在不锈钢表面涂覆PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料，用于高效固相微萃取人尿样中的四环素，以便后续进行HPLC–DAD分析

《Analytical Science Advances》：PANI/PTA/Fe3O4 Nanocomposite Coated on Stainless-Steel Towards Efficient Solid-Phase Microextraction of Tetracycline From Human Urine Samples Prior to HPLC–DAD Analysis

　　**摘要**

四环素（TC）是一种常用的广谱抗生素，其广泛使用以及其在生物基质（尤其是尿液）中的持久性引发了关于临床安全、公共卫生和抗菌素耐药性出现的严重担忧，这突显了对其准确和灵敏检测的必要性。在这项工作中，开发了一种创新的固相微萃取（SPME）策略，使用涂覆在不锈钢基底上的聚苯胺/磷钨酸/Fe3O4（PANI/PTA/Fe3O4）纳米复合材料来高效提取人尿样中的TC。通过场发射扫描电子显微镜、能量分散X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱对PANI/PTA/Fe3O4进行结构表征，证实了磷钨酸（PTA）和Fe3O4成功结合到PANI框架中。所得聚合物涂层具有粗糙多孔的形态，提供了大量的活性位点以有效吸附TC。系统优化了关键提取参数，包括涂层组成、膜厚度、溶液pH值、离子强度、提取时间和脱附条件。在优化条件下，PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料表现出优异的分析性能，检测限为0.97 ng mL?1，定量限为3.24 ng mL?1，并且在较宽浓度范围内具有良好的线性（R2 > 0.99）。该纳米复合材料还表现出强重现性（日内相对标准偏差 [RSD] 2.6%–3.9%；日间 RSD 4.8%–5.0%）以及在加标尿样中的高回收率（99.5%–100.5%）。增强的吸附性能归因于PANI（提供导电性和π–π/π-氢键相互作用）、PTA（贡献静电和氢键亲和力）和Fe3O4（赋予磁稳定性和表面活性）的共同作用。总体而言，PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料是一种稳健且高效的SPME涂层，具有在复杂生物基质中检测TC的巨大潜力。所提出的SPME-高效液相色谱（HPLC）方法可以通过合理调整涂层组成进一步适用于其他结构类似的抗生素和药物分析物的分析。

**缩写**

- AMR：抗菌素耐药性
- CV：循环伏安法
- EDS：能量分散光谱
- FE-SEM：场发射扫描电子显微镜
- FTIR：傅里叶变换红外光谱
- HPLC–DAD：带二极管阵列检测器的高效液相色谱
- LLE：液-液萃取
- PANI：聚苯胺
- PTA：磷钨酸
- RR：相对回收率
- RSD：相对标准偏差
- SPE：固相萃取
- SPME：固相微萃取
- TC：四环素
- XRD：X射线衍射

