM（Bruker Multimode 8，Veeco Co.，Plainview，美国）在常温条件下评估MPs和MP凝胶的表面形态和纳米级结构特征，方法参考Hu等人（2021年；Mills等人，2001年），并进行了一些修改。根据最近的纳米成像协议（Ding等人，2019年；Shi等人，2019a）的最佳实践，AFM能够以分子级分辨率可视化蛋白质表面结构。对于蛋白质颗粒，将50 μL的MP溶液（1 mg/mL）滴在新鲜切割的云母上，并在室温下干燥15分钟。然后用超纯蒸馏水冲洗样品以去除未结合的物质，然后空气干燥。对于MP凝胶的形成，将MP在70°C的水浴中热处理1小时，然后在室温下自然干燥，以制备适合AFM扫描的凝胶相样品。使用Nanoscope 9.0软件以轻敲模式进行成像，保持低接触力（< 1 nN）以最小化样品变形。扫描分辨率分别为2.0 × 0.2 μm和650 × 650 nm，扫描频率为0.996 Hz。数据采集使用Nanoscope Analysis 1.5软件（Bruker Co.，Santa Barbara，CA）进行定量图像分析，以便进行高度剖面评估和形态量化，如表面粗糙度、纤维宽度和聚集物直径。

2.9 统计分析

所有统计分析均使用XLSTAT软件（版本10.0；Addinsoft，纽约，美国）进行。实验设计基于混合样本策略。对于每种肌肉类型（腰长肌和股二头肌），从七具独立的骆驼尸体中获取的组织（n=7个生物来源）被切碎、充分混合并均质化，以生成代表研究群体的复合肌肉样本。腰长肌（LL）和股二头肌（BF）分别被合并，并保持为独立的实验单元。均质化后，每个合并的肌肉样本被分为两种保存处理：新鲜（4°C下24小时）和长期冷冻（-20°C下1年）。由于冷冻处理应用于来自相同合并肌肉材料的部分，实验单元对应于合并的肌肉样本而不是单个动物。因此，设计并没有构建为一个完全的因子模型，每个因子组合都没有独立的生物重复。因此，没有正式测试交互项（肌肉×保存），以避免伪重复和违反独立性假设。统计比较是根据实验层次结构进行的：

配对t检验用于评估每种肌肉类型内冷冻的效果（新鲜与冷冻的LL；新鲜与冷冻的BF）。独立的t检验用于比较同一保存状态下的LL和BF（新鲜LL与新鲜BF；冷冻LL与冷冻BF）。对于每种肌肉-处理组合，使用从合并肌肉材料中随机选取的真空密封部分进行了3-5次独立实验。所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差（SEM），统计显著性设定为p<0.05。

3 结果

3.1 肌原纤维蛋白特性的变化

为了评估长期冷冻储存对肌原纤维蛋白特性的影响，测量了两种肌肉类型的溶解度、表面疏水性和活性巯基含量，结果总结在表1中。在新鲜状态下，BF（2.84±0.32）和LL（2.90±0.92）之间的蛋白溶解度没有显著差异，这由新鲜组内的相同小写字母表示（p>0.05）。然而，在-20°C下冷冻1年后，两种肌肉的溶解度都有显著增加（p<0.05），BF达到12.20±1.01，LL达到11.69±1.66，这由每种肌肉类型内的不同大写字母表示（新鲜与保存后）。保存后的BF和LL样本之间没有显著差异（保存组内的相同小写字母，p>0.05）。

表1. 肌原纤维蛋白的溶解度、表面疏水性和活性巯基组

| 参数 | 新鲜BF | 保存后的BF | 新鲜LL | 保存后的LL |
|-------|--------|---------|--------|---------|
| 蛋白溶解度 | 2.84±0.32 | 12.20±1.01 | 2.90±0.92 | 11.69±1.66 |
| 表面疏水性 | 4.89±0.37 | 6.78±0.44 | 3.17±0.19 | 7.19±0.013 |
| 活性巯基含量（R–SH） | 65.54±4.22 | 41.72±2.85 | 68.49±2.42 | 36.58±3.38 |

