丝状聚合肌肉肌球蛋白与液-液相分离产生的液滴之间的关系

《ChemBioChem》：Relationship Between Filament-Polymerizing Muscle Myosin and Droplets Generated by Liquid–Liquid Phase Separation

　　摘要

从单个活细胞到多细胞生物的组织和器官，内部液体中含有大量的大分子，如核酸和蛋白质。液-液相分离（LLPS）在理解细胞内发生的大分子介导的现象方面被证明非常有用，这些现象通过传统的生物因素相互作用难以解释。这种LLPS不仅适用于与细胞相当尺度的现象，也适用于更大尺度的现象。我们研究了从肌肉中分离出的代表性分子马达——肌球蛋白的行为与在聚乙二醇（PEG）和右旋糖酐（DEX）组成的二元聚合物溶液中的LLPS之间的关联。无论盐浓度是否允许聚合，肌球蛋白都会定位在富含DEX的液滴中，并聚合成纤维，形成更大的组装体。这些组装体类似于由纠缠的肌球蛋白纤维构成的粗网状结构。相反，当肌球蛋白存在于液滴内部时，液滴会变形为非球形形态。值得注意的是，在肌球蛋白通常会聚合成纤维的盐浓度下，一些变形的液滴甚至会产生尖锐的突起。这些发现表明，LLPS不仅改变了肌球蛋白的行为，反之，肌球蛋白也影响了LLPS形成的液滴的性质。

图解摘要

由于肌球蛋白纤维的组装形成了网状结构，通过液-液相分离（LLPS）形成的液滴发生了变形，甚至产生了突起。迄今为止，这种液滴变形现象尚未被观察到，无论是DNA还是肌动蛋白纤维都无法导致这种变化。同时，肌球蛋白在液滴内部定位，并由于LLPS的作用增强了其聚合能力。

1 引言

活细胞包含多种生物因素，包括高浓度的核酸和蛋白质复合物，这些因素可以引起液-液相分离（LLPS）[1-3]。LLPS引起了极大的关注，因为它已被证明能够解释许多以前难以通过传统视角理解的生物现象，例如基于单个生物因素的结构和功能的讨论，或对特定分子之间独特相互作用的了解[4-6]。通过采用相分离和相变的概念（包括LLPS），人们开始理解了在广泛尺寸范围内以及多种层次结构中生成各种生命必需的稳健系统的机制，这是通过分子自组织的累积实现的。LLPS被认为起核心作用的代表性例子包括：形成和维持没有物理边界（如生物膜）的无膜细胞器[7, 8]；由蛋白质变性或聚集引发的细胞功能障碍或疾病[9-11]；感知温度和压力等物理条件[12, 13]；以及在介观到宏观尺度上对大量生物因素或活细胞群体的空间排序、对齐或行为同步[14-18]。这些过程应该是单个纳米级分子自发构建微米级细胞结构，甚至更大结构（如组织、器官和个体）的基础[14-18]。因此，LLPS的功能是多样的。值得注意的是，出于这些原因，LLPS被认为是生命起源过程中涉及的基本现象之一。关于上述最后一个例子，有报道称LLPS在细胞骨架或其调节和协作因素的功能中起着重要作用[17, 18]。肌肉是最突出的例子，它涉及细胞骨架及其协作因素，并且是从分子到细胞再到组织和器官的不同尺度和层次结构中都表现出来的代表性生物装置[19]。肌肉，特别是骨骼肌，其特征是由许多细胞融合形成的巨大结构、由重复的肌节组成的有序结构、对外部刺激的强抵抗力以及受损时的自我修复能力。肌肉的主要成分是肌动蛋白（代表性的细胞骨架）和肌球蛋白（产生肌动蛋白纤维滑动运动的分子马达）。构成生物体运动装置的细胞骨架和分子马达的组合包括微管和动力蛋白或驱动蛋白，它们负责真核生物的鞭毛或纤毛以及染色体的分离。然而，我们的研究集中在肌动蛋白和肌球蛋白的组合上。单体肌动蛋白的大小约为5纳米，而这里使用的II型肌球蛋白（myosin II）的长度为160纳米。这两种成分都可以从骨骼肌中大量分离出来，并且每种成分都有能力聚合成纤维。它们“自然”地协调和合作，以组装适合各种任务的结构，从在单个细胞尺度上所需的力（如细胞运动、细胞分裂、形态变化和细胞内物质的运输），到支持器官功能的平滑肌，以及执行上述个体生物体尺度所需运动的骨骼肌和心肌[19-22]。那么，这些机制是什么呢？参与反应的单个分子的聚集、在细胞大小的有限空间内的限制，以及与脂质膜的相互作用已被研究作为可能的机制候选者，并发现这些过程在多样化基于肌动蛋白和肌球蛋白的组装体的结构和功能方面是有效的[23-26]。我们还认为LLPS是一个有前景的候选者，并对其效果进行了研究。作为这一方法的第一步，我们之前的研究集中在肌动蛋白上。这些研究表明，LLPS促进了肌动蛋白的聚合，并在富含DEX的液滴中组装了肌动蛋白纤维束，即使存在切断肌动蛋白纤维并阻碍其聚合的因素也是如此，从而导致液滴的形态变化[14, 27]。作为同一方法的一部分，本研究关注了另一个关键参与者——肌球蛋白。本研究中使用的肌球蛋白II是一种分子量为约500 kDa的蛋白质复合物，由两条重链和四条轻链组成，形状类似于萝卜芽。长期以来人们知道，在接近生理盐浓度的溶液条件下（例如100 mM KCl和中性pH值），肌球蛋白II会聚合成称为“粗纤维”的纤维[20, 28]。这些肌球蛋白纤维不仅可以在纵向方向上聚合，还可以在横向方向上聚合，因此它们更厚，没有厚度限制，并且比由肌动蛋白聚合形成的“细纤维”更硬。相比之下，在高盐浓度条件下（例如600 mM KCl），肌球蛋白II以溶解状态存在，不会聚合成纤维。特别是在骨骼肌的肌节中，肌球蛋白纤维伴随着调节其大小和位置的因子，或者作为弹性弹簧或机械增强剂，通过产生肌动蛋白纤维的滑动来引起肌肉收缩[19, 20]。此外，在细胞内，非肌肉类型的II型肌球蛋白虽然具有与骨骼肌相同的整体分子结构，但其活性调节机制不同，但它与各种调节因子以及肌动蛋白纤维一起产生细胞所需的力和运动[21]。当然，为了能量供应、系统稳态的维持和修复，还有许多其他因素也在起作用。这里需要指出的是，肌球蛋白II具有双头结构，有两个称为头部的马达结构。这种双头肌球蛋白结构可以在两个肌动蛋白纤维之间诱导滑动，从而导致肌动蛋白纤维束的收缩/伸长或弯曲，这是由于聚合物存在时的耗尽效应，以及根据极性对肌动蛋白纤维进行排序[23, 29]。通常使用由具有不同结构和性质的可溶性聚合物（如聚乙二醇（PEG）和DEX）组成的水相双相系统（ATPS）来研究LLPS的相关性和效果。同样，许多研究试图利用ATPS来开发细胞结构的自组装模型，包括人工无膜细胞器的重建[30-35]。在这项研究中，为了研究导致溶液分离的LLPS与上述具有聚合纤维能力的肌球蛋白II之间的相互作用，我们观察了在PEG和DEX混合物中的肌球蛋白行为。在这里，我们将讨论LLPS和肌球蛋白之间的关系及其对细胞或生物体发展所需的自组织机制的重要性。

