使用液相色谱-串联质谱技术对29种尿类固醇进行全面定量分析

《Analytical Science Advances》：Comprehensive Quantitative Urinary Steroid Profiling of 29 Steroids Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

　　摘要

类固醇对许多生理过程至关重要；其代谢紊乱与多种内分泌疾病相关。类固醇的定量分析对于提高对这些病理状况的理解和诊断至关重要。历史上，尿液中类固醇的分析是通过低通量气相色谱-质谱（GC-MS）技术进行的，该技术能够全面覆盖各类类固醇，并且交叉反应性较低。在这里，我们将之前使用的GC-MS方法转换为液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台，提供了经过验证的、全面的类固醇代谢概览，同时显著减少了样品准备时间并提高了通量。尿液中的类固醇首先通过酶法水解，然后使用C18固相萃取法进行提取。定量分析采用三重四极杆质谱仪完成。27种分析物的色谱分离在16分钟内完成，使用了C18-T3色谱柱。由于四氢皮质醇和5α-四氢皮质醇的色谱共洗脱现象，需要在BEH-C18色谱柱上进行第二次注射以实现分离。定量下限（LLOQ）在2至20 ng/mL之间，准确度（偏差）介于-18.7%至19.9%之间，精密度（变异系数 [%CV]）介于4.0%至18.6%之间。所有类固醇的基质效应均保持在理想范围内（<±15%）。回收率在76%至103%之间，样品内和样品间的不精确度（CV）在0.8%至14.9%之间。在40名健康志愿者中，超过95%的样本中检测到了大部分分析物，尽管四氢醛固酮（85%）、5-孕烯二醇（68%）和孕三醇-1（59%）的定量率较低。观察到昼夜和性别差异，这些物质的排泄水平在白天和男性中显著更高。这种稳健的高通量LC-MS/MS方法能够同时定量多种类固醇，从而增强了其在内分泌科学临床和研究应用中的实用性。

1 引言

类固醇激素调节多种关键的生物过程，包括性分化、应激适应、合成代谢和分解代谢以及血压。类固醇激素源自胆固醇，通过内分泌系统和其他器官（尤其是肾上腺皮质和性腺）中的多个酶促步骤生物合成[1]。合成后，它们在肝脏和肾脏中代谢，并通过尿液排出体外。分析尿液中的类固醇谱型有助于表征全身类固醇的生成情况。图1展示了从胆固醇衍生的主要类固醇代谢物、它们的共同生物合成途径，以及血清中常见的类固醇与尿液中排出的类固醇之间的关系（蓝色区域）。类固醇代谢途径的失调会导致各种临床状况。过多的糖皮质激素会导致库欣综合征[2]，原发性醛固酮增多症的特征是醛固酮水平升高[3]，肾上腺癌与类固醇分泌增加有关[4]，而雄激素过多是多囊卵巢综合征的典型特征[5, 6]。酶缺陷（如先天性肾上腺增生中的情况[2]）也会干扰类固醇的生成。这些病理状况通过独特的尿液类固醇谱型表现出来。为了确定哪些类固醇是特定疾病/状况的特征，从单个样本中多类固醇的定量分析具有优势。气相色谱-质谱（GC-MS）长期以来因其高色谱分辨率和重复性而被用作尿液类固醇谱型分析的标准方法[4, 7, 8]。然而，它受到繁琐的衍生化步骤、长时间运行以及高操作成本的限制，这阻碍了其在高通量、大规模样本研究中的应用，并限制了这些方法达到现代标准的验证能力。免疫测定法在临床上用于某些类固醇的分析，但仅限于单一分析物的一次性检测，并且受到交叉反应性的显著影响，可能导致假阳性结果和不准确[9]。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）可用于尿液类固醇谱型分析（USP），与GC-MS相比，它能够以更少的样品准备时间同时定量多种分析物，并且具有更高的特异性、灵敏度和准确性。目前的临床LC-MS/MS测定通常针对小范围的类固醇，主要用于特定的临床应用，以保持方法的简单性。为了提高实验室间的标准化，一些公司（如Chromsystems [11] 和Tecan [12]）开发了包含校准物和内标物的试剂盒，但这些试剂盒主要针对血清类固醇谱型。然而，实施大规模、新颖的类固醇谱型分析（尤其是在尿液中）仍然具有挑战性，因为需要额外的样品准备工作、高昂的成本、复杂的操作以及有限的实验室间标准化。类固醇生成是一个复杂的过程，仅关注单一分析物或类固醇类别可能会限制对其的全面理解。需要能够分析更多类固醇的方法，以提供类固醇代谢的全面视图，这对于发现科学尤为重要，因为在发现科学中，感兴趣的类固醇可能未知，或者需要研究非目标效应。LC-MS/MS多类固醇分析方法已经使得研究几种与类固醇相关的状况成为可能。一个关键的例子是我们用于诊断肾上腺皮质癌（ACC）的15种类固醇USP方法，该方法最初是从32种通过GC-MS定量的类固醇中筛选出来的[4]，随后改进并转移到LC-MS/MS测定中，减少了分析物的数量[6, 13]。以往的发现研究依赖于GC-MS作为发现工具，以识别具有诊断或临床意义的类固醇，但由于该技术的高成本和时间要求，通常只分析少量样本。在这项研究中，我们将之前使用的GC-MS [4, 7] 方法转换为LC-MS/MS平台，旨在提高通量并降低每个样本的成本。为了与我们之前的GC-MS测定[4, 7] 相媲美的特异性，我们尝试分离20α-β和5α-β对、An/Etio、THB/5αTHB、11βOHAn/11βOHEt、α-cortol/β-cortol、α-cortolone/β-cortolone、11OxoAn/11OxoEt以及5α-四氢皮质醇（5αTHF）和5βTHF。本文建立并验证了一种LC-MS/MS USP方法，基于我们已发表的GC-MS方法，提供了包括类固醇前体、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素前体、雄激素以及11-氧化雄激素在内的临床相关尿液类固醇谱型。此外，我们还证明了使用脱水离子作为类固醇定量中的母离子的可靠性和可重复性。我们的验证程序确保了该方法具有准确性、精确性、可重复性、灵敏度和高通量。该方法专为发现科学设计，提供了全面的类固醇覆盖范围，支持生物标志物的发现和临床研究。这里描述的广泛验证程序突显了该方法或其组分的临床转化潜力，为简化、可临床转化的研究提供了基础，特别是针对较小范围特定类固醇的研究。

