高灵敏度电化学生物传感器的开发及其对多诺酸的检测，以及多诺酸对人类干细胞和类神经元细胞的影响

《Food Science & Nutrition》：Development of a High-Sensitivity Electrochemical Biosensor for Domoic Acid and Its Cellular Impact on Human Stem and Neuron-Like Cells

　　**摘要**

软骨藻酸（DA）是一种重要的环境神经毒素，由某些类型的海洋藻类产生，并可能累积在诸如凤尾鱼、沙丁鱼和贻贝等海产品中，而这些海产品通常被认为是健康的并且在全球范围内被广泛消费。其中一个最重要的问题是需要采取必要的措施来防止水和海洋污染，并在食用海产品之前进行适当的安全控制。本研究旨在开发一种高灵敏度的电化学生物传感器系统，用于检测海产品中的DA，以帮助监测海洋污染。此外，还研究了在食品与药品管理局（FDA）允许的最高浓度以及本研究中确定的浓度下，DA对人类细胞的细胞毒性。使用来自羊水的间充质干细胞（hAF-MSCs）和人类神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）作为类神经元细胞模型，分析了与细胞毒性反应、DNA修复和神经毒性相关的基因表达。在48小时的暴露时间内，DA并未显著影响hAF-MSCs或SH-SY5Y细胞的活力，但在100 μg/mL的浓度下，其活力略有下降。DA激活了hAF-MSCs中的谷氨酸受体，但在SH-SY5Y细胞中则没有这种效应。它还降低了hAF-MSCs的DNA修复能力，尽管其对活力和增殖的影响可能在48小时内并未显现。在75 ng/mL的DA浓度下，基因表达没有变化，这表明了FDA设定的可耐受日摄入量是安全的。SH-SY5Y细胞表现出对DA的抵抗力，表明它们增强了DNA修复能力，从而防止了细胞凋亡和死亡。这一点也得到了与DNA修复相关的基因以及膜转运蛋白基因ABCG2上调的支持。

**1 引言**

食源性疾病与污染食品的病原体、毒素和其他污染物有关，对人类健康构成了严重威胁。根据“世界疾病控制与预防中心”的报告，水生动物、鱼类、甲壳类动物和软体动物是食源性疾病暴发的三大主要商品。2016年，鱼类产品是与最多暴发事件相关的单一食品类别（疾病控制与预防中心 [CDC] 2017）。鱼类和贝类可能含有高浓度的甲基汞和软骨藻酸（DA）。DA是一种神经毒素，是海藻Pseudo-nitzschia和Nitzschia navis-varingica产生的类似海人酸的物质（Tenorio等人 2021）。通过生物累积，它可以进入食物链并最终影响人类。当摄入超过一定量的DA及其异构体时，可能导致短期或永久性的记忆丧失、中毒、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、头晕、头痛、迷失方向、抽搐、昏迷，甚至死亡（华盛顿州卫生部，无日期）。因此，DA被认为是一种重要的环境神经毒素，对人类和野生动物的健康与安全构成全球性风险（Lefebvre和Robertson 2010）。如今，DA在凤尾鱼、沙丁鱼和贻贝等海产品中的危险性正在迅速增加，而这些海产品被许多人认为是健康的并受到广泛消费。美国食品与药品管理局（FDA 1993）对DA的最大摄入量进行了限制，这要求在食用海产品之前采取必要的措施来防止水和海洋污染。传统的检测方法需要一些先进的工具和训练有素的人员来识别细菌病原体和毒素，但这些方法耗时且繁琐。电化学生物传感器，特别是与电化学阻抗谱（EIS）等先进技术结合使用时，在表面分析应用中显示出巨大潜力。一个显著的进步是使用纳米材料修饰电极表面，以提高灵敏度和特异性（Li等人 2025；Zhang等人 2023）。因此，本研究的一个目标是开发一种高灵敏度的电化学生物传感器系统，用于检测海产品中的DA，并进一步研究不同浓度下的DA对活细胞的毒性，以及与细胞对细胞毒性剂反应相关的基因表达。此外，还研究了DNA修复机制。由于DA可以穿过胎盘，并且与胎儿的神经损伤有关（Shum等人 2020），因此选择了来自胎儿期组织的羊水来源的间充质干细胞（hAF-MSCs）和代表人类神经细胞的SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系作为实验模型。DNA修复是一种重要的机制，可以保护细胞免受DNA损伤的影响，这种损伤可能通过突变开始，有时会导致癌症。遗传不稳定是癌症的主要原因，而DNA修复的错误也是遗传不稳定的一部分。大多数癌症是由于未修复的DNA损伤引起的。DA的浓度是根据文献中报告的具有神经毒性的浓度（Shum等人 2020）、华盛顿州鱼类和野生动物部门确定的最大浓度（无日期）、人类对DA的可耐受日摄入量（TDI）（Kumar等人 2009）以及我们开发的生物传感器检测到的浓度来确定的。简而言之，本研究的目标是：（i）开发一种高灵敏度的电化学生物传感器，用于检测海产品中的微量DA；（ii）研究DA对人类羊水来源的间充质干细胞（hAF-MSCs）和人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞毒性、神经毒性和基因毒性影响。尽管生物传感器的开发和DA的细胞效应分析看起来像是两个独立的部分，但在这项研究中它们是紧密相连的。通过体外测试直接使用海产品中测定的DA浓度来评估其对人类暴露的相关性。因此，这种整合不是随意的，而是为了在一个工作流程中结合环境检测和细胞毒性分析。