注：小写字母表示同一保存组内两种肌肉类型之间的显著差异（p<0.05）。大写字母表示每种保存组内相同类型肌肉之间的显著差异（p<0.05）。表面疏水性（SurH）显示出与肌肉和保存相关的差异。在新鲜样本中，BF的SurH显著高于LL（4.89±0.37 vs 3.17±0.19），这由新鲜组内的不同小写字母表示（p<0.05）。冷冻储存后，两种肌肉的SurH都显著增加（每种肌肉类型内的不同大写字母，p<0.05），BF达到6.78±0.44，LL达到7.19±0.013。在保存样本中，LL的SurH显著高于BF（保存组内的不同小写字母，p<0.05）。活性巯基（R–SH）含量在新鲜BF（65.54±4.22）和新鲜LL（68.49±2.42）之间没有显著差异，这由相同的小写字母表示（p>0.05）。相比之下，冷冻储存显著降低了两种肌肉的R–SH水平（每种肌肉类型内的不同大写字母，p<0.05），BF降至41.72±2.85，LL降至36.58±3.38。在保存样本中，BF的R–SH含量仍显著高于LL（保存组内的不同小写字母，p<0.05）。

3.2 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE分析

图1展示了在新鲜和保存（-20°C下1年）条件下从单峰骆驼（Camelus dromedarius）的股二头肌（BF）和腰长肌（LL）中提取的肌原纤维蛋白的电泳谱。根据分子量标记和先前的研究（Khatri和Huff-Lonergan 2023；Maqsood等人2015, 2016；Wu等人2024），识别出主要条带，分别对应于肌球蛋白重链（MHC，216–240 kDa）、α-actinin（103 kDa）、actin（43 kDa）、troponin T（TT，33 kDa）和肌球蛋白轻链（MLC，17–23 kDa）。图1显示了在新鲜（F）和保存（P，-20°C下1年）条件下从骆驼股二头肌（BF）和腰长肌（LL）中提取的肌原纤维蛋白的SDS-PAGE谱。主要条带被初步分配，基于分子量标记和先前的骆驼肌肉研究（Maqsood等人2015, 2016, 2018）。在BF肌肉中，长期冷冻储存引起了有限的修饰。MHC（3.78%）和actin（5%）略有减少，而MLC（17 kDa）和MLC（23 kDa）分别减少了18%和73%。α-actinin和TT相对稳定。相比之下，保存后的LL样本显示出几种主要蛋白质的显著降解。MHC减少了35%，α-actinin减少了24%，actin减少了21%，而TT和MLC（17 kDa）分别减少了72%和73%。此外，在保存后的LL样本中出现了75至85 kDa之间的新条带，表明高分子量蛋白质发生了片段化。这些变化的幅度和分布表明，在相同的储存条件下，LL中的肌原纤维蛋白发生了更广泛的修饰。

3.3 肌原纤维蛋白和肌原纤维蛋白凝胶的拓扑变化

3.3.1 肌原纤维蛋白的纳米级结构表征

图2展示了在新鲜（F）和保存（P）条件下获得的肌原纤维蛋白的原子力显微镜（AFM）拓扑图像。在新鲜BF（F.BF）和新鲜LL（F.LL）中，蛋白质颗粒呈现为紧凑的、凸起的域，具有光滑连续的表面。这些结构显示出相对均匀的分布和明确的边界，表明结构组织得到了保持（图2，F.BF和F.LL）。经过长期冷冻储存（-20°C下1年）后，保存的BF（P.BF）和LL（P.LL）都观察到了明显的形态变化。与新鲜样本相比，表面出现了不规则的聚集、凹陷、排列紊乱和粗糙度增加（图2，P.BF和P.LL）。这些变化在LL中比在BF中更为明显。

图3展示了在新鲜（F）和保存（P）条件下，来自股二头肌（BF）和腰长肌（LL）的肌原纤维蛋白颗粒的AFM图像（存储在-20°C下1年）。图3中的敲击模式AFM图像及其对应的三维重建（650×650 nm）进一步证实了这些观察结果。新鲜样本（F.BF和F.LL）显示出圆形的形态，具有相对均匀的高度分布和清晰的边缘（图3）。相比之下，保存样本显示出高度分布不均、域碎片化和不规则的突起，特别是在P.LL中（图），表明了纳米级的结构破坏。