2 结果与讨论

2.1 当肌球蛋白在允许其聚合的盐浓度下添加到PEG/DEX溶液中时的液滴和肌球蛋白

在生理盐浓度下，肌球蛋白会聚合成粗纤维。本研究中使用的溶液KCl浓度为100 mM，模拟了这种条件。在这种条件下，几乎所有添加到PEG/DEX溶液中的肌球蛋白都定位在富含DEX的液滴内部（图1a）。尽管液滴内的DEX浓度似乎是恒定的，但肌球蛋白在液滴内的分布是不均匀的，有些区域没有肌球蛋白，有些区域存在各种大小的许多肌球蛋白纤维，还有些区域存在较大的肌球蛋白组装体（图1b）。这些肌球蛋白组装体呈现出各种形状和大小的粗网状结构，表明它们是由肌球蛋白纤维的纠缠形成的。

图1：在可聚合条件（100 mM KCl）下的PEG/DEX溶液中的肌球蛋白。(a) 显示了相位对比图像、DEX荧光图像、肌球蛋白荧光图像以及它们的合并图像。这些图像是在混合溶液10分钟后获得的。在合并图像中，DEX和肌球蛋白的分布分别用绿色和洋红色表示。(b) 上方面板显示了一个典型液滴的荧光图像。下面板显示了其荧光强度曲线。荧光强度分别来自DEX（垂直轴，左侧）或肌球蛋白（右侧），沿着图中黄色线指示的位置测量。(c) 无肌球蛋白（?）或有肌球蛋白（+）时富含DEX的液滴的纵横比（左侧）和Lo/L-1（右侧）。值“Lo/L-1”是一个形状畸变的参数。其他图表也适用相同的说明。包括计算方法在内的详细信息在实验部分有描述。每个数据的平均值、标准差和样本量（平均值 ± 标准差，n）从左到右依次为1.008 ± 0.005，n = 57；1.105 ± 0.095，n = 39（对于纵横比）；0.063 ± 0.009，n = 57；0.077 ± 0.025，n = 39（对于Lo/L-1）。同时，含有肌球蛋白的液滴从通常的球形发生了形态变化。在这项研究中，使用四个指标评估了液滴的形态变化：纵横比表示伸长程度，“Lo/L-1”表示形状畸变程度，圆度表示形状不均匀程度，以及圆形度。所有这些指标都表明液滴明显发生了变形（图1c和S1）。此外，在允许肌球蛋白聚合的60 mM KCl溶液条件下，如上所述，几乎所有肌球蛋白都定位在液滴内部，形成了网状组装体（图2a）。大多数液滴发生了变形，这可能是由于内部存在肌球蛋白组装体。图2：在100 mM和60 mM KCl条件下观察到的液滴。(a) 左列中的上下图像分别是100 mM和60 mM KCl条件下的液滴示例。显示了相位对比图像、DEX荧光图像、肌球蛋白荧光图像以及它们的合并图像，与图1a相同。右侧的柱状图显示了肌球蛋白沿黄色线条所指示位置的荧光强度分布情况，该位置位于左侧合并图像中黄色方块所标记的凸起区域附近，如图1b所示。 (b) 将变形液滴的长轴方向与其中肌球蛋白纤维组装的排列方向进行比较。 (i) 一个两个方向相对一致的液滴示例。 (ii) 比较肌球蛋白纤维的总长度（长度与数量的积分），其中一些纤维的方向在内部范围内（相对于液滴长轴的-30°到30°），而另一些则在外部范围内（相对于液滴长轴的-90°到-30°和30°到90°），并通过与整个角度区间（相对于液滴长轴的-90°到90°）的平均值之比来展示这些结果。这些是八个液滴分析结果的箱线图。内部和外部范围的结果分别用橙色（平均值±标准差为1.085±0.150）和蓝色（0.957±0.075）表示。另请参见图S2中展示的其他示例。 (c) 将肌球蛋白添加到15%的DEX或PEG/DEX溶液中，然后通过电子显微镜进行观察。前者溶液（15%）的DEX浓度是根据之前研究[27]中确定的DEX相的浓度来决定的。溶液中的KCl浓度为100 mM。