**2 材料与方法**

**2.1 电化学实验设置**

为了获得最佳灵敏度、精确度和一致性，确保恒定的环境条件对于电化学实验至关重要。使用Gamry Reference 3000电位计/恒电流计/ZRA仪器进行了EIS研究。使用Echem Analyst来评估获取的数据。在将丝印金电极（SPGEs；DropSens，西班牙奥维耶多）固定后，使用由1 mM potassium ferricyanide（K3[Fe(CN)6）和K4Fe(CN)6（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，德国达姆施塔特）组成的混合溶液在1 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备的氧化还原探针，评估了DA的检测电化学行为。在开路电位（OCP）下，以10 mV的扰动信号进行了阻抗测量。为了减少环境电气干扰，使用了Gamry Faraday笼。DRP-220AT型SPGEs从DropSens购买，相应的连接件也是如此。SPGEs由工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE）组成，分别由金、金和银制成。金工作电极的表面积约为0.1256 cm2（Ko?等人 2021a, 2021b；Ko?和Avci 2024）。

**2.2 研究区域和调查物种**

本研究调查了从土耳其马尔马拉海和黑海沿岸不同地区收集的海洋生物中的DA存在情况。2020年1月和2月冬季期间，在土耳其农业和林业部以及渔业和水产养殖总局的许可下（67852565-140.03.03-E.1415263，2017年6月8日），从土耳其的马尔马拉海和黑海沿岸城市科贾埃利和特拉布宗收集了海洋生物。欧洲凤尾鱼（Engraulis encrasicolus）和贻贝（Mytilus galloprovincialis）直接从海中收集（华盛顿州鱼类和野生动物部门，无日期）。研究的物种包括来自马尔马拉地区的欧洲凤尾鱼和贻贝，以及仅来自黑海地区的欧洲凤尾鱼。图1a显示了从土耳其科贾埃利市（三角形-1）省，即马尔马拉海沿岸获得的欧洲凤尾鱼和贻贝，坐标为40°45′33″N和29°55′22″E。另一个样本是从土耳其特拉布宗市（三角形-2）省，即黑海沿岸获得的欧洲凤尾鱼，坐标为41°03′11″N和39°32′21″E。图1：(a) 显示沿海采样站的土耳其地图（三角形1：科贾埃利，马尔马拉海沿岸；三角形2：特拉布宗，黑海沿岸）；(b) 收集的海产品样本：欧洲凤尾鱼（Engraulis encrasicolus）和贻贝（Mytilus galloprovincialis）；(c) 样品切碎和混合；(d) 在甲醇/水（1:1，v/v）中均质化；(e) 以4000 rpm离心20分钟；(f) 使用0.22 μm甲醇兼容过滤器过滤上清液；(g) 将提取的样本储存在4°C的无菌管中。所有提取步骤都在无菌条件下进行。所有海产品提取物均按照标准化协议制备，包括在1:1甲醇/水（v/v）中均质化、离心、通过0.22 μm膜过滤器过滤，并在4°C下储存。过滤后的提取物随后应用于生物传感器表面并孵育30分钟。每个提取步骤重复三次，以确保生物传感器响应的可重复性和一致性。使用BioRender创建。

**2.3 海产品提取方案**

海产品样本的制备（图1b–e）遵循了伦理批准（埃斯基谢希尔奥斯曼加齐大学动物实验地方伦理委员会，612/2017，2017年7月19日）。整个凤尾鱼和贻贝被切成小块，并使用搅拌机进行均质化。每种均质物与16 mL甲醇/水（1:1，v/v，Merck KGaA/ultrapure，Merck Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿）混合，并进一步均质化至少3分钟。所得混合物以4000 rpm离心20分钟。上清液通过0.22 μm甲醇兼容的注射器过滤器（Minisart RC 25，Sartorius Stedim Biotech GmbH，德国哥廷根）过滤，并在4°C下储存在无菌管中，以备进一步分析。过滤后的提取物随后应用于生物传感器表面并孵育30分钟。每个提取步骤重复三次，以确保生物传感器响应的可重复性和一致性。DA的检测使用在先前优化条件下功能化的SPGEs进行（华盛顿州鱼类和野生动物部门，无日期）。

**2.4 抗软骨藻酸（DA）抗体的生物固定过程**

SPGEs的生物功能化遵循了一个逐步的固定方案（图2a–g）。首先，将10 mM的11-mercaptoundecanoic acid（11-MUA）溶液在乙醇中孵育1小时，以形成自组装单层（SAM），引入羧基团。在乙醇和PBS洗涤后，表面用1:1的50 mM EDC和NHS混合物在柠檬酸缓冲液中活化30分钟。然后，将1.25 μg/mL的streptavidin固定在活化表面上1小时，随后用PBS洗涤。接下来，将1.25 μg/mL的单克隆抗DA抗体（DA）应用1小时。去除未结合的分子后，将海产品提取物或含DA的溶液在功能化电极上孵育30分钟。在开路电位下，使用1 mM [Fe(CN)6]3?/4?和10 mV的幅度进行了电化学阻抗谱（EIS）测量。在这些固定步骤之后，通过向电极表面添加含有DA的溶液（1 ng/mL DA在细胞培养基[CCM]中和1 ng/mL DA在甲醇中）来测试系统。Nyquist图使用Gamry Echem Analyst软件通过Randles等效电路进行建模。除非另有说明，所有抗体固定和样品应用过程中的孵育都是在室温下进行的。所有阻抗测量都在三个独立实验中重复进行。重复实验之间的标准偏差小于5%，表明了出色的可重复性。