3.3.2 热处理后肌原纤维蛋白凝胶的纳米级结构表征

图5和图6展示了在70°C热处理后肌原纤维蛋白（MP）凝胶的AFM图像。新鲜和保存样本之间观察到了明显的结构差异。图5展示了热处理（70°C）后不同肌肉类型单个蛋白质的敲击模式AFM图像及其对应的三维重建（650×650 nm）。图6展示了在新鲜（F）和保存（P，-20°C下1年）条件下，来自股二头肌（BF）和腰长肌（LL）的肌原纤维蛋白的高分辨率AFM图像。图像中的蓝线、绿线和红线表示用于宽度测量的横截面轮廓（表2）。在新鲜BF和LL凝胶中，AFM图像显示了相对连续和紧凑的凝胶网络，具有连接的蛋白质组装（图5，F.BF和F.LL）。表面形态看起来相对均匀，具有有序的聚集模式和有限的表面不规则性。相应的三维重建显示了具有可控高度分布的紧密网络结构（图5）。冷冻储存和随后的加热后，保存的BF和LL凝胶显示出明显的结构修饰。AFM图像显示了增强的聚集、不规则的聚集、蛋白质组装的侧向扩展和可见的表面异质性（图5，P.BF和P.LL）。这些结构破坏在保存的LL凝胶中更为明显，观察到大的突起和异质的表面域。高分辨率AFM图像进一步详细展示了这些纳米级的变化（图6）。新鲜凝胶显示出相对紧凑的聚集，具有可区分的边界（图6，F.BF和F.LL）。相比之下，保存的凝胶显示出扩大的聚集、碎片化的区域和不规则的表面拓扑（图6，P.BF和P.LL）。为了定量评估这些变化，从高分辨率AFM图像中提取了横截面轮廓，并计算了聚集宽度值（表2）。在BF凝胶中，横截面宽度从新鲜样本的55.06–61.18 nm增加到冷冻储存和加热后的121.35–182.26 nm（表2）。同样，在LL凝胶中，聚集宽度从新鲜样本的111.85–221.37 nm增加到保存和热处理后的217.59–270.55 nm（表2）。在所有处理中，保存的LL凝胶显示出最大的聚集尺寸和最异质的结构组织（表2）。

4 讨论

4.1 肌原纤维蛋白的生化变化

本研究表明，长期冷冻储存后蛋白质溶解度的显著增加表明冷冻诱导了肌原纤维蛋白（MP）颗粒的显著结构变化。Chan等人（2011）、Qi等人（2012）和Tuell等人（2020）也报告了冷冻和解冻后蛋白质可提取性的类似修改（Chan等人2011；Qi等人2012；Tuell等人2020；Wu等人2024；Zhu等人2025）。虽然许多研究描述了由于聚集现象导致的溶解度降低，但Chan等人（2011）报告称火鸡胸肉在冷冻和解冻后的溶解度增加，这与当前发现一致。冷冻引起的肌肉蛋白质变性（Benjakul和Bauer 2000；Benjakul等人2003；Zhu等人2025）可能会破坏蛋白质-蛋白质相互作用并改变构象稳定性，从而改变可提取性。解冻过程中的滴液损失也可能将肌浆蛋白释放到渗出液中，导致可测量的溶解度增加。此外，冷冻过程中的结构重排可能会减少表面疏水性暴露，有利于与周围水分子的更大相互作用，正如Fennema（1996）所建议的（Fennema 1996）。冷冻引起的酶系统变化，如Ca2+-ATPase活性的改变（Jiang等人2019；Li等人2018），进一步支持了冷冻储存期间结构和膜相关的不稳定。同时，保存后观察到的表面疏水性（SurH）的显著增加反映了蛋白质的展开和疏水域的暴露。类似地，在肌肉系统中也记录了冷冻和解冻后SurH的类似增加（Qian等人2019；Xia等人2009, 2010；Zhang和Ertbjerg 2019）。根据Lin和Park（1998）的研究，肌球蛋白纤维具有亲水的外表面和疏水的内部核心；冷冻过程中这种结构组织的破坏可能会暴露隐藏的疏水基团，从而增加测量的SurH（Lin和Park 1998）。此外，pH值依赖性的构象变化可以影响蛋白质的疏水性暴露，正如Chan等人（2011年）和Omana等人（2010年）所证明的那样，他们在高pH值的肉类中观察到了更高的SurH值，这是由于蛋白质的进一步展开（Chan等人2011年；Omana等人2010年）。因此，冷冻储存后SurH值的增加与轻微到中度的蛋白质变性过程一致，这也得到了Farouk等人（2004年）、Lee等人（2024年）和Zhang等人（2022年）的研究支持（Farouk等人2004年；Lee等人2024年；Zhang等人2022年）。同时，活性巯基（R–SH）含量的显著减少表明在长期冷冻过程中肌肉蛋白发生了氧化和构象变化。巯基团具有高度反应性，特别容易发生氧化反应，导致多肽链内部或之间的二硫键形成（Xia等人2009年）。Chan等人（2011年）、Soyer等人（2010年）和Liu等人（2022年）也报告了冷冻储存期间R–SH和总巯基含量的类似减少（Chan等人2011年；Liu等人2022年；Soyer等人2010年）。半胱氨酸残基的氧化会降低巯基的可用性，并促进蛋白质聚集，从而改变蛋白质的功能。此外，pH值引起的结构压缩会进一步限制巯基的暴露（Chan等人2011年）。