**1 引言**

四环素（TCs）是广泛应用于人类和兽医医学的广谱抗生素。它们的广泛使用导致在生物和环境基质（包括人尿液）中频繁检测到TC残留物。这些残留物不仅直接威胁健康，还加剧了抗菌素耐药性（AMR）的全球威胁，该危机在2019年导致近500万人死亡，并预计未来会进一步加剧[1, 2]。此外，抗生素残留物对免疫系统受损个体的不良影响以及细菌感染在肿瘤进展中的作用的新证据突显了在生物系统中灵敏可靠地监测TC残留物的迫切需求[3]。从结构上看，TC由一个线性的、融合的四环骨架组成，该骨架上装饰有多个功能基团，这些基团决定了其物理化学性质和对吸附材料的亲和力。关键特征包括C-4位置的可质子化二甲氨基团、C-6、C-10和C-12位置的羟基取代基（作为氢键供体），以及跨越C-11和C-12a的β-二酮部分（既作为强氢键受体又作为金属螯合位点）（图S1）。这些功能基团在提取过程中至关重要，因为它们能够与功能化的吸附剂发生静电相互作用、氢键和π–π堆叠[4, 5]。液-液萃取（LLE）是一种传统的样品制备方法，其中分析物分布在两种不相溶的液相之间。然而，它通常需要大量的有害有机溶剂，并涉及劳动密集型的处理步骤。固相萃取（SPE）通过使用固体吸附剂选择性地保留分析物，从而提高了选择性，减少了溶剂的使用并促进了自动化[6, 7]。固相微萃取（SPME）进一步实现了微型化，将采样、提取和预浓缩结合到一个无溶剂的步骤中。与LLE和SPE相比，SPME更快、更环保，且在复杂基质中的痕量分析中非常有效。然而，其性能很大程度上取决于吸附剂涂层的性质。由于其简单性、最小的溶剂消耗量以及与色谱技术的兼容性，SPME已成为痕量分析的稳健样品制备方法。SPME纳米复合材料的效率在很大程度上取决于吸附剂涂层的性质，该涂层必须确保高选择性、稳定性和吸附能力[8]。导电聚合物（如聚苯胺（PANI）作为吸附材料特别有吸引力，因为它们易于合成、环境稳定、成本低且具有多种化学功能。PANI的共轭骨架支持多种相互作用，包括π–π堆叠、氢键和静电作用，使其成为富集抗生素和其他极性药物的合适候选材料[9]。为了进一步提高基于PANI的吸附剂的性能，已将功能性纳米材料掺入聚合物基质中。磷钨酸（PTA）是一种具有Keggin型结构的杂多酸，提供了丰富的负电荷氧位点，增强了与TC分子的静电相互作用和氢键[10, 11]。磁性氧化铁纳米颗粒（Fe3O4 NPs）增加了表面积、稳定性和可调的表面化学性质，但单独使用时容易聚集且选择性有限。将Fe3O4 NPs和PTA嵌入PANI框架中，创建了一个协同系统，克服了这些缺点，提供了具有改进吸附性能的稳健吸附剂[12-14]。本研究工作介绍了一种通过电聚合技术在不锈钢上制备的新型纳米复合材料（PANI/PTA/Fe3O4）的方法。该方法允许均匀的涂层形成、强大的附着力以及对膜厚度和组成的精确控制[15, 16]。制备的纳米复合材料经过彻底表征，并用于直接浸入SPME从人尿样（IR.TBZMED.VCR.REC.1404.350）中提取TC，随后进行带二极管阵列检测器的高效液相色谱（HPLC–DAD）分析（图1）。PANI、PTA和Fe3O4的联合功能显著提高了提取效率、重现性和回收率。结果表明，这是一种开发先进SPME纳米复合涂层的有前景策略，有助于更可靠地监测生物样品中的抗生素残留物。

**2 实验程序**

**2.1 材料**

TC（96.5%）、Fe3O4纳米颗粒、PTA（H3[PW12O40]）、苯胺、硝酸（65%）、盐酸（37%）、甲醇、乙腈、氢氧化钠、二甲基甲酰胺、草酸铵和磷酸二氢铵均从Merck（德国）购买。使用直径0.25毫米、长度4厘米的不锈钢丝作为基底。所有水溶液均使用超纯水（18.2 MΩ cm，Milli-Q，Millipore）制备。

**2.2 仪器**

HPLC在配备DAD（G1315A）的Agilent 1100系列系统上进行。分离使用ZORBAX C8分析柱（250 × 4.6 mm2，5 μm），在室温下操作。流动相由二甲甲酰胺、0.1 M草酸铵和0.2 M磷酸二氢铵（27:68:5，v/v/v）组成，pH值为7.6–7.7，流速为2.0 mL min?1。检测波长设置为280 nm[17]。使用Bruker Tensor 27光谱仪（德国）获得傅里叶变换红外（FTIR）光谱，以表征合成吸附剂的功能基团。使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，TESCAN MIRA 3 LMU，捷克共和国）和能量分散X射线光谱（EDS）检查纳米复合材料的表面形态，并进行元素映射。使用超声波浴（Elma Elmasonic P60H，德国）分散前体。