**2.4 电化学阻抗谱（EIS）测量**

EIS是一种电分析技术，用于高灵敏度地检测海产品提取物中的DA。EIS通过在不同频率范围内施加小幅度正弦电压并测量系统的阻抗响应，从而实现实时、非侵入性和精确的分子相互作用监测（Vivier和Orazem 2022；Wang等人 2021）。阻抗（Z）是频率（ω）的复杂函数，数学上表示如下：
(1)

该技术通过分析在定义的频率范围内施加的小幅度正弦电压下的交流（AC）响应来测量电化学阻抗。使用EIS技术，通过频率依赖的传递函数来评估界面改性（例如，电流或电位的变化）。在这个方程中，（电压）和（电流）是表示正弦信号幅度和相位的相位因子。术语?（ω）表示输入信号和输出信号之间的相位角。在方程（1）中，ω是角频率，可以定义为，而i是虚数，可以定义为。图3c中所示的等效Randles电路模型被优化用于模拟电化学系统的阻抗行为。在这个框架下，总阻抗Z表示为（Ko?等人，2021b）：
(2)




图3 在图查看器中打开PowerPoint

不同海鲜样品中多米诺酸检测的SPGE阻抗响应的奈奎斯特图。(a) 整个频率范围内的完整阻抗谱，(b) 高频区域的放大视图，(c) 用于数据拟合的等效Randles电路模型，以及(d) 从EIS分析获得的Rct值。电化学阻抗谱（EIS）在1 mM [Fe(CN)6]3?/4 mM磷酸盐缓冲液（PBS）中进行，使用10 mM AC幅度在开路电位下。所有测量均在室温下进行。数据拟合使用Gamry Echem Analyst软件完成。每个样品重复测试三次以确保可重复性，误差条代表标准偏差。使用BioRender创建。Avci, H. (2025) https://BioRender.com/ny0xgpb。在方程（2）中，Re代表电解质电阻，Rct表示电荷转移电阻，Zw对应于Warburg阻抗，恒定相位元件（CPE）指数α及其系数Q。




2.6 抗体固定化SPGE表面的扫描电子显微镜（SEM）分析

通过使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析裸露SPGE和生物固定化SPGE的工作电极表面，确认了表面改性的成功，以评估表面形态的变化。在SEM分析之前，电极至少在干燥器中存放24小时。随后，它们使用碳胶带固定在铝棒上，并使用Hitachi Regulus 8230场发射扫描电子显微镜（FESEM）在10 kV下以二次电子模式成像裸露SPGE和生物固定化SPGE的工作电极区域（图2i,ii）。




2.7 人羊水来源的间充质干细胞（hAF-MSCs）的分离和培养

间充质干细胞（MSCs）是从人羊水中分离出来的，这是患者的医疗废弃物，其使用同意书获得了Eskisehir Osmangazi大学临床研究伦理委员会的许可（80558721/170-07；2016年6月22日）。人羊水来源的MSCs（hAF-MSCs）在Eski?ehir Osmangazi大学的细胞治疗和干细胞生产应用与研究中心进行了表征和冷冻保存。冷冻保存的hAF-MSCs小瓶放在37°C的水浴中几秒钟，然后将细胞重新悬浮在含有10% FBS（Biological Industries，Beit Haemek，以色列）、0.2% primocin（Invivogen，圣地亚哥，美国）和1%（v/v）Glutamax（Sigma-Aldrich，Burlington，美国）的完整DMEM培养基中，并在37°C下以200 × g离心10分钟。细胞用台盼蓝染色（Sigma-Aldrich）计数并计算细胞活力。细胞在75 cm2的培养瓶中以0.5 × 10^6细胞/瓶的密度培养，在含有5% O2和5% CO2的气氛中。每天在显微镜下检查细胞，并每3天更换一次培养基（Gaggi等人，2022）。




2.8 hAF-MSCs的流式细胞术分析

通过流式细胞术鉴定hAF-MSCs的间充质干细胞表面标志物和活力，以确认冷冻保存的细胞保持了其特性。用0.25% trypsin–EDTA（Biological Industries，Beit Haemek，以色列）去除附着在培养皿表面的hAF-MSCs，并转移到含有培养基的试管中然后离心。离心后，沉淀物被悬浮并计数。将1 × 10^6细胞/mL的细胞悬浮在其培养基中。然后在室温下（黑暗条件下）用荧光异硫氰酸酯（FITC）标记的针对CD90、CD73、CD44和MHC-I（HLA-ABC）的单克隆抗体，以及藻红（PE）标记的针对CD25和MHC-II（HLA-DR）的单克隆抗体，和藻蓝蛋白（APC）标记的针对CD45细胞表面标志物的单克隆抗体处理和孵育45分钟。所有抗体均来自BioLegend（圣地亚哥，美国）。洗涤步骤后，沉淀物重新悬浮在400 μL的洗涤液中，并使用Novocyte D3005标准配置（Agilent，Santa Clara，美国）仪器进行读取。分析使用NovoExpress流式细胞术软件（版本1.5.0）（Agilent）（Gaggi等人，2022）。