2 材料与方法

2.1 标准品和质控品的准备

从Merck Life Science（英国Gillingham）、Steraloids（美国Newport）和IsoSciences（美国Philadelphia）购买了29种参考标准和14种同位素标记的内标品。所有标准品和内标品的供应商、通用名称、化学名称和类固醇类别列在表S1中。纯度和身份通过甲氧肟-三甲硅基衍生化后使用GC-MS进行验证[7]。标准品溶解在超高效液相色谱（UHPLC）级甲醇（Biosolve，法国Dieuze）中，浓度为1 mg/mL，并储存在-80°C。所有含有类固醇的样本都储存在经过六甲基二硅烷处理的玻璃小瓶中（Fisher Scientific，英国Loughborough），以最小化类固醇与玻璃的吸附/粘附[14]。通过在不同浓度范围（0–3000 ng/mL；对于尿液中排泄量高的分析物，扩展至6000 ng/mL，见表S2）内添加替代基质，制备了13个校准样本和3个质控（QC）样本。所选的替代基质是含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS），因其易于获取，并且在提取效率和基质效应方面与无类固醇的合成尿液Surine和Sigmatrix Urine Diluent（表S3）相当。

2.2 样品提取方案

尿液样本（200 μL）加入20 μL内标品混合物和200 μL含有Helix pomatia酶的酶解缓冲液，以解离类固醇与其葡萄糖醛酸结合物和/或硫酸结合物。酶解缓冲液由0.2 mol/L醋酸、0.2 mol/L醋酸钠、17 mmol/L抗坏血酸钠以及66酶单位/mL的Helix pomatia硫酸酶组成，所有试剂均来自Merck Life Science（英国Gillingham）。在60°C下孵育3小时后，使用固定式的96孔C18固相萃取（SPE）板（100 mg）在正压下进行提取（Biotage，英国Hengoed）。SPE板先用800 μL UHPLC级甲醇预处理，然后用800 μL UHPLC级水清洗。水解后的尿液样本被施加到SPE柱上，再用水洗三次，最后用800 μL甲醇洗脱类固醇。甲醇洗脱液在50°C下用氮气流干燥，然后用200 μL 50%（v/v）甲醇和水复溶。额外的生物质控样本包括六名志愿者的24小时混合尿液，每个样本批次提取三次。

2.3 色谱分析

色谱分析优化了能够分离不同极性的类固醇，并避免质量相同的类固醇发生共洗脱，同时尽可能缩短运行时间，理想情况下不超过20分钟。色谱分析在Waters Acquity UHPLC系统上进行，使用50 μL循环体积（Waters Ltd，英国Wilmslow），采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm，C18 100 ?，2.1 × 50 mm）（Waters Ltd），温度保持在60°C。注入10 μL复溶后的样本。流动相A为水，流动相B为甲醇，两者均含有0.1%（v/v）甲酸（95%）（Biosolve，法国Dieuze）。为了分离分析物，应用了优化的梯度程序，流速为0.6 mL/min，持续18分钟，起始时流动相B比例为30%。第一分钟内流动相B比例逐渐增加至28%，随后5分钟内增加到39%，再经过7分钟增加到56%。最后，第四个线性梯度在3.5分钟内将流动相B比例增加到70%。之后是98% B的清洗步骤（0.7分钟），然后在下一个注射前在初始条件（30% B）下重新平衡0.8分钟。在上述条件下，5αTHF和四氢皮质醇（5β-THF）发生共洗脱。为了实现这些类固醇的基线分离以便定量，需要使用相同的样本进行第二次10 μL注射，分析采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，C18 130?，2.1 × 50 mm）（Waters Ltd），温度同样为60°C。该方法使用与上述相同的流动相，流速仍为0.6 mL/min。分离过程包括在30%流动相B下保持1分钟，然后应用4分钟至60%流动相B的线性梯度，接着是98% B的清洗步骤（0.7分钟），最后在初始条件（30% B）下重新平衡0.8分钟，准备下一次注射。