4.2 SDS–PAGE揭示的肌肉特异性肌原纤维蛋白变化

SDS–PAGE分析结果显示，单峰骆驼（Camelus dromedarius）的股二头肌（BF）和腰长肌（LL）在长期冷冻储存过程中的反应存在明显的肌肉特异性差异。虽然BF的主要肌原纤维蛋白减少程度相对较小，但LL的MHC、α-actinin、actin、troponin T（TT）和肌球蛋白轻链出现了明显的降解，并且在75至85 kDa之间出现了新的条带。LL中MHC强度的降低以及低分子量片段的出现表明高分子量肌原纤维蛋白发生了部分降解。类似的电泳变化也在冷冻红肉中观察到，并被归因于储存引起的蛋白质变性和片段化（Park等人2007年；Zhang等人2021年）。先前关于骆驼肌肉的研究也发现了相似的主要肌原纤维条带（Maqsood等人2015年、2016年、2018年；Wu等人2024年），这支持了本研究中观察到的降解蛋白的鉴定。TT的显著消失，尤其是在LL中，进一步证实了它对死后蛋白水解的高度敏感性。尽管TT的降解已被提出作为蛋白水解活性的指标，但尚未建立TT损失与肉质嫩度之间的明确正相关关系（Reza Gheisari等人2009年）。因此，这里观察到的TT显著减少应被解释为蛋白质结构变化的证据，而不是功能改善。与BF相比，LL中观察到的更广泛的降解可能反映了其内在的肌肉特性。LL含有更高比例的氧化型I纤维，而BF则富含糖酵解型II纤维（Brandstetter等人1998年；Geay等人2001年）。氧化型肌肉通常具有更高的肌红蛋白含量和代谢活性，这增加了它们在储存过程中的氧化敏感性（Faustman 1993年；Faustman等人2010年）。研究表明，氧化应激会促进肌球蛋白的修饰和片段化（Andersen等人2007年；Park等人2007年；Wu等人2024年），这与本研究中观察到的LL中更严重的MHC降解一致。此外，冷冻引起的结构损伤可能会增强内源性蛋白酶（如calpains和cathepsins）的释放和活性（Coria-Hernández和Meléndez-Pérez 2024年；Geesink等人2006年；Koohmaraie和Geesink 2006年）。LL和BF之间的肌肉结构和水分保持特性的差异可能会影响冰晶的形成和机械破坏程度（Leygonie等人2012a，2012b），从而影响观察到的不同电泳模式。这些发现表明，长时间冷冻储存期间蛋白质的稳定性在不同肌肉中并不统一，受到其内在生化和结构特性的强烈影响，这从LL中观察到的MHC、TT和MLC的显著更大降解中可以得到证明。