2.2 变形液滴的突起形成

一些由于内部存在肌球蛋白纤维及其组装而变形的液滴呈现出类似纺锤体的形状，而不是椭圆形球体形状（图2a）。这些液滴甚至具有尖锐的突起。值得注意的是，无论盐浓度是60 mM还是100 mM KCl，只要肌球蛋白能够聚合，这些突起都会被观察到。突起通常沿着纺锤体液滴的长轴方向或变形液滴凸出部分的延伸方向排列，例如多边形的顶点。在形成突起的地方，总是观察到肌球蛋白（可能是肌球蛋白纤维的阵列）垂直于DEX富集相和PEG富集相之间的边界，并从DEX富集相的液滴中突出。应当指出，这里发现的变形DEX富集液滴的突起是肌球蛋白特有的。在肌动蛋白的情况下，LLPS促进了聚合，导致在DEX富集相的液滴内部形成肌动蛋白纤维及其束，从而导致液滴变形，但并未形成突起[14, 27]。至于DNA，即使将长的双链DNA或DNA复合物（例如通过DNA折纸制备的）也加入到液滴中，它们不仅不会在液滴中形成突起，也不会导致液滴变形[14-16, 30]。肌球蛋白、肌动蛋白和DNA之间的这些差异可能仅仅是由于每种纤维的厚度和弹性不同所致。如果是这样，其他细胞骨架成分，如微管、中间纤维和隔膜蛋白，以及其他蛋白质/肽纤维（包括淀粉样纤维），甚至更广泛的各类糖类，也可能根据各自的性质通过LLPS相互作用[14, 16, 18, 19]。由于肌球蛋白引起的液滴长轴方向与形成的突起方向之间存在关联，并且肌球蛋白对于突起的形成至关重要，接下来我们研究了变形液滴的形态（如椭圆形球体或纺锤体形状）与肌球蛋白纤维及其组装的排列之间的关系（图2b和S2）。获得的结果表明，液滴内部的肌球蛋白排列方向与液滴变形方向之间存在微弱的相关性（双侧t检验，p=0.056）。结合肌球蛋白总是在突起形成处存在的事实，以及溶液条件允许肌球蛋白聚合的事实，可以推测这里观察到的液滴变形是由肌球蛋白聚合形成的粗纤维造成的。支持这一预测的是，电子显微镜揭示了在模拟液滴内部DEX浓度的溶液以及PEG/DEX溶液中，由于肌球蛋白纤维的进一步纵向组装及其缠结形成了非常长的纤维和网状结构（图2c）。

2.3 当在不允许肌球蛋白聚合的盐浓度下将肌球蛋白添加到PEG/DEX溶液中时的液滴和肌球蛋白

为了进行比较，在肌球蛋白通常不会聚合的盐浓度下进行了与上述相同的实验。在这种情况下，使用了KCl浓度为600 mM的溶液。即使在高盐浓度下，肌球蛋白在PEG/DEX溶液中的液滴内部仍然局部聚集，并意外地形成了纤维（图3a和b）。然而，在这种高盐浓度下，肌球蛋白在液滴内部相对均匀地分布。这可能是由于单个肌球蛋白纤维较小，因此它们形成的组装也较小，从而形成了更细的网状结构，这与通常不允许肌球蛋白聚合的条件是一致的。图3 在图查看器中打开 PowerPoint