2.4 质谱分析

质量检测使用Waters Xevo TQ-XS质谱仪进行，该质谱仪配备电喷雾离子化（ESI）源，工作在正离子模式下（Waters Ltd，英国）。毛细管电压设置为1.5 kV，源温度为150°C，脱溶温度为600°C。Cone气体流量保持在1200 L/h。MassLynx 4.2软件（Waters Ltd）用于仪器控制和质量跃迁的优化。针对每种类固醇，通过直接注入20 μL/min的500 nM溶液（50%（v/v）甲醇/水）来优化鉴定器和定量器的质量跃迁、锥体电压和碰撞能量。针对每个分析物单独优化质量跃迁，并配置采集参数，以确保每个色谱峰至少收集12个数据点以实现准确定量。持续监测定量器离子与鉴定器离子的峰面积比，以评估来自同位素类固醇干扰和基质效应的交叉反应性。将分析物与内标物的峰面积比（响应值）与校准物的理论浓度进行对比。应用线性最小二乘回归（1/x加权）生成标准曲线。保留时间、定量器和鉴定器的质量跃迁、碰撞能量以及锥体电压均进行了全面优化。峰积分和定量使用MassLynx 4.2软件完成，数据分析在Microsoft Excel中进行。

2.5 验证

验证按照已发表的方法和既定指南进行[15]。在所有类固醇的验证过程中，使用了添加了替代基质（spiked surrogate matrix）的样本和生物样本。

2.5.1 恢复率和基质效应（Recovery and Matrix Effects）
对来自男性和女性捐赠者的24小时尿液样本进行了回收率和基质效应的测定，同时也对单独的男性和女性样本进行了测定。每组样本的等分样品在三种条件下进行了三次提取：（1）未添加替代基质（内源性样本）；（2）提取前添加已知浓度的所有类固醇（提取前处理）；（3）提取后添加所有类固醇（提取后处理）。通过比较这些样本来评估回收率。

此外，复溶溶剂（50% UHPLC级甲醇溶于Milli-Q水中，体积比）中也添加了已知浓度的所有目标类固醇，作为非提取对照（非提取响应）。通过以下公式比较内源性和提取后添加类固醇的样本，评估基质效应：

在将结果归一化到内标值后，确定了基质效应，以评估样品基质对测定性能的影响。平均值在-15%到+15%之间被认为是可接受的。

2.5.2 定量限（Limits of Quantification）
定量下的限（LLOQ）是指在添加替代基质的样本中，10次重复测量的浓度下，测定结果的 intra-assay（运行内）变异系数（CV）≤20%，并且从10个单独制备的样本中计算出的准确度（偏差）在理论浓度的±20%范围内的最低浓度。LLOQ以ng/mL为单位进行计算，基于平均24小时尿液体积1400 mL估计了24小时的LLOQ。定量上的上限（ULOQ）是指在添加替代基质的样本中，10次重复测量的浓度下，测定结果的 intra-assay CV ≤15%，并且从10个单独制备的样本中计算出的准确度（偏差）在理论浓度的±15%范围内的最高浓度。

2.5.3 线性（Linearity）
对于每种类固醇，将分析物峰面积与内标峰面积的比值绘制在理论浓度上。要被视为一个可接受的校准系列，每个数据点在LLOQ以上和ULOQ以下时，其准确度（偏差）与理论浓度的偏差不应超过±15%。此外，回归模型的R2值应大于0.99，表明浓度与响应之间存在强线性关系。