2.9 SH-SY5Y细胞系培养

人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）从美国类型培养收集中心（ATCC，华盛顿特区，美国）购买。SH-SY5Y细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Invitrogen/GIBCO，Grand Island，NY，美国）、1%（mL/mL）Glutamax（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国）和1%青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国）的RPMI 1640（Capricorn Scientific，Ebsdorfergrund，德国）培养基中维持，并在含有5% CO2和95%空气的湿润气氛中培养。




2.10 细胞活力测定

用于研究细胞效应的DA浓度（0.1–100 μg/mL）是根据以下标准确定的：(i) 电化学生物传感器的检测限（0.59 ng/mL，约为0.5 ng/mL），(ii) FDA规定的TDI（75 ng/mL）（FDA 1993），以及(iii) 用于评估细胞反应的升高DA浓度。这种分层的实验方法旨在全面评估DA的生物效应，涵盖了监管标准、生物传感器的检测能力和与急性暴露相关的阈值。MTT测定用于评估DA的细胞毒性以及将在hAF-MSC和SH-SY5Y细胞实验中使用的升高DA浓度。细胞以5 × 10^3细胞/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C下、恒定湿度和5% CO2条件下培养24小时。细胞分别用0.1、0.5、1、50、75和100 ng/mL以及10、20、30和100 μg/mL浓度的DA处理24和48小时，在37°C下、恒定湿度和5% CO2条件下。之后，向培养物中加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国）的PBS（Capricorn Scientific，Ebsdorfergrund，德国），并在37°C下、黑暗条件下培养2小时。然后去除培养基，并加入100 μL DMSO（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国）以溶解形成的甲酚蓝盐。5分钟后，在微孔板读数器（BIOTEK ELx808IU，Vermont，美国）中测量产物浓度，波长为570 nm。使用相同的实验条件进行了三次独立的生物测定。




2.11 定量逆转录PCR (RT-qPCR)

在hAF-MSC和SH-SY5Y细胞与0.5 ng/mL、75 ng/mL、20 μg/mL和100 μg/mL浓度的DA孵育48小时后，使用GeneAll Hybrid-RTM（GeneAll，首尔，韩国）总RNA分离试剂盒分离总RNA。使用Nanodrop分光光度计（ND-2000，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，美国）测量RNA浓度，然后使用ABT cDNA合成试剂盒（Atlas Biotechnology，安卡拉，土耳其）合成cDNA。PCR反应使用AMPLIFYME SG Universal Mix试剂盒（BLIRT，Gdańsk，波兰）设置；引物序列见表1。所有程序均按照试剂盒制造商的说明进行。使用2^-ΔΔCT方法比较DA处理过的hAF-MSC与对照组（未处理的hAF-MSC）之间的相对基因表达。表1. 本研究中用于RT-qPCR反应的引物序列列表。基因名称
引物序列

GRIA2

正向：5′-TGC ATA CCT CTA TGA CAG TGA CA-3′

反向：5′-AGA ATT ACA CGC CGT TCC TTT-3′

PRKDC (Ko?等人，2021b)
正向：5′-CAC CTC TCT GAG GCT GTG C-3′

反向：5′-CGT CAT GTA AGC ATC AAT CAC C-3′

MRE11
正向：5′-ACA ACC TGC AAG CTC AGT GG-3′

反向：5′-TTA ATA CGC AGC AAA CCA ACA-3′

ATM
正向：5′-TGA TAG TAG TGT TAG TGA TGC AAA CG-3′

反向：5′-CAG CTA AAG GAT TAA TGG CAC CT-3′

BRCA1
正向：5′-ATC ATT CAC CCT TGG CAC A-3′

反向：5′-CAT GGA AGC CAT TGT CCT CT-3′

BRCA2
正向：5′-CCT GAT GCC TGT ACA CCT CTT-3′

反向：5′-GCA GGC CGA GTA CTG TTA GC-3′

XRCC4
正向：5′-CTT GGG ACA GAA CCT AAA ATG G-3′
反向：5′-GAC GTC TCA GGT AGT GAA GAA TCA-3′
KU80
正向：5′-CCC AAA TCC TCG ATT TCA GA-3′
反向：5′-CCC GGG GAT GTA AAG CTC-3′
RAD51
正向：5′-TGA GGG TAC CTT TAG GCC AGA-3′
反向：5′-CAC TGC CAG AGA GAC CAT ACC-3′
KU70
正向：5′-AGA GTG AAG ATG AGT TGA CAC CTT T-3′
反向：5′-CCA AGA GAT CTC GAT CAC TGC T-3′
BCL2 (Trainer和Hardy 2015)
正向：5′-TTG ACA GAG GAT CAT GCT GTA CTT-3′
反向：5′-ATC TTT ATT TCA TGA GGC ACG TT-3′
ABCG2
正向：5′-TT C ACG ATA TGG ATT TAC GG-3′
反向：5′-GTT TCC TGT TGC ATT GAG TCC-3′
CYCS (Vivier和Orazem 2022)
正向：5′-TGT GCC AGC GAC TAA AAA GA-3′
反向：5′-CCT CCC TTT TCA ACG GTG T-3′
TNFA
正向：5′-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3′
反向：5′-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3′
GAPDH
正向：5′-GCA CAA GAG GAA GAG AGA GAC C-3′
反向：5′-AGG GGA GAT TCA GTG TGG TG-3′