**2.3 PANI/PTA/Fe3O4的合成**

纳米复合涂层是通过电聚合直接在不锈钢丝上制备的。简而言之，将25 mL电解质溶液（包含1.0 M HNO3、0.1 M苯胺、70 mg PTA和100 mg Fe3O4 NPs）超声处理5分钟，以实现不锈钢丝（长度4厘米）的均匀分散，作为阳极和阴极。依次用丙酮、乙醇和超纯水预处理的阳极丝作为电极，相距1厘米[18]。施加1.0 V的直流电15分钟，通过苯胺电聚合在阳极上沉积PANI/PTA/Fe3O4复合膜，在此过程中Fe3O4 NPs和PTA被结合到PANI网络中。通过调整电聚合时间控制涂层厚度，而通过多次沉积循环改善膜均匀性[19, 20]。

**2.4 标准溶液**

通过将100 mg TC溶解在100 mL甲醇中并在超声处理下制备候选药物（TC）的储备溶液（1000 mg L?1）。工作标准溶液通过超纯水连续稀释获得。每天准备新的校准标准。

**2.5 样品制备**

人尿样来自Omega Pathobiology实验室（伊朗德黑兰）。所有收集均遵循Amir Kabir大学伦理委员会的伦理指南，并获得了每位参与者的书面知情同意。样品被匿名处理，通过0.22 μm膜过滤器过滤，并在?20°C下储存直至分析。提取前，样品用超纯水稀释四倍[21]。

**2.6 直接浸入SPME程序**

对于提取，将10 mL样品溶液加入含有50和100 μg L?1 TC的SPME小瓶中，然后加入5 mm磁力搅拌棒。用1.0 M NaOH标准溶液将pH值调整至5.0，并加入NaCl（20% w/v）以促进盐析。将制备的PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料固定在定制的针型支架中，浸入搅拌的样品中（800 rpm）25分钟，在室温下。提取后，将纳米复合材料放入含有2 mL甲醇/甲酸（0.1% v/v）的Eppendorf管中并搅拌10分钟以实现分析物脱附。所有实验重复三次，方法精度通过相对标准偏差（RSD%）进行评估。

**2.7 方法性能**

相对回收率（RR%）使用以下公式计算：

其中Cfound是加标后的测量浓度，Creal是样品中的初始浓度，Cadded是添加的TC量。

**3 结果与讨论**

影响SPME提取效率的关键因素是吸附剂涂层的类型和组成。在这项研究中，检查了包括吸附剂组成和厚度、提取时间、pH值和搅拌速度在内的各种因素，以优化提取过程。然后使用开发的方法分离和定量实际样品中的TC。

**3.1 吸附剂组成的优化**

SPME纳米复合材料的提取效率主要由涂层的化学组成决定[22-24]。仅涂有PANI的纳米复合材料显示出较差的TC回收率，这强调了组成改性的必要性[25]。如表1所示，随着PTA含量的增加（高达70 mg，S3），TC的回收率提高，对应于最佳的PTA/Fe3O4比例。在这种组成中，PTA提供了丰富的负电荷氧原子，促进了与TC的静电吸引和氢键作用，而Fe3O4纳米颗粒提供了额外的活性位点并增强了膜稳定性[26, 27]。当PTA浓度超过这个水平（S4–S5）时，PANI骨架的过度质子化和Fe3O4的结合减少，导致孔隙度降低和分析物扩散受限。相反，在较低的PTA含量（S1–S2）下，有限的活性结合位点降低了吸附效率。总体而言，这些发现强调了保持PANI、PTA和Fe3O4平衡组成的重要性，以最大化分析物-吸附剂相互作用并确保有效提取。

**表1. 开发的DI-SPME/HPLC–DAD方法用于TC提取的分析性能指标。目标分析物**

| 加标水平（μg L?1） | LOD（ng mL?1） | LOQ（ng mL?1） | R2 | 日内RSD（%） | 日间RSD（%） |
|-------------|-----------|-----------|-------|---------|---------|
| TC | 50 | 0.97 | 3.24 | 0.9994 | 3.4 |
| TC | 100 | — | — | 3.1 | 4.1 |