2.5.4 不精确度（Imprecision）
除了LLOQ和ULOQ之外，还通过在替代基质中添加三种不同浓度（20、300和800 ng/mL）来评估 intra-assay（运行内）的不精确度（对于大多数分析物）；对于预期排泄量较高的分析物（An、Et、5αTHF、THF和THE），则添加40、600和1600 ng/mL的浓度。选择这些浓度是因为它们代表了尿液中低、中、高排泄量的类固醇浓度范围，从<20到>5000 μg/24小时。因此，提供一个相关的比较基准尤为重要，特别是在指南中规定的参数（如3 × LLOQ）在生物学上不相关的情况下。此外，提取了男性24小时尿液样本、女性24小时尿液样本以及来自六名捐赠者的混合尿液样本。每种样本类型在同一批次中提取并分析了10次，以评估 intra-assay（运行内）的不精确度。计算出的浓度在所有10次提取中的百分比偏差（方差CV%）≤15%被认为是可接受的。Inter-assay（运行间）的不精确度是通过在不同日期进行三次独立分析时，分析男性和女性以及混合的24小时尿液样本来评估的。每种样本类型在每个分析批次中提取了10次。CV%的计算涵盖了所有运行；CV% ≤15%被认为是可接受的。

2.5.5 准确度（Accuracy）
除了LLOQ和ULOQ之外，还向10个单独制备的替代基质样本中添加了三种不同浓度的所有分析物，这些浓度代表了我们参与者队列中观察到的排泄量：对于An、Et、5αTHF、THF和THE，分别为20、300和800 ng/mL；对于An、Et、5αTHF、THF和THE，分别为40、600和1600 ng/mL。与理论浓度的偏差在±15%范围内被认为是可接受的（在LLOQ时为±20%）。

2.5.6 交叉污染（Carryover）
通过分析在注入最高校准标准（大多数类固醇为3000 ng/mL，An、Et、5αTHF、THF和THE为6000 ng/mL）后立即得到的空白样本（50/50甲醇/水）来评估交叉污染。通过比较空白样本中的分析物峰面积与浓缩样本中的峰面积来计算交叉污染百分比。交叉污染小于2%被认为是可接受的。

2.5.7 稳定性（Stability）
为了评估分析物在冻融循环后的稳定性，对混合的24小时尿液样本进行了三次冻融循环后的分析。为了评估制备后样本的稳定性，对混合的24小时尿液样本进行了10次分析，然后将平板重新密封并在-20°C下储存2个月，之后再次进行分析。通过分析2024年1月至2025年6月（18个月）期间多个储存的混合24小时尿液样本，评估了储存样本的长期稳定性。对于所有稳定性评估，比较了定量结果，并计算了所有类固醇的方差CV%；CV% ≤15%被认为是可接受的。

2.6 临床样本（Clinical Samples）
为了评估该方法在临床样本中的实用性，对40名健康志愿者（20名24-69岁的女性和20名22-74岁的男性）的尿液中的类固醇排泄量进行了定量。排除标准包括怀孕和使用类固醇（如口服避孕药）。所有临床样本都来自在招募前提供完整知情书面同意的患者。收集后放置在室温下超过3天的样本被丢弃，以避免细菌生长，这可能会影响类固醇的定量。参与者分别收集了白天和夜间的尿液样本，从中计算了24小时的类固醇排泄量。使用白天、夜间和24小时的样本收集方式反映了典型的临床尿液收集协议。在样本收集过程中，要求志愿者在开始白天收集之前排出第一次晨尿，并持续收集直到准备睡觉时，此时将最后一次尿液收集到白天样本瓶中，并记录收集的小时数。然后开始夜间样本的收集，持续到从开始白天收集后的24小时，包括晨尿。在收集尿液样本时，应从混合良好的样本中取出一份样本，离心并尽快储存在-20°C下。类固醇排泄量以ng/mL计算，并通过乘以样本体积（对于白天或夜间收集）转换为μg/样本。24小时的收集量也用相同的方法计算，并以μg/24 h报告。

3 结果与讨论（Results and Discussion）
该方法在人类尿液类固醇代谢组（约10–5000 μg/24 h）观察到的浓度范围内，满足了灵敏度、特异性、线性、准确度、精确度、基质效应、恢复率和交叉污染的可接受限制。包括了29种关键功能类别的类固醇：前体、类固醇、盐皮质激素、糖皮质激素和雄激素，提供了广泛的代谢覆盖范围，非常适合发现性研究。同时定量多种类固醇提供了类固醇生物合成和代谢的整合视图，促进了探索性内分泌研究。