4.3 AFM结构变化

原子力显微镜（AFM）观察表明，长期冷冻储存会导致骆驼肌原纤维蛋白发生显著的纳米级结构变化。出现凹陷、表面粗糙度增加、纤维排列紊乱以及横截面尺寸扩大，表明蛋白质结构发生了部分展开和聚集。类似的表面不规则性和结构片段化模式也在冷冻羊肉（Muela等人2015年、2016年；Muela等人2010年、2012年）和牛肉（Wang等人2024年）中观察到，其中冷冻破坏了蛋白质-蛋白质和蛋白质-水之间的相互作用。通过横截面分析量化出的结构膨胀与之前在冷冻肉系统中描述的蛋白质变性和聚集现象一致（Moczkowska等人2017年；Nawaz等人2022年）。在纳米尺度上观察到的形态转变可能反映了在环境压力下蛋白质的加速展开和扩展聚集的形成，涉及氢键的变化和分子间相互作用的增强（Li等人2024年，2023年）。与BF相比，LL肌肉中检测到的更广泛的无序与报道的肌肉特异性结缔组织密度和肌节稳定性变化一致（Adeyemi等人2016年；Sikorski和Ko?akowska 1994年；Xiong 1994年）。这些差异可能解释了LL蛋白质对冷冻诱导的结构损伤的更大敏感性。热处理进一步加剧了分子重组，促进了聚集和凝胶网络的变化（Coria-Hernández和Meléndez-Pérez 2024年；Nanje等人2024年）。在加热过程中也观察到了类似的结构转变，这在食品蛋白和水胶体系统中也有报道（Hedayati等人2022年；Mills等人2001年；Zhang等人2024年；Zielbauer等人2016年）。加热过程中形成的不规则聚集物归因于活性基团的暴露和分子间相互作用的增强（Lee等人2024年；Mackie 1993年）。在保存样本中观察到的扭曲表面拓扑结构，特别是在LL中，类似于之前在冷冻鱼肌肉中描述的纳米级破坏（Pornrat等人2007年）。使用高分辨率AFM在肌肉蛋白系统中也报告了类似的纳米级结构变化（Ding等人2019年；Fuentes-Perez等人2013年；Jiang等人2025年；Shi等人2019a，2019b年）。Hu等人（2021年）证明，经过磷酸盐处理的肌肉蛋白表现出改善的结构组织和凝胶形成（Hu等人2021年）。相比之下，本研究中缺乏稳定添加剂可能导致冷冻储存和后续加热后观察到的更异质和扩大的聚集结构。这里观察到的累积结构变化与冷冻储存和热处理过程中肌原纤维蛋白结构的逐步不稳定一致。

4.4 综合多尺度机制解释

本研究提供了对骆驼肌原纤维蛋白在长期冷冻储存和随后加热过程中结构演变的综合多尺度解释。通过结合生化分析（溶解度、表面疏水性、活性巯基含量）、SDS-PAGE谱分析和AFM纳米成像，结果描述了一个从分子氧化和展开到超分子聚集和凝胶网络破坏的层次化过程（Huff-Lonergan和Lonergan 2005年；Xiong 1994年）。冷冻储存引起的氧化变化通过表面疏水性的增加和活性巯基含量的减少得到证实，表明埋藏的残基暴露和巯基氧化，有可能形成二硫键（Xia等人2009年）。SDS-PAGE进一步通过主要肌原纤维蛋白的部分降解和条带强度的降低确认了分子的不稳定。尽管储存过程中溶解度增加，但这可能反映了部分展开蛋白质的提取能力增强，而不是结构稳定性的提高，这突显了不同分析方法之间的敏感性差异。AFM观察提供了这些分子事件的纳米级确认。保存的样本显示出扩大的聚集物、增加的表面粗糙度、紊乱的纤维排列和扩大的横截面尺寸，直接可视化了从生化和电泳数据推断出的聚集现象（Dong等人2020年；Jiang等人2025年）。这些结构变化与氧化展开促进疏水相互作用和二硫键交联一致。70°C的热处理进一步加剧了聚集，产生了更粗糙和更异质的凝胶网络结构（Coria-Hernández和Meléndez-Pérez 2024年），特别是在之前冷冻的样本中（Mackie 1993年；Nanje等人2024年）。冷冻和加热的联合效应表明向不可逆聚集路径和结构紧凑性降低的方向发展。肌肉间的差异是明显的，LL样本显示出更大的巯基消耗、更强的聚集行为和更显著的纳米级破坏。这些发现为LL更高的氧化敏感性提供了直接的实验支持，并加强了肌肉内在特性与结构不稳定之间的机制联系。总体而言，生化指标、电泳模式和AFM纳米结构之间的强烈一致性支持了一个连贯的机制序列，即冷冻储存启动了氧化展开和分子不稳定，导致聚集和超分子重组，这些变化在加热过程中进一步放大。这种多尺度整合增强了解释的可靠性及其对于理解冷冻储存和热处理过程中肌肉蛋白功能的相关性。