**缩写说明：** HPLC–DAD：带二极管阵列检测器的高效液相色谱；RSD：相对标准偏差；SPME：固相微萃取；TC：四环素。在保持苯胺量恒定（235 mg）的情况下，评估了不同的PTA/Fe3O4比例。在测试的配方中，含有70 mg PTA和100 mg Fe3O4的纳米复合材料（S3）显示出最高的TC提取回收率，而较低和较高的PTA负载量导致效率降低（表S1）。

**3.2 应用电压效应**

电聚合电压是控制PANI/PTA/Fe3O4复合涂层形成和特性的关键因素。研究了0.5至1.2 V之间的电压。在较低电压（≤0.7 V）下，苯胺聚合不完全，产生薄而不均匀的涂层，Fe3O4和PTA的结合有限。相比之下，较高电压（≥1.1 V）导致过度氧化，阻碍了纳米颗粒的结合，降低了孔隙度并限制了分析物的可及性。1.0 V的中间电压产生了最佳结果，形成了均匀、多孔且稳定的膜，Fe3O4和PTA的结合平衡，从而增强了结构完整性和吸附效率。这些发现表明，精确控制沉积电压对于生产可重复的高性能SPME涂层至关重要。

3.3 搅拌速度的影响

通过诱导流体运动，搅拌增强了离子和带电分子向电极表面的传输，防止了浓度梯度，并确保了均匀的沉积过程。最佳的搅拌速度对于实现所需的涂层厚度、微观结构和附着力至关重要。搅拌不足可能导致涂层不均匀，而过度搅拌可能会引起湍流和不良效果。因此，精确控制搅拌速度对于获得一致且高质量的涂层材料至关重要[28]。该研究考察了500至1400转/分钟的搅拌速率，并最终确定800转/分钟可以优化反应动力学和质量传输。更高的搅拌速度会导致不稳定性，因为磁力搅拌器会与试管碰撞，产生过多的湍流和气泡。因此，在整个实验过程中保持800转/分钟的搅拌速度。

3.4 PANI/PTA/Fe3O4 SPME吸附剂的表征

3.4.1 形态和厚度

FE-SEM分析（图2a–e）显示了所制备涂层之间的明显形态差异。涂有纯PANI的纳米复合材料表面相对光滑，孔隙率较低，而加入PTA和Fe3O4后，表面变得粗糙且多孔。这种结构修改引入了许多活性位点，显著增加了分析物吸附的有效表面积。元素映射进一步证实了Fe、C、N、O、W和P在涂层中的均匀分布，验证了PTA和Fe3O4在PANI基质中的成功整合。图2显示了（a）PANI，（b）PANI/PTA，（c）PANI/PTA/Fe3O4的FE-SEM图像，（d）PANI/PTA/Fe3O4的SEM-EDS元素分析，（e）PANI/PTA/Fe3O4的EDX元素映射，以及（f）PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料的横截面FE-SEM图像。横截面SEM图像（图2f）显示平均膜厚度约为94微米。尽管较厚的涂层通常提供更多的结合位点，但它们也可能减慢平衡速度并限制质量传输。本研究中优化的厚度在吸附能力和提取动力学之间提供了适当的平衡，从而确保了高效率和可重复性。

3.4.2 FTIR光谱

FTIR光谱（图S2）证实了纳米复合材料的成功制备。在3272厘米^-1（N–H伸缩）、2927厘米^-1（C–H伸缩）、1457厘米^-1（C═C伸缩）和1505厘米^-1（C═N伸缩）处识别出PANI的特征谱带[29-31]。1290厘米^-1处的吸收带表明PANI处于质子化导电状态，这归因于与极化子结构相关的C–N+伸缩振动[32-35]。900–1100厘米^-1范围内的额外吸收特征，归因于P═O和W═O振动，进一步验证了PTA在聚合物框架中的整合[36, 37]。在三元PANI/PTA/Fe3O4复合材料中，新的谱带出现在450–580厘米^-1，对应于Fe–O伸缩，证实了Fe3O4纳米颗粒的成功整合[38]。