图3 在非聚合条件下（600 mM KCl）的PEG/DEX溶液中的肌球蛋白。(a) 显示了相衬图像、DEX荧光图像、肌球蛋白荧光图像以及这些图像的合并图像，如图1a所示。(b) 上方面板显示了一个典型液滴的荧光图像。下面板显示了沿图像中黄色线条所指示位置测量的DEX（纵轴，左侧）或肌球蛋白（右侧）的荧光强度分布，如图1b所示。(c) 显示了无肌球蛋白（-）或有肌球蛋白（+）时液滴的纵横比（左侧）和Lo/L-1（右侧）。为了比较，再次展示了在100 mM KCl条件下获得的结果（见图1c，请注意纵轴的刻度不同）。从左到右，600 mM条件下的每个数据的平均值、标准差和样本量分别为1.008±0.005，n=34；纵横比为1.178±0.148，n=24；Lo/L-1分别为0.068±0.016，n=34和0.134±0.079，n=24。(d) 将变形液滴的长轴方向与其中肌球蛋白纤维组装的排列方向进行比较。(i) 一个变形液滴的结果示例。(ii) 比较肌球蛋白纤维的总长度（长度与数量的积分），其中一些纤维的方向在内部范围内，而另一些在外部范围内，通过与整个角度区间平均值的比率来展示这些结果，如图2b所示。这些是六个液滴分析结果的箱线图。内部和外部范围的结果分别用橙色（平均值±标准差为0.933±0.140）和蓝色（1.034±0.070）表示（双侧t检验，p=0.157）。即使在这种条件下，尤其是随着时间的推移，也观察到了由于肌球蛋白在内部积累并随后形成纤维或组装而导致的液滴变形。与100 mM或更低KCl条件下获得的结果相比，肌球蛋白在这种高盐浓度下诱导了更多样化的形态变化，不仅仅是液滴呈现纺锤体形状。实际上，在600 mM KCl条件下获得的液滴形态参数显示，液滴不仅显著变形为非球形，而且变形液滴的形状也与在100 mM KCl下添加肌球蛋白时的情况不同（图3c和S3）。此外，一个重要的形态差异是，在低盐浓度下观察到的液滴突起在高盐浓度下并未出现。我们将变形液滴的长轴方向或它们最伸长的方向与其中肌球蛋白纤维及其组装的排列方向进行了比较，同样在600 mM KCl条件下。在这种高盐浓度下，没有观察到相关性（图3d）。因此，由肌球蛋白添加引起的液滴变形机制或过程在100 mM KCl和600 mM KCl浓度之间似乎有所不同。由于KCl浓度为600 mM，肌球蛋白处于单独溶解的状态，它可能逐渐聚合为纤维，并在液滴内部的不同位置独立形成组装。很可能，以这种方式形成的肌球蛋白纤维或组装不仅体积小，而且由于缺乏各向异性且没有任何几何特征，因此定位在液滴内部，导致相对均匀的分布。结果，液滴表现出多种不规则的变形，这些变形呈多边形，与纺锤体形状不同。为了验证这一预测，我们在保持最终KCl浓度为600 mM的情况下，观察了肌球蛋白在PEG/DEX溶液中的时间进程（图4a）。值得注意的是，混合后几乎立即，大部分肌球蛋白位于DEX富集相，即液滴内部。同时，如预期，液滴内部的肌球蛋白聚合逐渐进行。最初，肌球蛋白在整个液滴中的分布几乎是均匀的，但随着时间的推移，观察到了纤维或它们的组装（图4b）。

图4 在非聚合条件下（600 mM KCl）的DEX存在下的肌球蛋白。(a) 在保持最终KCl浓度为600 mM的情况下，向PEG/DEX溶液中添加溶解后的肌球蛋白后观察到的时间进程图像。混合后10分钟、30分钟和60分钟时的相衬图像、DEX荧光图像、肌球蛋白荧光图像以及这些图像的合并图像。(b) 10分钟和60分钟后一个典型液滴的肌球蛋白荧光强度分布。在10分钟和60分钟后的两种情况下，上面板显示了一个典型液滴的荧光图像。右侧和下面板显示了沿相应图像中黄色线条所指示位置测量的荧光强度分布。(c) 在不同DEX浓度下的肌球蛋白。(i) 肌球蛋白荧光图像的示例。每个图像上方标明了DEX浓度。(ii) 形成纤维和组装的肌球蛋白的数量。对于每个荧光图像，积分了显示荧光强度高于阈值的区域（在所有图像中统一设置）的荧光强度和像素数量，然后将其除以平均荧光强度和总像素数（总面积）的乘积。该面板显示了每个DEX浓度的平均值（左侧纵轴，条形图，误差条显示标准差）和对数值（右侧纵轴，折线图）（如下图或每个点下方所示）。对于条形图中的每个数据，从0%到15%的DEX浓度，分别为0.000135±0.000175（n=4），0.000448±0.000240（n=4），0.00363±0.00242（n=6）和0.0326±0.0291（n=5）。(d) 将肌球蛋白添加到15%的DEX或PEG/DEX溶液中，然后通过电子显微镜进行观察。溶液中的KCl浓度为600 mM。在通常不会发生聚合的溶液条件下也观察到了聚合的促进[14, 27]。据认为，由于在聚合物拥挤环境中存在的耗尽效应，聚合与解聚之间的平衡显著偏向聚合方向，同时诱导了在DEX富集相中的积累。在这里，为了研究肌球蛋白的情况，我们观察了在600 mM KCl条件下DEX溶液中的肌球蛋白状态（图4c）。随着DEX浓度的增加，肌球蛋白的聚合呈单调增加，在15%的DEX浓度下所有肌球蛋白都发生了聚合，这大致相当于之前研究中确定的DEX富集相中的DEX浓度[27]。这些结果表明，与肌动蛋白的情况类似，由于LLPS的作用，肌球蛋白在DEX富集相中浓缩，并且聚合得到了DEX的促进，即使在通常不会发生聚合的高盐浓度条件下也形成了纤维。此外，电子显微镜观察发现，即使在高盐浓度下，由LLPS效应形成的肌球蛋白纤维结构也是短而粗的，显然是由多个肌球蛋白纤维并排粘附形成的（图4d）。