2.12 统计分析

所有实验都在不同时间进行了三次独立实验。结果以平均值±标准误差（SE）表示。使用SPSS 20.0进行统计分析。数据使用单因素ANOVA-Tukey的事后检验和配对t检验进行分析。当p < 0.05时，认为实验组和对照组之间的差异具有统计学意义。




3 结果


3.1 毒素检测与分析

在图3中，通过使用SPGE的EIS方法研究了海洋海鲜中多米诺酸的存在，并获得了奈奎斯特图（图3a），该图使用适当的等效Randles电路（图3b）通过Gamry Echem Analyst程序进行了建模。Randles电路模型适用于模拟电极/溶液界面的动力学和扩散过程（Ko?和Avci 2024；Ko?等人，2021a）。通过建模获得的Rct值（图3c）确定了多米诺酸的存在。Rct考虑了从电解质到电极的离子转移以及电极表面层发生的任何变化。该模型中的Rct组分允许定量评估DA与电极表面的结合效率（Jansson和?kerman 2014；Ravalli等人，2013）。在至少重复三次的实验中，通过将制备的贻贝（马尔马拉海）、欧洲凤尾鱼（马尔马拉海）和欧洲凤尾鱼（黑海）提取物孵育在电极上来确定DA。当将含有1 ng/mL DA的甲醇溶液和1 ng/mL DA的CCM溶液应用于固定化的电极时，这些结果证实了生物传感器的正常工作。之后，当将含有海洋生物提取物的溶液施加到生物传感器上时，只有贻贝（马尔马拉海）的Rct值增加，这意味着样品中含有DA。当将欧洲凤尾鱼（马尔马拉海）和欧洲凤尾鱼（黑海）提取物溶液施加到生物传感器上时，未检测到DA的存在，也未观察到DA的存在。欧洲凤尾鱼（马尔马拉海）和欧洲凤尾鱼（黑海）提取物的Rct值没有变化，这支持了它们与DA没有特异性相互作用的事实。为了确定贻贝（马尔马拉海）样品中的DA含量，其中DA的存在通过Rct的增加而被检测到，使用了我们之前出版物（Ko?等人，2021a）中开发的生物传感器校准曲线（Ko?等人，2021a），该曲线使用的是相同的电极和固定方法。使用我们之前研究中开发的生物传感器（Ko?等人，2021a）在相同的条件下（电极类型、固定方法、电化学技术和环境参数），在马尔马拉海地区的贻贝中检测到了0.589635 ng/mL的DA浓度。此外，如图3a的奈奎斯特图所示，生物传感器成功检测到了1 ng/mL的DA（在CCM中）。CCM（细胞培养基）是一种含有牛血清白蛋白（BSA）、氨基酸、激素、血清和类似成分的溶液。通过分析图3d中的Rct值进一步确认了我们的生物传感器对DA在这种复杂介质中的选择性。结果，尽管在马尔马拉海地区的贻贝中发现了微量的多米诺酸，但在来自马尔马拉海和黑海地区的凤尾鱼中未发现DA。这个结果与文献中的研究一致，即贻贝由于其在食物链中的位置和过滤特性，倾向于积累神经毒素如DA（Bernstein等人，2021年）。凤尾鱼中未检测到DA，这可以归因于该物种的代谢特性或暴露于DA的水平较低。总之，这证明了马尔马拉贻贝中存在微量DA，并证明了生物传感器的快速和特异性检测能力。

3.2 细胞活力测定结果

冷冻保存的含有MSCs的小瓶成功解冻并培养后，细胞活力为98%。每天使用相位对比显微镜观察培养的细胞；细胞呈现出成纤维细胞样、纺锤形和星形形态（图4A）。

3.3 RT-qPCR分析结果

为了研究与细胞对细胞毒性物质的反应及DNA修复机制相关的基因表达，分析了PRKDC、MRE11、ATM、XRCC4、BRCA1、BRCA2、Ku80、Rad 51、Ku70、BCL2、ABCG2、CYCS、TNFA和谷氨酸受体GRIA2基因的相对表达。DA的浓度基于以下标准确定：根据MTT分析结果为100 μg/mL；根据华盛顿鱼类和野生动物部门（n.d.）确定的最大浓度为20 μg/mL；根据多米尼克酸对人类的TDI（Tenorio等人，2021年）为75 ng/mL；以及根据生物传感器检测到的浓度约为0.5 ng/mL。将hAF-MSCs与0.5 ng/mL、75 ng/mL、20 μg/mL和100 μmL浓度的DA孵育48小时后，hAF-MSCs中GRIA2的相对基因表达显著上调；浓度越高，表达增加越明显（与对照组相比）（图6A）。关于SH-SY5Y细胞中的GRIA2结果，在0.5 ng/mL、20 μg/mL和100 μmL浓度的DA下，相对基因表达显著下调（与对照组相比）（图6B）。