3.4.3 X射线衍射（XRD）研究

通过XRD研究了PANI、PTA、Fe3O4及其复合材料的晶体性质。原始PANI显示出以2θ = 20°–30°为中心的宽衍射晕圈，这与其非晶性质相符[39]。相比之下，纯PTA在2θ ≈ 10.5°、20.0°、25.4°、29.3°、34.7°、42.0°、50.6°和55.1°处显示出尖锐的反射峰，这与其高度结晶的Keggin型结构相对应[40]。Fe3O4纳米颗粒在2θ ≈ 30.2°（2 2 0）、35.6°（3 1 1）、43.3°（4 0 0）、53.5°（4 2 2）、57.0°（5 1 1）和62.6°（4 4 0）处出现了明显的峰，这与磁铁矿的立方尖晶石结构一致[41, 42]。在二元PANI/PTA复合材料中，PTA的特征反射仍然存在，但强度减弱，表明PTA部分整合到了PANI框架中[40]。三元PANI/PTA/Fe3O4材料显示出对应于PTA和Fe3O4的峰，尽管强度较纯组分有所减弱。这种信号的减弱和展宽表明PTA和Fe3O4在非晶PANI基质中均匀分散，而不是相分离[38]。Fe3O4反射（3 1 1、4 0 0、5 1 1）、PTA峰和PANI晕圈的存在清楚地证明了所有三种成分成功整合到了单一复合材料中。总体而言，XRD结果证实PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料保留了PTA和Fe3O4的晶体特征，同时将它们嵌入到了非晶PANI相中，形成了一种结构稳定的混合吸附剂，非常适合SPME应用（图S3）。

3.4.4 循环伏安法（CV）检测

CV用于评估使用铁氰化钾/氯化钾（1:20）作为氧化还原探针的合成涂层的电化学行为。如图S4所示，裸露的PANI电极（曲线c）显示了预期的氧化和还原峰，对应于白翡翠到翡翠的转变，尽管电流密度相对较低。将PTA整合到聚合物基质中（曲线b）增强了氧化还原响应，这归因于Keggin型杂多酸的酸性位点和质子供体性质，从而促进了更有效的电子转移[43]。三元PANI/PTA/Fe3O4复合材料（曲线a）显示出最高的电流密度和最明显的氧化还原峰，突显了Fe3O4纳米颗粒在提供电活性位点、提高导电性和加速聚合物-电解质界面电荷转移方面的协同作用[44]。PANI/PTA/Fe3O4电极的阳极和阴极峰电流显著增加，证实了Fe3O4和PTA在PANI骨架中的共同整合不仅增强了电荷迁移性，还稳定了聚合物的氧化还原转变[44]。这些结果与先前关于基于PANI的复合材料的研究一致，其中金属氧化物或杂多酸的整合改善了电化学性能和耐久性[45]。总体而言，PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料的优异电化学活性凸显了其作为稳定且高效吸附剂的潜力，直接提高了制备的SPME纳米复合材料的孔隙率、稳定性和提取效率（图S4）。

3.4.5 复合材料的形成和吸附机制

PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料是通过在PTA和Fe3O4纳米颗粒存在下电聚合苯胺形成的。PTA既作为质子化掺杂剂，也作为多金属氧酸盐物种，与PANI的亚胺基团建立了强烈的离子对相互作用。这种情况不仅稳定了导电的翡翠盐形式，还引入了许多带负电的氧位点[46, 47]。均匀嵌入PANI网络中的Fe3O4纳米颗粒增强了聚合物结构，防止了结构崩溃并扩大了可用表面积[48]。由此产生的架构提供了一个协同平台：PANI提供了π–π堆叠和氢键的共轭骨架，PTA提供了静电和氢键亲和力，Fe3O4增强了机械稳定性和吸附能力[49]。几种互补的相互作用驱动TC在纳米复合材料上的吸附。在pH 5时，TC主要以其两性离子状态存在，允许质子化的二甲氨基与PTA的负电荷氧原子进行静电相互作用。相比之下，酚类和β-二酮基团与PANI和PTA的功能位点发生氢键结合。同时，TC的芳香环与共轭的PANI骨架发生π–π堆叠。β-二酮部分（C-11/C-12a）还作为PANI的–NH基团的强氢键受体，进一步稳定了分析物吸附复合物[46-48]。这些协同机制共同解释了所开发纳米复合材料出色的提取效率、可重复性和回收率。考虑到TC的结构特性以及PANI/PTA/Fe3O4涂层中的功能基团，吸附机制可以通过图3所示的相互作用组合来解释。