2.4 肌球蛋白纤维与液滴变形

在PEG/DEX溶液中，液滴的形成和球形形态在不同盐浓度下没有差异，至少在没有添加蛋白质的情况下是这样（图S4）。因此，在不同盐浓度下观察到的液滴变形和突起形成的差异是由于液滴内部肌球蛋白纤维状态的差异所致。这里将讨论液滴变形的机制，重点关注由肌球蛋白等蛋白质形成的纤维的特性，并将其与肌动蛋白纤维进行比较。在肌动蛋白的情况下，大量的肌动蛋白纤维位于液滴与外界的边界或边缘，而不是内部。沿着边界的肌动蛋白纤维可能会减少边界的曲率，导致液滴呈现多面体形状，或者可能阻止接触的液滴之间的融合，使其呈现珠状[14, 27]。另一方面，肌球蛋白除了参与突起的形成外，主要在液滴的内部形成网状结构。这些肌球蛋白分布的特点与肌动蛋白纤维明显不同（图1-4）。在富含DEX的液滴中，不仅在100 mM KCl条件下，而且在600 mM KCl条件下，肌球蛋白都会聚合形成纤维，这些纤维的组装和/或网状结构导致了液滴的变形（图1和3）。在低盐浓度如100 mM KCl下，由于允许肌球蛋白聚合，形成了更长且相对较大的肌球蛋白纤维（图2）。由于这种肌球蛋白纤维形成的网状结构会变大（也更粗糙），有些可能会影响到整个液滴。在这种情况下，通过网状结构的机械性质与液滴整体形状之间的反馈，液滴的变形和构成网状结构的肌球蛋白纤维的重新定向可能会同时发生，并且方向相同。结果，液滴倾向于变形为类椭圆形球体。此外，肌球蛋白纤维本身及其束比肌动蛋白纤维束更粗，因此它们能够克服作用在液滴边界的张力，这是肌动蛋白纤维束无法做到的，使它们能够在垂直方向上延伸，从而导致突起的形成。在高盐浓度如600 mM KCl下，形成了粗壮且相对较小的肌球蛋白纤维（图4）。这种肌球蛋白纤维形成的网状结构虽然细密，但体积较小，只能影响液滴的有限部分。然而，如上所述，这些肌球蛋白纤维及其组装可能能够克服作用在液滴边界上的张力，导致液滴的某一部分独立于其他部分的变形而发生变形。因此，液滴可能表现出多种不规则的变形，如多边形或扭曲的形状。如上所述，我们基于肌球蛋白纤维的结构及其形成的束或组装的比较，考虑了肌球蛋白纤维组装与液滴形态发生之间的关系。然而，目前尚未直接测量肌球蛋白纤维的大小、形状和硬度，以及液滴的弹性、界面张力和粘弹性响应。如果能够测量并定量分析这些机械性质，将有助于确定控制液滴形态发生的关键物理参数。此外，如果能够进行理论分析并结合实验研究，我们可以通过阐明肌球蛋白或其片段（下文将描述）的特性与液滴变形方式（例如，确定它是椭圆形还是多边形，或者是否形成了突起）之间的关系，在分子或介观层面上加深对这一机制的理解。实际上，近年来人们一直在积极尝试进行分子动力学模拟或构建在LLPS条件下肽行为的粗粒度模型，以便将这些方法扩展到包含肌动蛋白和肌球蛋白的系统[36, 37]。

2.5 肌球蛋白参与液滴变形的区域

为了研究肌球蛋白聚合形成的纤维是否完全负责观察到的肌球蛋白和液滴的行为，还使用了通过蛋白酶切割肌球蛋白获得的两种类型的片段进行了实验。一种片段称为轻链肌球蛋白（LMM），它包含肌球蛋白聚合和纤维形成所必需和足够的区域；另一种片段称为重链肌球蛋白（HMM），它包含用于滑动肌动蛋白纤维的马达结构域（称为头部）以及从头部延续下来的区域（称为颈部）（图5a）。