3.1 质谱和色谱（Mass Spectrometry and Chromatography）
每种类固醇分别独立注入质谱仪，并在正离子化和负离子化模式下进行分析。对于观察到完整的质子化分子离子的情况，将其引入碰撞池，并增加碰撞能量，直到识别出三个稳定的产物离子跃迁。然而，对于某些类固醇，无法检测到完整的分子离子，离子化主要由脱水产物主导，产生了[M-H2O]+或[M-2H2O]+母离子。尝试通过优化源条件来抑制水分损失是不成功的，因此优化了源条件以可重复地产生稳定的水分损失离子（脱溶温度600°C，源温度150°C，氮气脱溶气流1200 L/hr）。在这些优化条件下，水分损失跃迁非常可重复，因此适合进行完整的方法验证，使得原本因无法形成质子化分子离子而被排除的类固醇也能被包括在内。所有分析物形成了[M+H]+、[M-H2O]+或[M-2H2O]+离子（表1）。尽管源设计有所不同，但在两种不同的三重四极杆平台上（Xevo TQ-MS和Xevo XS）确认了水分损失离子的可重复使用性，证明了该方法的稳健性。尽管如此，将该方法转移到其他供应商的平台上可能需要进行大量的源重新优化，特别是在源几何形状或脱溶效率不同的情况下。表1列出了目标类固醇和内标的命名法、保留时间、分子量、离子化物种、定量和定性离子跃迁、锥电压和碰撞能量。分析物（通用名称）
保留时间（分钟）
分子量和分子离子种类
质量跃迁（m/z）（定量器/定性器）
锥形电压（V）（定量器/定性器）
碰撞能量（eV）（定量器/定性器）