3.5 TC的提取

为了提高PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料的性能，对提取参数进行了优化。系统评估了包括pH值、提取时间、吸附剂负载量、温度和离子强度在内的关键因素，以实现一致且高效的TC回收。

3.5.1 pH值的影响

系统研究pH值从4.0到8.0，发现提取效率在pH 5.0时达到最大。这种行为与TC的酸碱物种特性一致，TC具有多个解离常数（pKa ≈ 3.3、7.7和9.7），这些常数决定了其在水溶液中的离子分布[1]。在此pH值下，TC主要以两性离子状态存在，保留了质子化的二甲氨基，而酚类/β-二酮基团则去质子化。在这种条件下，PANI/PTA/Fe3O4涂层支持互补的结合机制：阳离子TC位点与带负电的PTA簇之间的静电吸引[43]；TC功能基团（–OH/–NH）与PTA的氧原子或PANI的氮原子之间的氢键[50]；以及与共轭PANI骨架的π–π堆叠[50]。在较低的pH值（≤4.0）下，TC和PANI基团的过度质子化增加了与H+离子的竞争，削弱了π–π相互作用，从而降低了提取效率。在较高的pH值（≥6.0）下，TC的弱阳离子性质减少了静电相互作用，可能促进部分降解或异构化[51]，从而降低了吸附量。因此，选择pH 5.0（10–20 mM醋酸盐缓冲液和20% w/v NaCl）作为最佳条件，提供了吸附剂-分析物相互作用、分析物稳定性和信号可重复性的最佳平衡。

3.5.2 提取时间

提取时间在建立分析物和吸附剂之间的平衡中起着关键作用。虽然延长提取时间可以提高分析物的吸附量，但也会延长分析时间，并可能导致解吸或基质干扰。因此，需要仔细优化以平衡灵敏度、可重复性和分析效率[52]。在5–45分钟内进行的实验显示，TC的吸附量稳步增加，直到15分钟，之后吸附量趋于平稳，表明已建立平衡。在较短的时间（<10分钟）内观察到提取不足，而超过20分钟的提取时间并未提高回收率，甚至可能导致纳米复合材料污染或分析物反扩散。因此，选择15分钟作为最佳提取时间，既实现了高效的质量传输，又保证了可重复的吸附，同时避免了分析程序的不必要延长。

3.5.3 温度

温度是影响提取动力学和热力学的重要参数。虽然提高温度可以增强分析物向吸附剂的扩散，但也可能降低分配系数或促进分析物降解。对于TC的分析，在低于室温、室温和略高于室温的条件下进行的测试表明，室温（25°C）提供了最有利的结果。在高于35°C的温度下，部分降解发生，导致回收率降低，而冷却则降低了扩散速率和提取效率。因此，选择室温作为后续实验的温度，因为它确保了分析物的稳定性以及高效的吸附动力学。

3.5.4 盐析效应

盐析效应是一个可以显著提高SPME效率的关键因素[53-55]。在SPME中，向样品基质中添加盐可以降低目标分析物的溶解度。将PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料暴露于含有不同盐浓度（NaCl）的溶液中。研究发现，向溶液中添加20%的盐显著增加了纳米复合材料对TC的吸附量。因此，后续实验使用了20%的盐浓度。