当添加LMM而不是肌球蛋白时的结果。(a) 本研究中使用的肌球蛋白（Myosin II）的分子结构模型，显示了两种蛋白酶切割片段LMM和HMM区域。两条重链以卷曲-卷曲结构连接在一起。绿色区域表示马达结构域的头部。请注意，为了简化，该模型仅显示了重链的部分，并省略了四条轻链。(b) LMM在PEG/DEX溶液中的情况。(i) 和 (ii) 分别是在100 mM和600 mM KCl条件下观察到的相位对比图像、DEX荧光图像、LMM荧光图像以及合并图像。(c) 显示了在100 mM和600 mM KCl条件下，没有（?）或存在LMM（用“+ L”表示）时液滴的纵横比（左）和Lo/L-1（右）。为了比较，除了没有任何添加蛋白质的对照结果外，还再次展示了添加肌球蛋白时的结果（如图1和3所示，请注意纵轴的刻度不同）（用“+ M”表示）。在存在LMM的情况下，每个数据的平均值、标准差和样本量分别为：纵横比为1.027 ± 0.034，n = 33（100 mM）和1.008 ± 0.007，n = 25（600 mM）；Lo/L-1分别为0.067 ± 0.018，n = 33（100 mM）和0.072 ± 0.015，n = 25（600 mM）。含有LMM的液滴的圆度和圆形度显示在图S5中。(d) 将LMM添加到15% DEX或PEG/DEX溶液中，然后通过电子显微镜观察。溶液的KCl浓度为100 mM或600 mM，如每张图像所示。当在PEG/DEX溶液中添加LMM而不是肌球蛋白时，它无论在何种盐浓度下都会定位于富含DEX的液滴中，并且在低盐浓度100 mM KCl下，液滴内部特别形成了明显的纤维结构（图5b）。然而，液滴仍然几乎是球形的（图5c和S5）。与对照组显著不同的结果仅出现在100 mM KCl下的纵横比和圆度，这与观察到纤维结构的情况一致（图5b和d）。由于LMM是肌球蛋白的片段，其分子较短（图5a），这可能是液滴未发生变形的原因。因此，为了补偿这一点，添加了更高浓度的LMM，但结果没有改变（图S6）。如上所述，在所有KCl浓度下，肌球蛋白在所有参数上都观察到了显著差异。因此，肌球蛋白和LMM在液滴变形能力上的差异表明，除了蛋白质纤维形成之外，还有其他因素可能参与了肌球蛋白引起的液滴变形。HMM仅在100 mM KCl的盐浓度下影响了液滴，而在600 mM KCl下则没有影响（图6a）。当使用100 mM KCl时，液滴形态的所有参数都与对照组和添加肌球蛋白的情况有显著差异（图6b和S7）。另一方面，在600 mM KCl下，HMM均匀地定位于富含DEX的液滴内部，但没有影响液滴的形状或行为。实际上，对于所有液滴形态参数，与对照组没有显著差异。在100 mM KCl盐浓度下随时间观察的结果表明，集中在富含DEX的液滴内的HMM倾向于导致液滴聚集和/或模糊PEG富集相和DEX富集相之间的边界，而不是被解释为液滴的变形（图6c）。由于HMM的效果明显依赖于溶液的盐浓度，这可能是由于HMM中大量碱性氨基酸残基产生的静电效应所致。为了验证这一点，使用了仅由碱性残基赖氨酸组成的多聚-L-赖氨酸（PLL）代替HMM，并观察了液滴的行为。然而，PLL没有显示出任何效果（图S8）。因此，HMM对LLPS的影响似乎并不仅仅是由蛋白质片段的电荷引起的。

当添加HMM而不是肌球蛋白时的结果。(a) HMM在PEG/DEX溶液中的情况。(i) 和 (ii) 分别是在100 mM和600 mM KCl条件下观察到的相位对比图像、DEX荧光图像、HMM荧光图像以及合并图像。(b) 显示了在100 mM和600 mM KCl条件下，没有（?）或存在HMM（用“+ H”表示）时液滴的纵横比（左）和Lo/L-1（右）。为了比较，除了没有任何添加蛋白质的对照结果外，还再次展示了添加肌球蛋白时的结果（如图1和3所示，请注意纵轴的刻度不同）（用“+ M”表示）。在存在HMM的情况下，每个数据的平均值、标准差和样本量分别为：纵横比为1.242 ± 0.159，n = 50（100 mM）和1.017 ± 0.054，n = 38（600 mM）；Lo/L-1分别为0.133 ± 0.075，n = 50（100 mM）和0.064 ± 0.009，n = 38（600 mM）。含有HMM的液滴的圆度和圆形度显示在图S7中。(c) 当在100 mM KCl的PEG/DEX溶液中添加HMM时观察到的时间进程图像。图像显示了直到60分钟的时间段。显示的图像与(a)中的相同。两种肌球蛋白的蛋白酶切割片段都没有显示出与完整肌球蛋白相同的效果，这表明整个肌球蛋白分子对于本研究中观察到的肌球蛋白与LLPS效应之间的关系很重要。需要注意的是，有报道称，当去除骨骼肌肌球蛋白的头部后，它可以在体外形成纤维，但在体内无法正确组装成肌节的结构[20]。这可能与我们的发现有一定的相关性。这里还应该注意的是，有报道称富含DEX的液滴会积累阳离子[38]。这种效应可能导致富含DEX的液滴倾向于粘附在带负电的玻璃表面上，从而导致它们的变形。如果是这种情况，那么增加溶液的盐浓度应该会由于增强这种效应而引起液滴变形。然而，这里获得的结果表明，液滴保持了球形，不受盐浓度的影响（图S4），并且在存在PLL的情况下也是如此（图S8）。只有在添加了完整的肌球蛋白分子时才观察到液滴的变形（图1-3），而最明显的变形——突起的形成——仅发生在低盐浓度下（图2），这表明肌球蛋白负责观察到的液滴变形。