**An（雄烯酮）**
13.6
290.44 [M+H]+
291.1 > 273.1（291.1 > 255.1）
18（18）
14（8）

**Et（乙氧基胆甾醇酮）**
13.2
290.44 [M+H]+
291.1 > 255.1（291.1 > 273.1）
12（12）
14（8）

**11βOHAn（11-羟基雄烯酮）**
8.4
306.44 [M+H]+
307.1 > 289.2（307.1 > 271.1）
12（12）
14（12）

**DHEA（脱氢表雄烯酮）**
10.4
288.42 [M+H]+
289.0 > 253.1（289.0 > 271.1）
12（12）
10（8）

**5PT（5-孕烯二醇）**
10.3
334.49 [M-2H2O]+
299.1 > 281.1（299.1 > 157.0）
16（16）
12（18）

**5PD（5-孕烯二醇）**
13.6
318.49 [M-2H2O]+
301.1 > 283.1（283.1 > 105.0）
24（14）
20（22）

**THAs（四氢脱氢皮质酮）**
9.1
348.48 [M+H]+
349.1 > 331.1（331.1 > 104.9）
28（46）
10（42）

**THB（四氢皮质酮）**
8.6
350.49 [M-2H2O]+
315.1 > 297.1（333.1 > 315.1）
36（36）
10（10）

**5αTHB（5α-四氢皮质酮）**
8.8
350.49 [M-2H2O]+
315.1 > 279.1（315.1 > 297.1）
32（32）
10（12）

**THAldo（四氢醛固酮）**
4.9
364.5 [M-H2O]+
347.1 > 329.1（347.1 > 391.1）
6（6）
10（14）

**THDOC（四氢脱氧皮质酮）**
13.2
334.49 [M-H2O]+
317.1 > 299.1（317.1 > 281.1）
22（22）
10（10）

**PD（孕烷二醇）**
15.8
320.51 [M-H2O]+
285.1 > 189.1（285.3 > 92.6）
14（22）
20（30）

**17HP（17-羟基孕烯醇酮）**
14.7
334.49 [M-2H2O]+
299.1 > 105.0（335.1 > 317.1）
22（22）
36（14）

**PT（孕烯二醇）**
14.9
336.51 [M-2H2O]+
301.1 > 90.9（301.1 > 283.1）
20（20）
18（24）

**PTONE（孕烯二醇酮）**
9.7
350.49 [M-H2O]+
333.1 > 315.1（314.1 > 90.9）
16（16）
16（10）

**THS（四氢-11-脱氧皮质醇）**
12.3
350.49 [M+H]+
351.1 > 315.1（351.2 > 90.9）
12（12）
14（10）

**F（皮质醇）**
5.0
362.46 [M+H]+
363.1 > 121.0（363.1 > 90.9）
24（24）
28（16）

**β-cortol**
7.5
368.52 [M-H2O]+
333.2 > 273.2（367.2 > 331.2）
24（24）
16（22）

**α-cortol**
6.6
368.52 [M-H2O]+
331.2 > 273.2（367.2 > 331.2）
24（24）
16（22）

**11βOHEt（11-羟基乙氧基胆甾醇酮）**
8.1
306.44 [M+H]+
307.2 > 271.1（307.2 > 253.2）
12（12）
14（12）

**18OHF（18-羟基皮质醇）**
2.8
378.46 [M+H]+
379.2 > 267.2（383.2 > 271.2）
32（32）
18（28）

**E（皮质酮）**
4.6
360.44 [M+H]+
361.0 > 163.0（361.0 > 104.9）
32（32）
26（38）

**THE（四氢皮质酮）**
8.2
364.48 [M+H]+
365.2 > 347.2（365.2 > 329.2）
12（12）
10（14）

**α-cortolone**
7.6
366.49 [M-2H2O]+
331.1 > 271.2（331.1 > 253.2）
4（4）
18（22）

**β-cortolone**
8.2
366.49 [M-2H2O]+
349.2 > 311.2（370.2 > 352.2）
28（28）
20（22）

**11OxoAn（11-氧基雄烯酮）**
8.6
304.42 [M+H]+
305.1 > 269.1（305.1 > 147.1）
26（26）
10（12）

**11OxoEt（11-氧基乙氧基胆甾醇酮）**
8.4
304.42 [M-H2O]+
287.0 > 229.2（287.0 > 269.2）
4（4）
18（18）

**THF（四氢皮质醇）**
3.6
366.49 [M-H2O]+
349.1 > 301.1（336.2 > 300.2）
28（2）
8（12）

**5αTHF（5α-四氢皮质醇）**
3.5
366.49 [M-2H2O]+
331.1 > 313.1（331.1 > 295.1）
26（10）
8（10）

**内部标准品**

**An-d4（雄烯酮-d4）**
13.5
294.44 [M+H]+
295.1 > 277.2（295.1 > 260.2）
12（12）
8（16）

**Et-d5（乙氧基胆甾醇酮-d5）**
13.1
295.44 [M+H]+
296.2 > 260.2（296.2 > 220.1）
12（12）
18（20）

**DHEA-d6（脱氢表雄烯酮-d6）**
10.3
294.42 [M+H]+
295.1 > 277.1（295.1 > 258.4）
12（22）
10（14）

**18OHF-d4（18-羟基皮质醇-d4）**
2.8
382.46 [M+H]+
383.2 > 271.2（383.2 > 289.2）
32（32）
18（28）

**THAldo-d6（四氢醛固酮-d6）**
4.8
370.5 [M-H2O]+
353.3 > 316.7（353.3 > 334.7）
6（6）
10（14）

**PD-d5（孕烯二醇-d5）**
15.7
325.51 [M-H2O]+
308.2 > 140.1（308.2 > 135.1）
14（14）
20（20）

**PT-d5（孕烯二醇-d5）**
14.9
341.51 [M-2H2O]+
306.2 > 140.1（306.2 > 135.1）
20（20）

**THS-d5（四氢-11-脱氧皮质醇-d5）**
12.3
355.49 [M+H]+
356.2 > 320.2（356.2 > 302.1）
18（18）
12（12）

**F-d4（皮质醇-d4）**
4.9
366.46 [M+H]+
367.2 > 331.1（267.2 > 121.1）
24（24）
24（16）

**THB-d5（四氢皮质酮-d5）**
8.6
357.49 [M-2H2O]+
320.1 > 302.2（320.1 > 284.2）
26（22）
12（10）

**THE-d5（四氢皮质酮-d5）**
8.2
369.48 [M+H]+
370.2 > 352.2（370.2 > 334.2）
12（12）
10（14）

**E-d7（皮质酮-d7）**
4.6
367.44 [M+H]+
369.1 > 169.0（369.0 > 121.0）
40（46）
24（28）

**11OxoEt-d5（11-氧基乙氧基胆甾醇酮-d5）**
8.3
309.42 [M+H]+
310.1 > 292.1（292.0 > 274.1）
4（16）

**THF-d5（四氢皮质醇-d5）**
3.5
371.49 [M-H2O]+
336.2 > 300.2（336.3 > 295.2）
18（18）

**3.2 提高灵敏度的替代方法**
一种提高灵敏度的方法是衍生化[16]。然而，衍生化会引入实验变异，并需要额外的验证实验来评估衍生化的效率和重现性，这会增加方法的成本和复杂性。另一种方法是改变流动相以形成加合物，例如锂加合物[17, 18]，这已被证明可以提高某些尿皮质激素的灵敏度。Wang及其同事报告称，使用THF时灵敏度提高了188倍，THE的灵敏度提高了29倍；但这可能会使我们的检测器饱和。相反，一些皮质激素在形成锂加合物后信号会减弱，例如雄烯酮，从而提高其检测限[LLOQ][17]。这些灵敏度的变化会显著影响我们的检测方法，需要重新进行验证。质量跃迁的选择是使用自动化的Waters IntelliStart软件完成的，该软件识别了每个母离子最丰富的三个产物离子。峰值面积最大的跃迁被指定为定量器，第二强的跃迁被指定为定性器。每种皮质激素注射100次以评估跃迁的稳定性和重现性，每种分析物有两个稳定的跃迁用于定量（表1）。定量器与定性器离子的比率以及内部标准品的峰面积被持续监测，以确保检测的特异性，在分析的样本中未检测到干扰（表S4和S5）。这种广泛的跃迁稳定性评估和内部标准品监测超过了某些使用较少内部标准品或较不严格验证标准的已发表方法[19, 20]。使用甲醇/水梯度，在单次注射中实现了27种分析物的色谱分离，随后进行清洗和平衡步骤，总运行时间为18分钟（图2a,b）。共洗脱的THA和5αTHA被合并为总THAs进行定量。依赖于通过水分损失形成的母离子引入了额外的特异性考虑，特别是对于那些在源诱导脱水后无法区分的具有相同分子量的皮质激素。通过色谱优化解决了这些问题，确保具有相同分子质量或与单次或两次水分损失相关的质子化分子质量的分析物不会共洗脱。在包含的所有皮质激素中均未观察到特异性问题（图2a,b；表1），这表明色谱分辨率可以有效补偿与质量相关的特异性问题。文献中有一些类似的尿皮质激素检测方法。Hyuck等人[19]量化了大量分析物，与本方法中的分析物有重叠，但仅限于10种皮质激素，且内部标准品的覆盖范围有限。Hines等人[20]在2017年使用高分辨率四极 Orbitrap系统对26种皮质激素进行了分析，其中24种包含在本方法中；然而，该方法没有按照同样严格的标准进行验证，且他们只使用了四种内部标准品。