3.5.5 解吸时间

在使用选定的溶剂进行磁力搅拌的情况下评估了解吸时间的效果。在最初的几分钟内，峰面积急剧增加，然后趋于平稳，表明分析物已完全从纳米复合材料中释放。超过这个平衡点继续解吸没有额外的好处，只是延长了工作流程。这一趋势与解吸动力学一致，即一旦容易获得的分析物部分被去除，洗脱就受到扩散限制，因此更长的时间对于提高信号无效[56]。因此，选择10分钟的解吸时间作为最佳条件，确保了TC从PANI/PTA/Fe3O4涂层中的定量回收，并最小化了后续空白样品中的携带效应。

3.5.6 解吸溶剂

有效的解吸需要一种能够破坏TC与PANI/PTA/Fe3O4涂层之间的π–π、氢键和静电相互作用的溶剂系统。测试了多种洗脱剂，包括质子性和非质子性溶剂（甲醇和乙腈）、水混合物和酸化配方。酸化的甲醇始终产生最高的峰面积和最清晰的基线，而乙腈和水混合物则产生较弱的信号和较宽的峰。因此，选择含有少量甲酸（约0.5%–1% v/v）的甲醇作为常规使用溶剂。在这种介质中，TC的二甲氨基和PANI的碱性位点的质子化减少了与PTA的静电结合。它破坏了氢键，使得分析物快速释放，同时保持了与HPLC–DAD分析的兼容性。增加酸浓度超过2% v/v并没有进一步提高回收率，反而可能引起涂层渗漏或结构变化；因此，选择甲醇 + 1%（v/v）甲酸作为最佳解吸溶剂。不同实验参数对TC提取效率的影响总结在图4a–g中。图4：在图形查看器中打开

使用PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料优化四环素（TC）的提取和脱附参数，包括吸附剂类型（a）、pH值（b）、离子强度（c）、提取时间（d）、搅拌速度（e）、脱附时间（f）和溶剂选择（g）。

3.6 方法验证

3.6.1 色谱分析
图S5显示了在优化提取条件下获得的代表性HPLC–DAD色谱图。在标准溶液（50和100 μg L?1）和加标尿样中，始终观察到约8.0分钟的尖锐、对称的TC峰，证实了分离的稳定性和重现性。空白尿样没有干扰峰，证明了该方法在复杂生物基质中对TC的高选择性。稳定的基线和清晰的分峰进一步突出了色谱条件的稳健性。使用浓度为10、50、100、500和1000 μg L?1的标准溶液构建了校准曲线。根据获得的结果，在标准和加标样品中都观察到了尖锐、清晰的分峰。同时，空白尿样没有内源性干扰，证实了该方法在生物基质中测定TC的选择性和适用性。在优化的DI-SPME/HPLC–DAD条件下获得的色谱图显示在图S5中。在空白尿样（图S5a）中，TC保留时间没有出现信号，证实了没有可能影响选择性的内源性化合物。标准TC溶液（50 μg L?1）（图S5b）在约8.0分钟产生了一个尖锐、对称的峰，建立了参考保留时间。加标尿样在50和100 μg L?1（图S5c,d）在相同的保留时间产生了定义明确的峰，峰强度与浓度成正比。这些发现证实了该方法在复杂生物基质中的准确性、重现性和线性。总体而言，色谱图表明PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料能够从实际尿样中选择性地且灵敏地提取TC，且基质干扰最小。所开发的DI-SPME/HPLC–DAD方法的分析性能特征，包括灵敏度、精度、线性和回收率，在表1中进行了总结。LOD和LOQ分别基于信噪比为3和10进行计算。为了进一步评估所开发方法的适用性，将DI-SPME/HPLC–DAD程序应用于添加了两种浓度水平TC的实际尿样。表2中的结果证实了该方法在复杂生物基质中的准确性和重现性。

表2. 使用开发的DI-SPME/HPLC–DAD方法测定实际尿样中的TC。
样品
目标分析物
添加浓度（μg L?1）
检测浓度（μg L?1）
RSD%（n = 3）
回收率（%）