3 结论

从活细胞到多细胞生物的组织和器官，内部液体中含有许多大分子，如核酸和蛋白质。LLPS在理解发生在相当于或大于细胞大小的尺度上的大分子介导的现象方面被证明是有用的，这些现象通过传统的生物因素之间的相互作用很难解释。我们研究了从肌肉中分离出的代表性分子马达——肌球蛋白的行为与在含有PEG和DEX的二元聚合物溶液中形成的LLPS（长程聚合有序结构）之间的关联。本研究的主要发现如下：无论盐浓度是否允许聚合，肌球蛋白都会聚集在富含DEX的液滴内部。在100 mM KCl和600 mM KCl的条件下，肌球蛋白都会聚合形成纤维，并在这些液滴内部形成纤维组装体或网状结构。在100 mM KCl下观察到了更长更粗的纤维，而在600 mM KCl下则观察到较短且粗短的纤维，这可能是由于多个肌球蛋白纤维之间的侧向粘附所致。相反，随着肌球蛋白组装体的形成，液滴会变形为非球形，即在100 mM KCl下呈现椭圆形，而在600 mM KCl下则呈现多种不规则形状。值得注意的是，只有在100 mM KCl条件下，肌球蛋白能够正常聚合形成纤维时，一些变形的液滴才具有尖锐的突起。液滴内部聚合的肌球蛋白纤维的结构特征似乎与液滴的变形形态一致。实际上，在100 mM KCl条件下，肌球蛋白纤维及其组装体的方向与液滴的长轴方向存在某种微妙的关系。此外，肌球蛋白引起的液滴变形需要整个分子的参与。因此，本研究中观察到的现象不仅仅依赖于蛋白质纤维/组装体的形成，还必须基于一个复杂的机制，该机制可能涉及其他效应。这些结果表明，LLPS不仅改变了在肌肉中工作的分子马达肌球蛋白的行为，反过来，肌球蛋白也会影响在聚合物溶液中由于拥挤效应和耗尽效应而形成的细胞大小或更大尺度液滴的性质。虽然这些结果距离阐明分子如何自动组装成大型复杂组织（如肌纤维）或规则周期性结构（如肌节）的机制还有很长的路要走，但我们认为这项研究为理解这些过程迈出了重要的一步。作为下一步，有必要研究肌动蛋白纤维和肌球蛋白共同产生的功能，以及它们共存时出现的现象，不仅是在聚合物存在的情况下，还要考虑LLPS和液滴对溶液的隔离效应的影响[23, 29]。另一个需要解决的关键问题是观察到的肌球蛋白诱导的液滴变形和突起形成的普遍性，即这些原理是否可以直接应用于实际的生物环境。在本研究中，我们使用了PEG和DEX组成的ATPS（聚合有序溶液），这种组合在LLPS研究中经常被使用[30-35]。通过扩大分析范围，例如改变PEG和DEX的分子量，或者使用其他聚合物或LLPS系统，将有助于增强本研究关于聚合物的拥挤效应和耗尽效应与肌球蛋白聚合及液滴形态发生之间关系的生物学意义。最后，关于LLPS在溶液中产生的独特相，特别是本研究发现的液滴变形（尤其是突起的产生），可能会导致同一相的不同区域通过细通道连接起来，或者调节不同相之间的边界形状和面积。关于这些“连接通道”的结构，在生物体中起着重要作用，据认为涉及细胞骨架/分子马达和/或LLPS，例如神经元中的树突棘、植物细胞中的胞间连丝以及核孔等[39-43]。

4 实验部分

4.1 试剂和溶液

我们使用了之前描述的由PEG和DEX组成的ATPS[14, 15, 27]。PEG 6,000购自富士胶片和和光纯药工业株式会社（日本大阪）；其平均分子量为7,300至9,300 Da。DEX也购自富士胶片和和光纯药工业株式会社；其平均分子量为180,000至210,000 Da。作为富含DEX区域的示踪剂，购买了荧光异硫氰酸酯标记的DEX（FITC-DEX）（Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯）。作为富含PEG区域的示踪剂，购买了甲氧基PEG荧光素（mPEG-Fluorescein）（Nanocs公司，美国纽约州纽约）。这些聚合物溶解在Milli-Q水中（18.2 MΩ·cm），制备成浓度为10–30 wt%的储备溶液。在混合其他溶液之前，会先搅拌PEG和DEX的混合物。其他特殊级或更高级的生化试剂也购自富士胶片和和光纯药工业株式会社，并使用Milli-Q水制备储备溶液。最终样品溶液的组成为：5% PEG、5% DEX、5 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.2 mM DTT、2 mM MgCl2、2 mM ATP、0.9 mM NaHCO3、60、100或600 mM KCl，以及0.5 μM肌球蛋白或其片段LMM或HMM。在使用荧光图像确认相分离时，分别将4.9% DEX或PEG与0.1% FITC-DEX或mPEG-Fluorescein混合。每个实验中的盐浓度（即KCl的浓度）或蛋白质浓度（如果蛋白质浓度与上述不同）在图例中有所说明。

4.2 蛋白质

按照之前的方法[44]，从兔骨骼肌中制备了50%甘氨酸化的肌球蛋白储备溶液。使用胰凝乳蛋白酶[45]从甘氨酸化的肌球蛋白中消化出HMM和LMM。对于LMM，进一步通过聚合-解聚循环[46, 47]进行分离。肌球蛋白及其片段在溶解条件下（特别是高离子强度条件下的600 mM KCl）用Cy-5染料（COSMO BIO，日本东京）进行荧光标记。未改性的染料通过两次聚合/解聚循环后进行透析处理，然后对肌球蛋白和LMM进行透析，对HMM也进行透析。需要注意的是，这种染料不会影响LLPS和液滴的形成，尤其是富含DEX相的液滴的球形形态，甚至倾向于分布在富含PEG的相中（见图S9）。这表明使用这种试剂荧光标记的蛋白质样品可以放心使用，无需担心副作用。在所有实验中，肌球蛋白及其片段都在600 mM KCl浓度的溶液中透析并保存，然后再与其他溶液混合。如上所述，用于本研究的蛋白质是从兔子中分离和纯化的。我们声明已经获得了名古屋大学（研究生院）的动物实验伦理批准（批准编号：S220005-001、S230001-002、S240001-001和S250001-001），并且研究是按照日本科学理事会制定的“正确进行动物实验的指南”进行的。