4.5 局限性

本研究仅关注了一种长期的冷冻储存条件（-20°C下储存1年），这限制了解释的范围。由于只评估了一个储存时间和温度，因此无法建立全面的时间依赖性或温度依赖性关系。商业肉类供应链通常涉及较短的储存时间和可变的温度条件。因此，这些发现应被解释为对长期冷冻储存的结构和分子反应的反映，而不是代表所有工业保存实践的多样性。研究没有包括对经典技术功能参数（如水分保持能力或仪器质地）的直接测量。因此，无法确定分子变化与宏观质量属性之间的因果关系。相反，研究集中在生化和纳米结构指标上，包括蛋白质溶解度、表面疏水性、活性巯基含量、电泳模式和AFM形态，这些被广泛认为是蛋白质变性和聚集的敏感标志物。因此，主要目标是描述多个分析尺度上的结构演变，而不是量化最终产品的性能。只检查了两种骆驼肌肉，即股二头肌（BF）和腰长肌（LL）。尽管这些肌肉在代谢和结构特征上有所不同，并且在商业上具有相关性，但它们并不代表骆驼尸体中存在的所有纤维组成。研究的目的不是提供所有骆驼肌肉的全面描述，而是比较不同肌肉类型对长期冷冻的分子和纳米结构水平的响应。

4.6 未来方向

本研究的发现为进一步研究提供了几个方向，旨在加强机制理解和工业应用性。由于实验设计仅专注于一个长期的冷冻储存期（-20°C下储存1年），因此无法完全描述蛋白质不稳定的时间演变。未来研究包括较短和中等储存期限（例如1个月、3个月和6个月）将有助于更清晰地区分冷冻引起的即时变化和与储存相关的渐进性氧化或聚集现象。这样的方法将澄清本研究中观察到的结构变化是逐渐发展的、达到平台期，还是在更接近商业实践的条件下呈现非线性进展。未来的工作还应结合经典的技术功能测量，包括水分保持能力、烹饪损失、凝胶强度和仪器质地。将这些宏观参数与分子和纳米结构指标结合起来，将能够增强结构-功能的相关性，并提高生化标志物对肉类质量评估的预测价值。将分析扩展到具有不同解剖和代谢特征的额外肌肉类型，将增强普遍性，并提供对肌肉对冷冻储存的更广泛理解。

5 结论

本研究进行了综合的生化、电泳和纳米尺度分析，以阐明骆驼肌原纤维蛋白在长期冷冻储存（-20°C下储存1年）和随后热处理过程中的结构演变。结果表明，冷冻储存显著改变了蛋白质的构象和稳定性，表现为表面疏水性的增加、活性巯基含量的减少以及主要肌原纤维蛋白的电泳谱的变化。与股二头肌相比，腰长肌（LL）中的MHC、TT和MLC的部分降解尤为明显。AFM观察进一步证实了显著的纳米级重组，包括表面粗糙度的增加、纤维排列的紊乱以及聚集结构的扩大，特别是在保存和加热后的样本中。热处理加剧了聚集现象，表明冷冻引起的分子不稳定使蛋白质在加热过程中更容易发生进一步的结构重组。总体而言，长期冷冻储存后随后的加热引发了渐进的氧化和构象变化，损害了骆驼肌原纤维系统的结构完整性，肌肉间的敏感性差异得到了明显体现。这些发现为理解冷冻骆驼肉的质量变化提供了结构基础，并为优化工业应用中的储存时间和处理条件提供了宝贵的指导。

作者贡献

Ramdani Nacira：数据管理、研究、方法论、资金获取。Bendjaballah Sandra：数据管理、软件、正式分析。Cherb Nora：数据管理、监督、正式分析、方法论。Rahmani Abderrahmen：数据管理、研究、方法论、资源。Ahmed-Laloui Hamza：概念化、项目管理、资源、验证、可视化、写作——初稿。Seid Mahdi Jafari：正式分析、方法论、验证、可视化、写作——审阅和编辑。Maqsood Sajid：数据管理、可视化、验证、监督。

致谢

我们感谢生物技术研究中心（CRBt）提供的指导和设施，感谢科学研究和技术发展总局（DGRSDT）的支持，感谢巴塞罗那大学的Jordi Diaz博士的专业建议，以及CRBt的Issaad Fatima Zahra博士的宝贵帮助。

作者声明没有利益冲突。数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获取。