4 讨论

开发的电化学生物传感器被证明能够有效检测马尔马拉海和黑海地区海洋物种中微量神经毒素DA的差异积累。仅在马尔马拉海的贻贝中检测到DA，这与已建立的生态和生理因素相符。像Mytilus galloprovincialis这样的双壳类动物是滤食性生物，会持续处理大量水，这使它们容易从有害藻类爆发（HABs）中积累毒素（Trainer和Hardy，2015年；Dursun，2021年）。这种行为，加上它们在食物链中的位置，解释了它们比像欧洲凤尾鱼这样的远洋鱼类更容易受到DA污染的原因，后者暴露时间短暂且具有高效的代谢解毒机制（Lefebvre和Robertson，2010年）。两个地区的凤尾鱼中未检测到DA，这可能是因为在采样期间接触Pseudo-nitzschia spp.（主要的DA产生藻类）的程度有限，或者是由于物种特有的代谢途径能够快速消除毒素（Bernstein等人，2021年）。EIS利用其非破坏性、快速响应能力和高灵敏度，将电化学系统的响应转化为可量化的信号，从而能够精确分析电极-溶液界面的动态变化（Koc等人，2019年；Ghorbanpoor等人，2025年；Avci等人，2019年；Crapnell和Banks，2024年）。丝印金电极（SPGEs）因其成本效益、可重复性和生物功能化能力而被广泛使用。将EIS与基于金的SPGEs集成，如本研究中应用的那样，提供了一个快速、无标记且高度敏感的多米尼克酸检测平台（Maduni?等人，2022年）。电化学生物传感器表现出高特异性和灵敏度，在马尔马拉海的贻贝中检测到0.589635 ng/mL的DA微量浓度。DA结合时Rct的增加突显了生物传感器在电极界面捕获抗原-抗体相互作用的能力。这些结果与类似固定化协议的先前校准数据一致，增强了该方法的可重复性。此外，本研究通过测试从电化学生物传感器检测到的水平（0.5 ng/mL）到监管限制（75 ng/mL）以及急性暴露范围（20–100 μg/mL）的各种DA浓度，提供了环境污染对人类细胞生物影响的综合评估。这种综合方法符合食品和环境安全研究的最新趋势，其中检测技术不仅根据分析灵敏度进行评估，还根据其生物学相关性进行评估（Lefebvre和Robertson，2010年；FDA，1993年）。仅仅通过检测数据无法理解微量海洋毒素（如多米尼克酸）的潜在健康影响；相反，基于细胞的毒性测试对于验证和情境化暴露风险至关重要（Maduni?等人，2022年；Gajski等人，2020年）。因此，我们的研究提供了将生物传感器结果与功能性细胞反应联系起来的转化视角，这反映了食品安全和环境毒理学框架中日益强调的多学科方法（Tenorio等人，2021年；Petroff等人，2021年）。在本研究中，所开发的电化学生物传感器被用于检测各种海洋生物中的DA水平，发现在马尔马拉海的贻贝中存在微量浓度（0.59 ng/mL）。生物传感器识别的0.5 ng/mL浓度以及更高的75 ng/mL、20 μg/mL和100 μg/mL浓度被直接用于细胞毒性测定，以评估在环境获得和监管相关剂量下的细胞反应，从而全面评估DA的生物影响。另一方面，多米尼克酸是谷氨酸的类似物；谷氨酸是大脑中的一种神经递质，能激活谷氨酸受体，并对神经细胞具有兴奋作用（Zhou和Danbolt，2014年）。在本研究中，将不同浓度的多米尼克酸应用于胎儿期组织的羊膜液来源的间充质干细胞（hAF-MSC）和人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）作为类神经元细胞模型，以评估其细胞毒性。48小时应用后，在100 μg/mL浓度下，hAF-MSC的增殖增加，而SH-SY5Y细胞的活力下降。Gajski等人（2020年）报告了DA对非目标人类外周血细胞（HPBCs）的不良细胞毒性效应。据报道，具有神经毒性的DA对不同细胞也有细胞毒性效应（Maduni?等人，2022年；Gajski等人，2020年；Hassoun等人，2021年）。我们的结果显示，在48小时应用后，间充质干细胞的增殖增加。DA对非目标hAF-MSC没有细胞毒性效应，反而促进了细胞增殖。这种MSCs的增殖增加被认为是由于hAF-MSC的神经分化潜力（Gaggi等人，2022年；Jiménez-Acosta等人，2022年；Xia等人，2013年；Vawda和Wilcox，2008年），因为在DA给药后谷氨酸受体过度表达，从而导致增殖增加。AMPA受体不直接参与DNA修复机制。然而，谷氨酸受体的过度激活可导致细胞损伤，如氧化应激和钙失衡。这种细胞应激可能导致DNA损伤，并间接触发DNA修复机制。另一方面，已经证明AMPA受体的拮抗剂可以完全防止DA的效应（Jansson和?kerman，2014年；Hogberg和Bal-Price，2011年；Benke和Traynelis，2019年；Wright和Vissel，2012年）。AMPA受体是离子型谷氨酸受体家族的重要组成部分，GRIA2（谷氨酸离子型受体AMPA类型亚单位2）基因编码了它们的一个亚单位。GRIA2在维持神经元稳态中起关键作用，通过调节AMPA受体的钙通透性。然而，GRIA2基因的表达水平可以改变神经元细胞对DNA损伤的敏感性，通过直接影响AMPA受体的钙通透性（Wright和Vissel，2012年）。随着研究中使用的DA浓度的增加，hAF-MSC中的GRIA2基因表达以浓度依赖的方式增加，与对照组相比；而在SH-SY5Y细胞中，FDA确定的DA的TDI与对照组相似，但在其他浓度下则降低，表明DA在hAF-MSC中激活了受体，而在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中则没有。这些发现为理解DA在神经退行性过程中的作用以及GRIA2在神经母细胞瘤细胞中的作用提供了重要数据。为了研究与细胞对细胞毒性物质（DA）的反应以及DNA修复机制相关的基因表达，分析了PRKDC、MRE11、ATM、XRCC4、BRCA1、BRCA2、Ku80、Rad 51、Ku70、BCL2、ABCG2、CYCS、TNFA等基因的相对表达水平。将hAF-MSCs与多米酸（DA）孵育后，发现MRE11、ATM、BRCA1、BRCA2、Ku70、Ku80、XRCC4、Rad 51、PRKDC和BCL2等基因的相对表达结果显示，虽然有些基因与对照组相似，但有些基因的表达水平显著下调。与分化细胞相比，正常（多能或全能）干细胞通常具有更强的DNA修复能力（Frosina 2010）。这表明干细胞倾向于利用先进的DNA修复机制来保护其遗传物质。