4.3 光学显微镜

使用相位对比显微镜和荧光显微镜（BX60/IX70，奥林巴斯，日本东京/BX53，Evident，日本东京）以及配备偏振单元和相机（WAT-910HX，Watec，日本鹤冈/IR-1000，DAGE-MTI，美国密歇根州米城/ORCA Flash 4.0V3，Hamamatsu Photonics，日本滨松）获取图像。使用PC将获取的图像记录在HDD上[27]。使用ImageJ程序（http://imagej.nih.gov/ij/）调整对比度并分析图像，如下所述。将PEG/DEX和肌球蛋白或其片段的混合物溶液放入由载玻片和双面密封件（SLF0601 Frame-Seal 15 × 15 mm 65 μL，BIO-RAD，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）制成的每个微室中，然后用盖玻片密封，然后进行显微镜观察。

4.4 电子显微镜

将每个样品的2 μL液滴滴在经过辉光放电处理的碳涂层铜网上。等待1分钟让其沉淀后，擦去多余的溶液，然后用2%醋酸铀盐对样品进行染色。使用H-7600透射电子显微镜（日立高科技公司，日本东京）在100 kV加速下观察样品。图像由Orius SC200D CCD相机（Gatan公司，美国加利福尼亚州普莱森顿）记录。

4.5 图像分析

使用以下参数评估液滴的形态变化：长宽比（长轴与短轴的长度比）、"Lo/L-1"（实际从横截面图像测量的周长除以从同一图像测量的面积计算出的理论周长，然后减去1）、圆度（实际从横截面图像测量的面积的4倍除以长轴长度的平方和π）以及圆形度（实际从横截面图像测量的面积的4π倍除以从同一图像测量的周长的平方）。每个数据都以小提琴图的形式呈现，线条表示中位数和四分位数范围。为了评估上述液滴形态，将DEX衍生的荧光图像二值化并使用ImageJ进行测量（见图S10）。需要注意的是，如果富含DEX相的液滴尺寸较小，即其荧光图像对应于较小的横截面图像，使用ImageJ测量的周长可能会大于实际长度，这可能是由于图像分辨率和像素大小之间的差异，导致难以准确评估。为了解决这个问题并尽量减少伪影，我们根据以下程序设置了面积阈值，并仅分析大于该尺寸的液滴。首先，在对照实验条件下，即在没有肌球蛋白的情况下，液滴仅呈现圆形；从这些图像中获得了未经处理的周长和经过近似椭圆处理后的周长，并将前者与后者的比值绘制在每个液滴的面积上。该曲线类似于一个渐近趋近于1的衰减曲线。这个曲线被认为是两组结果的总和：一组是小液滴，其周长大于实际长度；另一组是足够大可以使用ImageJ分析的液滴。为了方便起见，该曲线减去1后，然后拟合为两条指数曲线的和，两条曲线相交处的面积被定义为阈值（见图S11）。通过使用ImageJ提取边缘、对图像进行二值化、去除不同纤维或组装体之间的重叠区域，然后对图像进行骨架化以拟合椭圆来确定肌球蛋白纤维和组装体的方向角度。通过上述程序确定的角度与液滴的长轴方向进行了比较（图表分为每组20°的九组，以液滴的长轴方向为中心）。

4.6 统计分析

所有报告的结果基于至少三次独立的实验运行。统计分析使用SciPy进行，包括Welch's t检验。图中显示的概率（P）值表示统计显著性，每个数据的平均值和标准差（Av. ± S.D.）以及样本量（n）在图例中有所说明。图表使用matplotlib/Excel生成，最终布局使用PowerPoint/GIMP进行调整。

作者贡献

T.W.和K.T.构思了这个项目。T.W.进行了实验并分析和整理了结果。M.K.准备了与蛋白质相关的材料并确认了它们的活性，T.M.进行了电子显微镜观察。K.T.在合作者的反馈下撰写了手稿。

支持信息

额外的支持信息可以在支持信息部分在线找到。

致谢

本研究部分得到了MEXT KAKENHI资助（项目编号JP2520H05972和JSPS KAKENHI资助（项目编号JP19K06540），以及THERS下一代研究人员新标准计划（JST SPRING）资助（项目编号JPMJSP2125，日本名古屋大学）。我们感谢京都生命医学科学学院客座教授Kenichi Yoshikawa博士（日本同志社大学；京都大学名誉教授；京都府立大学医学客座教授）提出的宝贵建议和讨论，以及我们实验室的研究生Yuki Mizutani在准备和使用LMM方面的支持。

资助

本研究得到了MEXT KAKENHI（日本JP2520H05972）、JSPS KAKENHI（日本JP19K06540）和THERS下一代研究人员新标准计划（JST SPRING）（日本名古屋大学JPMJSP2125）的资助。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。数据可用性声明

本研究所得结果所依据的数据，可应合理请求向相应作者索取获得。