**图2**
(a) 27种皮质激素的色谱分离，基于梯度曲线%B（甲醇0.1%甲酸）与时间（分钟）在HSS-T3柱上的投影。(b) 13种内部标准品的色谱分离，基于梯度曲线%B（甲醇0.1%甲酸）与时间（分钟）在HSS-T3柱上的投影。(c) 第二次注射的色谱分离，用于分离THF、5αTHF和THF-d5，基于梯度曲线%B（甲醇0.1%甲酸）与时间（分钟）在BEH柱上的投影。均在Acquity UPLC和Waters Xevo-XS上完成。C18-T3（三官能C18）柱提供了足够的分辨能力，可以分离多种皮质激素，包括几种生物学上关键的α/β异构体对（An/Etio、THB/5αTHB、11βOHAn/11βOHEt、α-cortol/β-cortolone和11OxoAn/11OxoEt）。Wang等人[17]和Pan等人[18]描述的方法量化了类似数量的皮质激素，但与本方法的重叠有限，且未能分离关键的5α/β异构体对。在我们的方法中，需要第二次注射使用BEH-C18（桥接乙烯杂化）柱来实现THF和5αTHF的基线分离（图2c），以确保这些主要糖皮质激素代谢物的准确定量。我们包含了14种内部标准品，覆盖了色谱范围（包括第一个和最后一个洗脱的皮质激素18OHF和PD），以考虑基质效应和离子化变异性。对于没有匹配内部标准品的分析物，在低、中、高预期排泄浓度（20、300和800或40、600和1600 ng/mL）下评估了准确度（偏差），所有分析物在所有浓度下的偏差范围为-14.9%至14.9%，除了5PD在20 ng/mL（19.1%）和300 ng/mL（-18.8%）（表S6）。所有分析物的携带量（carryover）均≤0.8%，除了PD，其携带量为1.9%。所有值均符合<2%的接受标准（表S6）。

3.2.5 稳定性
冻融稳定性测试显示，在三个循环后，类固醇的定量没有显著变化，变异系数（CV）范围为1.9%至11.8%。制备后的稳定性测试显示，初次提取后的样本在两个月后重新分析时，定量没有差异（CV 3.2%–14.8%）。长期稳定性研究证实，储存于-20°C的尿样在18个月内保持稳定，CV介于9.6%至14.8%之间（表S9）。

3.3 临床效用和背景
为了展示临床效用，对40名健康志愿者的尿液类固醇谱进行了测量。类固醇的排泄量以ng/mL计算，并通过乘以样本体积（无论是白天还是夜晚的收集）转换为μg/样本。24小时收集的数据也采用相同的方法计算，并以μg/24 h报告。浓度范围以μg/样本和μg/24 h（表S10；图3）以及nmol/L（表S11；图S1和S2）表示。大多数样本中的类固醇都能被定量。THAldo（85%）、5PD（68%）和PTONE（59%）的检测频率较低，这与它们的低内源性浓度和较差的电离性一致。对这些志愿者的尿液进行分析是为了展示该方法在不同年龄和性别中的适用性，而不是为了代表参考范围。图3显示了女性（n = 20）24小时（绿色，μg/24 h）、白天（黄色，μg/样本）和夜间（蓝色，μg/样本）的尿液类固醇排泄情况；男性（n = 20）的数据也是如此。类固醇的排泄模式反映了已知的生理差异：白天的排泄量始终高于夜间，且男性高于女性。例如，男性24小时THE的中位排泄量为4161 μg/24 h，而女性为2260 μg/24 h；5αTHF的中位排泄量男性为1718 μg/24 h，女性为545 μg/24 h。这与我们使用GC-MS生成的先前参考范围一致，并且符合已知的性别差异和类固醇生成的昼夜节律，强调了在临床研究中考虑性别、年龄和时间的具体性的重要性。尽管由于复杂性和数据分析要求，当前方法不适用于常规临床生化检测，但它非常适合于发现阶段的研究、生物标志物的识别以及内分泌或类固醇相关疾病的机制研究。这种方法可以为基础，开发出简化且具有临床转化性的测试，针对特定条件的类固醇谱。这些发现支持了该方法在男性和女性广泛年龄范围内的实用性，突出了在临床研究和诊断中考虑具体背景的重要性。尽管在某些样本中DHEA、α-cortol、THAldo、5PD和PTONE的定量较低，但这表明类固醇排泄存在固有的变异性，需要个性化的方法。如果这些类固醇是主要研究目标，应进一步浓缩样本并优化质谱参数。