我们的研究结果表明，DA在hAF-MSCs中的DNA修复能力处于一个不会对细胞造成损伤的水平；这些发现与细胞活力和增殖的研究结果一致（Bellagamba等人2016年）。此外，考虑到ABCG2基因（编码一种跨质膜运输药物的转运蛋白，在多药耐药性中起作用）和CYCS基因（参与凋亡过程的启动）在所有应用浓度下均无统计学上的显著变化，这进一步表明DA在hAF-MSCs中的水平不需要DNA修复能力，也不会对细胞造成损伤；这些发现也与细胞活力和增殖的研究结果一致（Frosina 2010；Bellagamba等人2016；Vinoth等人2008）。这不仅可以通过MSCs形成畸胎瘤的潜力来解释，还可以通过它们由于胎儿起源而发展出的防御机制来解释（Bleyl和Schoenwolf 2018；Gill和Kumara 2019）。SH-SY5Y细胞在0.5 ng/mL、75 ng/mL、20 μg/mL和100 μg/mL的DA浓度下孵育48小时，PRKDC、ATM、BRCA1、BRCA2、XRCC4、Rad 51、KU70、CYCS和TNFA等基因的相对表达结果在所有应用浓度下均无统计学上的显著变化。另一方面，参与DNA修复机制的KU80和MRE11基因的表达水平显著上调（Radad等人2018），这表明应用于神经样细胞的DA浓度无法维持其遗传稳定性。此外，TNFA和BCL2基因的显著下调表明，神经样细胞的抗凋亡特性（如KU80基因表达增加所示）因DA的作用而减弱（Lu等人2013）。相反，健康神经样细胞中ABCG2基因的显著上调表明，所应用的DA浓度可能触发了适应性抵抗。ABCG2是一种膜结合的外排转运蛋白，是血脑屏障的主要组成部分，通过主动排出外源性物质和减少细胞内氧化应激在细胞解毒和神经保护中起关键作用。在本研究中，ABCG2表达的增加可能代表了SH-SY5Y细胞为在DA诱导的压力下维持基因组稳定性而激活的内在保护机制。值得注意的是，这种反应似乎足以防止其他DNA修复基因的上调，表明ABCG2介导的解毒可能减轻了细胞进一步激活DNA修复的需求。这些发现与ABCG2在多药耐药性和神经保护中的已知作用一致，强调了其在神经毒性环境中的潜在贡献（Breedveld等人2005）。对于SH-SY5Y细胞，当DA浓度为100 μg/mL时，细胞活力略有下降。关于谷氨酸受体的表达结果，GRIA2基因的增加表明DA在hAF-MSCs中激活了该受体，但在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中则没有。据认为，在hAF-MSCs中，随着DA浓度的增加，遗传稳定性得以保持，DNA修复能力也没有变化，同样，它也不影响hAF-MSC的活力和增殖。本研究致力于开发一种高灵敏度的电化学生物传感器系统来检测海产品中的神经毒素多米酸（DA）。此外，还研究了DA在FDA允许的最高浓度及本研究中确定的浓度下的细胞毒性、神经毒性和DNA修复相关效应。研究结果表明，DA影响了hAF-MSC和SH-SY5Y细胞中与细胞毒性反应、DNA修复和神经毒性相关的基因表达，但在48小时内未显著影响细胞活力。虽然hAF-MSCs没有显示出明显的细胞损伤迹象，但SH-SY5Y细胞在高浓度下表现出轻微的活力下降。值得注意的是，DA调节了hAF-MSCs中的谷氨酸受体（GRIA2）表达，而在SH-SY5Y细胞中则没有，这表明神经元具有不同的反应。SH-SY5Y细胞还表现出DNA修复和膜转运蛋白基因（如ABCG2）的上调，表明具有适应性抵抗机制。生物传感器检测到Marmara贻贝中0.59 ng/mL的DA，这为设计低剂量实验（0.5–75 ng/mL）提供了依据，在这些实验中详细研究了细胞中谷氨酸受体活性和DNA修复机制的变化。高剂量（20–100 μg/mL）在神经母细胞瘤细胞中触发了适应性抵抗机制，如基因表达的增加，表明它们应对DA诱导的压力有所改变。这一发现与先前的研究一致，这些研究强调了ABCG2在通过促进有毒物质的排出和维持细胞稳态来保护神经元细胞中的作用（Haider等人2015）。在本研究中，成功开发了一种高灵敏度的电化学生物传感器系统用于检测海产品中的DA。此外，当使用MTT测定法在不同剂量下确定hAF-MSC和SH-SY5Y细胞的IC50浓度时，由于在这些浓度下细胞活力最多仅下降了10%，因此无法确定IC50浓度。在选定的FDA确定的DA浓度（75 ng/mL、0.5 ng/mL、20 μg/mL和100 μg/mL）下，hAF-MSCs中分析的DNA修复机制基因、耐药基因、凋亡基因和抗凋亡基因的表达与对照组相同。因此，属于胎儿时期的hAF-MSCs并未受到本研究中应用的DA的神经毒性、细胞毒性、凋亡和基因毒性效应的损害，这些发现也得到了这些细胞未影响细胞活力和增殖的结果的支持。另一方面，在SH-SY5Y细胞中，DNA修复机制基因MRE11和KU80的表达显著增加，而抗凋亡基因BCL-2的表达下降，同时观察到凋亡基因TNFA的表达增加。然而，我们认为这种凋亡效应需要通过功能和蛋白质表达分析来进一步验证。尽管当前研究未包括KU80和MRE11蛋白的Western blotting分析，但未来的研究将致力于在蛋白质水平上验证这些转录组发现。虽然hAF-MSCs中AMPA受体家族成员GRIA2亚单位的基因表达水平没有变化，但在FDA确定的DA浓度下，其表达与对照组相似；而在其他浓度下，其表达下降与氧化应激引起的DNA损伤以及MRE11和KU80基因的表达增加和细胞活力轻微下降相关。总之，值得注意的是，神经毒素DA在48小时内对hAF-MSCs和SH-SY5Y细胞没有显著的细胞毒性效应，但对SH-SY5Y细胞有一定的毒性效应。SH-SY5Y细胞表现出对DA的抵抗力，表明癌细胞正在增强其DNA修复机制以抵御凋亡和细胞死亡。这也得到了与DNA修复和膜转运蛋白基因ABCG2上调相关的支持。然而，这些基因型水平的分析应通过未来的磷酸化蛋白表达分析来进一步验证。这种综合方法与食品和环境安全研究中的最新趋势一致，其中检测技术不仅评估分析灵敏度，还评估其生物学相关性（Lefebvre和Robertson 2010；Petroff等人2021）。仅通过检测数据无法完全理解微量海洋毒素（如多米酸）的潜在健康影响；相反，基于细胞的毒性测试对于验证和评估暴露风险至关重要（Maduni?等人2022；Gajski等人2020）。因此，本研究提供了将生物传感器数据与功能性细胞结果联系起来的转化视角，特别关注干细胞和神经元细胞模型中的DNA修复、凋亡和神经毒性相关途径。这种分析化学和毒理基因组学的结合反映了食品安全和环境毒理学框架中的多学科范式（Tenorio等人2021）。总体而言，本研究有助于更全面地了解多米酸在不同浓度下的细胞效应，为海产品安全监测和风险评估策略提供了有价值的见解。

