植入材料均匀孔形态降低巨噬细胞细胞圆形度及炎症表达

《Materials Today Bio》：Uniform Pore Morphology of Bijel-Templated Materials Reduces Cell Circularity and Inflammatory Expression of Macrophages

　　

植入式生物材料的设计通常旨在引导局部细胞行为以调控免疫反应。非化学策略利用机械性能和结构形态对细胞行为的影响。一类被称为双连续界面阻塞乳液凝胶(bicontinuous interfacially jammed emulsion gel, bijel)模板材料(BTM)表现出特征性的均匀孔径和表面曲率。现有的体内研究表明，这类材料能够沿抗炎方向调节炎症反应。本研究通过体外考察巨噬细胞的表型和行为，探讨了其中的关键影响因素。对照底物颗粒模板材料(particle-templated material, PTM)具有相同的化学成分，但孔径和表面曲率可变。研究发现，在这两种材料中，巨噬细胞呈现出显著不同的细胞形状和表型。与PTM相比，与BTM相互作用的巨噬细胞表现出较低的细胞圆形度和较低的炎症状态。这种效应足以在不直接接触BTM的情况下诱导成纤维细胞的低促纤维化活化。这些结果表明，微观尺度的曲率和孔径对巨噬细胞具有直接影响，并且这种影响可导致其他细胞的表型变化。研究结果重申了在生物材料设计中靶向巨噬细胞的重要性，并支持进一步研究BTM内的免疫信号级联反应。这些关于多孔材料中细胞行为的基礎认知，为推进生物材料设计提供了新的见解。

植入式生物材料的性能往往受限于复杂的宿主免疫反应，尤其是纤维化包囊的形成，这严重阻碍了材料的长期功能。传统研究多侧重于化学修饰以调控免疫响应，但非化学途径——特别是利用材料微观结构（如孔径、曲率）调控细胞行为——因避免了潜在的副作用而备受关注。尽管已有研究指出孔径和曲率可分别影响免疫细胞反应和细胞迁移，但由于二者在材料中常相互耦合，难以独立解析其各自效应。此前研究者的体内实验表明，具有均匀孔径和恒定负高斯曲率的双连续界面阻塞乳液凝胶模板材料（bicontinuous interfacially jammed emulsion gel-templated materials, BTM）相较于具有不均匀孔径的颗粒模板材料（particle-templated material, PTM），能诱导更有利的宿主反应（如减少纤维化、增加血管化）。然而，这种宏观现象背后的细胞与分子机制尚不明确：究竟是哪种细胞类型直接感知了结构差异？这种感知如何通过细胞形状变化转化为表型改变？又如何进一步影响下游细胞？

为了解答上述问题，研究人员设计并开展了一系列体外实验，对比分析了BTM与PTM对巨噬细胞和成纤维细胞行为的影响。该研究最终证实，BTM独特的微观结构能直接诱导巨噬细胞形态伸长并转向抗炎表型，且这种由巨噬细胞介导的信号能通过旁分泌作用显著抑制成纤维细胞的促纤维化活化。这项关于多孔材料中细胞行为与信号传递机制的研究，为生物材料的结构优化设计提供了重要的理论依据，相关成果发表在《Materials Today Bio》上。

在研究技术方法上，研究人员首先制备了化学成分相同但微观结构迥异的BTM和PTM作为实验底物。利用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜对底物的孔隙率、孔径分布及表面形貌进行了表征。细胞实验选用鼠源巨噬细胞系RAW 264.7和人原代真皮成纤维细胞（NHDFs），通过三维细胞接种技术将细胞植入多孔材料内部。利用共聚焦显微镜获取细胞在材料内部的荧光图像，并通过图像分析软件计算细胞面积、圆形度等形态学参数。细胞表型则通过流式细胞术定量检测巨噬细胞的诱导型一氧化氮合酶（iNOS，M1型标记物）和成纤维细胞的α-平滑肌肌动蛋白（αSMA，促纤维化标记物）的表达水平。此外，还设计了条件培养基实验，以探究细胞间的旁分泌信号传递。

研究结果部分，首先进行的底物表征显示，BTM具有连通性良好的非收缩性孔网络及马鞍状（负高斯）曲率，而PTM则由球形空腔和狭窄的连接孔喉组成。化学分析（EDS和FTIR）证实了两种材料成分一致，排除了化学因素干扰。

在巨噬细胞原位行为研究中，共聚焦成像与形态学分析表明，与PTM相比，BTM内的巨噬细胞表现出显著更低的圆形度（即更趋伸长），但细胞面积无显著差异。流式细胞术结果显示，BTM内的巨噬细胞iNOS表达水平显著低于PTM和玻璃对照组，表明其处于较低的炎症状态。

在成纤维细胞原位行为研究中，NHDFs在BTM中同样表现出比PTM更低的圆形度和更大的细胞面积。尽管在表型上，BTM和PTM组的αSMA表达均低于玻璃组，但两者之间无统计学差异。进一步的细胞深度分布分析发现，成纤维细胞在PTM中倾向于聚集在材料表层，而在BTM中则均匀分布，这归因于PTM狭窄的孔喉对较大尺寸成纤维细胞产生的尺寸排阻效应。

在巨噬细胞-成纤维细胞影响的调节介质研究中，条件培养基实验表明，暴露于BTM-巨噬细胞条件培养基中的成纤维细胞，其αSMA表达水平显著低于暴露于PTM-巨噬细胞条件培养基的细胞。这证明巨噬细胞感知材料结构后释放的可溶性因子，足以介导下游成纤维细胞的表型变化。

讨论部分总结指出，该研究首次在体外揭示了BTM微观结构对免疫细胞形状和表型的直接影响。BTM独特的孔隙结构诱导巨噬细胞形态伸长，进而促进其向抗炎表型极化，这一机制与细胞内应力状态和肌动蛋白组织方式密切相关。对于成纤维细胞，由于尺寸限制，其在PTM中的行为与在二维平面相似，未能真实反映其对PTM孔隙结构的反应。重要的是，研究证实了巨噬细胞是连接材料结构与宿主反应的“信号枢纽”，其介导的旁分泌信号能有效抑制成纤维细胞的促纤维化活化。这为生物材料设计提供了新范式：通过精确调控孔隙拓扑结构靶向巨噬细胞，可实现级联式的免疫调控。

结论部分翻译如下：研究人员报道了一类新型多孔生物材料形态特性对免疫细胞响应的影响研究。由bijel模板化的底物具有连续的孔网络和均匀的孔径及负高斯表面。巨噬细胞被接种入BTM并在48小时后进行分析。BTM的孔结构导致接种的巨噬细胞比具有不同孔结构的化学等效材料中的巨噬细胞具有更低的圆形度和更低的炎症水平。这种对巨噬细胞的抗炎效应产生了条件培养基，仅此就足以导致成纤维细胞促纤维化活化的降低。这些结果表明确实存在孔径结构与巨噬细胞极化之间的直接关系，这种关系由细胞形状的影响介导，并将BTM作为一种独特的调节巨噬细胞行为的平台引入。未来的研究应寻求阐明这些材料对其他相关细胞类型的影响，并辨别这些效应之间是如何相互作用的。广泛的理解将极大地促进利用生物材料结构元素来控制细胞行为的实践。