尿样
TC
50
49.7
2.6
99.5

尿样
TC
100
99.5
3.0
100.5

缩写：HPLC–DAD，带有二极管阵列检测器的高性能液相色谱；RSD，相对标准偏差；SPME，固相微萃取；TC，四环素。在实际尿样分析中，未在未加标的样品中检测到TC，证实了没有内源性TC残留。加标尿样在50和100 μg L?1在约8.0分钟产生了定义明确的峰，与标准溶液的峰相同，没有基质干扰的迹象。相对回收率（99.5%–100.5%）证实了DI-SPME/HPLC–DAD方法在复杂生物基质中测定TC的可靠性、准确性和实际适用性。

3.6.2 与现有方法的比较
表S2展示了为TC测定在不同基质中开发的代表性SPME/MSPE基方法[57-64]。许多报道的策略使用了分子印迹聚合物（MIPs）、离子液体或先进的纳米结构吸附剂，如沸石、MOFs和氧化石墨烯，以提高选择性和灵敏度。尽管一些方法（例如MIP–SPE–HPLC–DAD和MSPE–LC–MS）实现了低至0.01 ng mL?1的显著检测限，但它们通常受到劳动密集型制备、高成本和有限重复使用性的限制。较简单的吸附剂，如传统的MIPs或亲水-疏水平衡（HLB）涂层，显示出中等回收率（70%–90%），但通常重现性较差。相比之下，使用PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料开发的DI-SPME/HPLC–DAD方法提供了有竞争力的灵敏度（LOD 0.97 ng mL?1）、出色的回收率（99.5%–100.5%）和稳健的重现性（RSD ≤ 5.0%）。这些结果等于或超过了大多数先进吸附剂系统的性能，而电聚合过程提供了一种直接、可重复且可控的纳米复合材料制备方法。与需要复杂合成步骤的MOF或IL基策略不同，该方法结合了高分析性能和操作简便性，使其适用于常规应用。性能的提升归因于PANI（导电性和π–π及氢键相互作用）、PTA（静电和氢键亲和力）和Fe3O4（表面积和结构稳定性）的协同作用。这些组分共同作用，产生了一种耐用、高效的吸附剂，能够可靠地从复杂生物基质中提取TC。总体而言，PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料成为监测实际生物样本中抗生素残留物的实用、可重复和高性能的替代品。

4 结论
总之，通过电聚合在不锈钢纳米复合材料上制备了一种新型的PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料，并将其用于直接浸渍SPME法提取人尿中的TC。结构和组成分析（SEM/EDS、FTIR、XRD和CV）证实了PTA和Fe3O4成功结合到PANI框架中，形成了一种稳定且多孔的涂层。优化的纳米复合材料表现出强大的分析性能，检测限为0.97 ng mL?1，定量限为1.60–3.24 ng mL?1，回收率为99.5%–100.5%，RSD<5.0%。这些结果与许多现有的SPME涂层相比，显示出更高的灵敏度、准确性和可靠性。PANI/PTA/Fe3O4纳米复合材料的增强效率归因于其组分的互补功能：PANI提供了π–π和氢键相互作用，PTA提供了丰富的静电和氢键位点，Fe3O4纳米颗粒改善了表面积和机械稳定性。这种协同作用使得快速平衡、对TC的强亲和力和出色的重现性成为可能。总体而言，所开发的纳米复合材料为生物分析应用中尤其是基质干扰较大的情况提供了一种简单而有效的替代方案。直接的电聚合策略还为其他药物和环境污染物提供了多分析物监测和与先进色谱或质谱技术结合的灵活平台。作者贡献
Hossein Salar Amoli：撰写 – 审稿和编辑、监督、项目管理、概念化。Sanaz Naghinejad Orang：撰写 – 原始草稿、方法学、验证。Mohammad Hasanzadeh：撰写 – 审稿和编辑、可视化、监督、方法学。

致谢
作者衷心感谢伊朗大不里士Amirkabir技术大学和大不里士医科大学药学分析研究中心（78549）提供研究设施和有利于本研究的科学环境。

伦理声明
本研究已获得大不里士医科大学的伦理批准。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。由于隐私或伦理限制，数据不公开。