作者贡献：
Emilia Qomi Ekenel：数据整理、正式分析、撰写初稿、项目管理。
Yucel Koc：概念化、方法论、数据整理、正式分析、项目管理。
Burcugul Altug：数据整理、正式分析、方法论。
Merve Nur Soykan：研究、验证、可视化。
Bahar Demir Cevizlidere：正式分析、项目管理、监督。
Sibel Gunes Bagis：资源提供、监督、撰写初稿。
Onur Uysal：概念化、资源提供、项目管理、监督、资金获取、审稿和编辑、撰写初稿。
Tugba Semerci Sevimli：正式分析、软件支持。
Murat Sevimli：正式分析、软件支持、资金获取。
Ayla Eker Sariboyaci：概念化、方法论。
Huseyin Avci：概念化、数据整理、软件支持、项目管理、监督、资金获取、撰写初稿。
Onur Uysal作为主要作者，负责手稿的准备和修订。

致谢：
作者感谢Ugur Morali博士的巨大帮助和贡献。

资助：
本研究得到了Eskisehir Osmangazi大学科学研究项目协调单位（ESOGU-BAP）的资助（项目编号201911061和201815044）以及土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）的资助（项目编号20AG031）。

伦理声明：
本研究得到了土耳其农业和林业部、渔业和水产养殖总局（67852565-140.03.03-E.1415263，2017年6月8日）和Eskisehir Osmangazi大学临床研究伦理委员会的批准（80558721/170-07；2016年6月22日）。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。