3.4 方法学背景和比较
将此方法从GC-MS转移到LC-MS/MS可以减少分析时间、降低每个样本的成本并提高通量，同时保持稳健的分析性能。虽然GC-MS作为非靶向研究中的发现工具的重要性不可忽视[7, 8]，但该方法的一个关键优势是它能够进行高通量分析而无需衍生化处理，这是传统GC-MS方法的一个显著限制。与需要耗时化学修饰分析物和复杂样本处理的GC-MS不同，LC-MS/MS提供了简化的工作流程，减少了样本准备时间并提高了通量[6, 13, 23]。与之前发表的方法相比，该方法在分析物覆盖范围、验证深度和内标包含方面具有独特的组合。虽然其他LC-MS/MS方法也量化了相似数量的类固醇，但与当前方法的重叠较少，且一些方法使用的内标较少或无法区分关键的5α/β异构体对[17-20]。使用锂加合物形成的方法可以提高某些分析物的灵敏度，但会改变相对信号强度，从而破坏当前方法的平衡，需要完全重新验证[17, 18]。尿液是一种大量可获得的非侵入性生物流体，其分析可以最小化基质效应，相对于血清或血浆而言，特别是对于糖皮质激素而言，这使得24小时收集成为可能，并能标准化昼夜变化。这种方法为未来开发简化的、具有临床针对性的类固醇谱奠定了基础，将应用于月经周期、更年期、内分泌疾病和药物代谢的研究。为了展示将此方法应用于解决特定临床问题的潜力，该方法根据行业指南中的各种参数进行了验证[15]。由于这是一种多分析物的LC-MS/MS方法，因此为一个类固醇优化参数可能不适用于另一个类固醇；因此，我们找到了一个帕累托最优解决方案以确保方法的可靠性。虽然我们已经证明LC-MS/MS提高了通量和成本效率，但由于其优越的色谱分辨率、广泛的光谱库以及作为识别未知代谢物的参考方法的可靠性，GC-MS在尿液类固醇分析中仍然具有价值，同时还能覆盖广泛的动态浓度范围。实际上，这两种技术应该互补使用，GC-MS提供全面的参考数据，而LC-MS/MS则能够高效地转化为临床和高通量研究。

4 结论
我们开发了一种LC-MS/MS方法，它继承了我们基于GC-MS的尿液类固醇谱分析。这种新方法保留了GC-MS方法中的广泛类固醇分析物类别，同时简化了工作流程并减少了样本准备时间，支持高通量研究及其广泛应用。该方法对于24小时、白天或夜间的尿液收集具有可接受的验证性能，能够实现准确、精确的类固醇定量。该方法能够区分α/β立体异构体对，并展示了在质谱仪源中强制水分丢失转变的适用性和可重复性。这种简化的工作流程可以应用于内分泌研究、诊断和治疗监测。

5 人工智能辅助技术的使用声明
未使用。

作者贡献
Joshua T. Bain：数据整理、正式分析、研究、方法学、验证、可视化、写作——初稿和审稿编辑。
Fozia Shaheen：数据整理、正式分析、研究、方法学、监督、验证、可视化和写作——审稿编辑。
Alessandro Prete：概念构思、资金获取、研究、验证、可视化和写作——审稿编辑。
Lorna C. Gilligan：数据整理、正式分析、研究、方法学、监督、验证、可视化和写作——审稿编辑。
Angela E. Taylor：概念构思、资金获取、研究、方法学、项目管理、监督、验证、可视化、写作——初稿和审稿编辑。

致谢
所有类固醇分析均在伯明翰大学的类固醇代谢组分析核心实验室进行。该项目得到了HT-Advance联盟的支持。该研究由国家健康与护理研究所（NIHR）伯明翰生物医学研究中心（BRC）资助。所表达的观点仅代表作者本人，并不一定代表NIHR或卫生与社会护理部的立场。

资金
本研究获得了欧盟“地平线2022”研究与创新计划（Grant Agreement ID: 101095407）和伯明翰生物医学研究中心（Grant ID: NIHR203326）的资助。

伦理声明
所有相关研究方案均符合赫尔辛基宣言，并获得了伯明翰大学科学、技术、工程和数学伦理审查委员会（ERN_17-0494）的批准。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理请求向相应作者索取。