单克隆抗体能够进入活细胞的细胞质，并与Polo样激酶1的跨结构域连接区结合，从而影响细胞的有丝分裂行为

《ChemBioChem》：Monoclonal Antibodies Accessing the Cytosol of Living Cells and Binding to Polo-Like Kinase 1 Interdomain Linker Affect Mitotic Behavior

　　**摘要**

Polo样激酶1（PLK1）是细胞有丝分裂的主要调控因子，同时也是癌症进展的已知驱动因素。针对PLK1的策略主要集中在使用小干扰RNA（siRNA）或小分子抑制剂进行RNA干扰。在这里，我们介绍了一种直接在细胞内靶向PLK1的方法，该方法通过单克隆抗体连接PLK1的polo-box结构域和激酶结构域。三种识别该结构域的单克隆抗体通过电穿孔技术被引入HeLa细胞的细胞质中。实验表明这些抗体能够在活细胞中结合PLK1，并调节与有丝分裂进程相关的机制。我们的结果证实了这些抗体作为工具，可以通过实时标记和干扰有丝分裂机制来探究PLK1的功能。

**1 引言**

哺乳动物细胞的分裂依赖于对有丝分裂调控因子的精确时空控制，其中Polo样激酶1（PLK1）起着核心调控作用[1]。在有丝分裂过程中，PLK1会发生磷酸化，并定位于中心体、着丝粒、纺锤体中区和中间体[5]。PLK1的表达受到严格调控：其转录本在S/G2期过渡时达到峰值[1]，随后在G2/M期被激活[3, 6]。在大多数成年组织中，PLK1的蛋白水平保持较低[7]。然而，在癌症中，PLK1的过度表达[1]以及Thr210位的磷酸化[11]与疾病的侵袭性和不良预后相关。PLK1兼具生物标志物和驱动因素的双重作用，使其成为具有吸引力的治疗靶点[1]。阻断PLK1活性的研究已经产生了如BI 2536和BI 6727（Volasertib）等高效的ATP竞争性抑制剂，这些抑制剂具有亚纳米摩尔的效力和高选择性。这两种化合物在体外都能抑制肿瘤生长。由于良好的药代动力学特性，Volasertib已进入临床试验[2, 15]，尽管其在急性髓系白血病患者中的疗效有限[1]。另一种高选择性的下一代抑制剂Onvansertib也显示出了显著的抗肿瘤活性[1, 19, 20]，并已接受临床评估[14, 21]。然而，激酶抑制剂所引发的耐药性和毒性问题凸显了需要更深入地了解PLK1调控的细胞机制，并探索其他靶向该激酶的策略。靶向PLK1的polo-box结构域（PBD）就是其中一种方法。Poloxin[5, 22, 23]、磷酸肽[1, -]和三唑喹唑啉酮[3, 6, 27]等物质能够破坏PBD的功能，从而抑制癌细胞的增殖。早在1996年，就有研究显示胞质注射多克隆抗PLK1抗体能够抑制有丝分裂[7, 28]，这为抗体介导的干扰作用提供了概念验证。随着抗体工程[ - ]和细胞内递送技术的进步[ - ]，使用单克隆抗体在细胞内靶向PLK1的方法再次受到关注。

**2 结果与讨论**

人类PLK1是一种由603个氨基酸组成的蛋白质，包含一个高度保守的N端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（KD，残基1–305）和一个C端的polo-box结构域（PBD，残基410–603），两者通过一个结构域连接子（IDL，残基306–409）相连。KD（PBD ID：2OU7）[ - , 36]和PBD（PDB ID：5NFU）[11, 16, 18]的晶体结构已经解析到低于2.4 ?的分辨率。包括灵活的IDL在内的完整结构是通过AlphaFold数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/search/text/P53350）预测的，并利用DiscoTope-3工具进行了B细胞表位倾向性的分析（图2）[ - , 19]。预测的表位分布在KD和PBD上，但IDL片段（残基331–366）被认为是抗体的主要识别位点，这可能与其灵活性和表面可及性有关。

我们进一步评估了三种市售的抗PLK1单克隆抗体（克隆35–206、3F8和13E8）在活HeLa细胞中的PLK1靶向能力，这些抗体分别针对全长PLK1（603个氨基酸，68 kDa）、C端片段（IDL–PBD，35 kDa）和IDL片段（300–400，14 kDa）[图3A]。Western blot实验显示，所有三种抗体都能识别IDL（图3B）。克隆3F8和13E8对PLK1具有特异性，而克隆35–206还能检测到另一种约110 kDa的蛋白质。进一步的Western blot（图S1–S4）和免疫荧光分析（图S5和S6）在通过RNA干扰沉默PLK1的细胞中证实了3F8和13E8对PLK1的高度特异性，而35–206在PLK1沉默的细胞中仍能检测到另一种蛋白质。

**3 结果与讨论（续）**

人类PLK1的细胞内分布表明，这些抗体具有双重作用：它们可以在活细胞中动态地检测PLK1的定位，当细胞内的抗体与PLK1的比例接近等摩尔浓度时，还会干扰有丝分裂进程[35]。

**4 结论**

通过电穿孔技术将针对PLK1结构域的单克隆抗体引入活细胞中，可以直接调节有丝分裂进程。这种细胞内抗体方法为探究PLK1的功能提供了新的工具，并突显了抗体在细胞内调控关键有丝分裂调控因子的潜力。接下来，我们从视频中量化了有丝分裂的持续时间（图S17）。未经处理的细胞、用电穿孔法引入Luciferase siRNA的细胞以及含有anti-NuPore mAb的细胞在有丝分裂过程中大约需要50分钟，而含有anti-PLK1 3F8的细胞则表现出延长的有丝分裂时间。ANOVA统计分析表明这些差异非常显著（将anti-PLK1组与anti-NuPore组比较的q值为10^-16）。延长的有丝分裂之后可能发生以下情况：1. 细胞成功分裂并继续正常的细胞周期；2. 发生凋亡，如siRNA介导的PLK1沉默细胞中所观察到的；3. 细胞分裂后立即出现子细胞核的碎片化（图S18和S19）。裂解物（50 μg）经过12% SDS-PAGE处理后转移到硝酸纤维素膜上。使用单克隆抗PLK1（3F8，BioLegend）和HRP标记的抗GFP抗体（Miltenyibiotec Ref. 130-091-833）检测PLK1和EGFPLuc，必要时还使用HRP标记的二级抗体（山羊抗小鼠IgG-HRP，Ref. UP446330，批次K10L222；山羊抗兔IgG-HRP，Ref. UP511380，批次L11L206）通过化学发光（ECL，Millipore）或IRDye800标记的抗小鼠二级抗体（Licor Bio，Ref. 926-32210）进行检测。膜片使用LI-COR Odyssey红外成像系统进行扫描。

4.6 细胞质递送
抗体递送采用Neon转染系统进行，使用10 μL注射器[48]。通常，将2×10^5个细胞与10 μL PBS混合，再加入4 μL抗体溶液（浓度为5.3或10.6 μM）。将含有1.5或3 μM抗体的10 μL液体装入Neon注射器中，通过三次10 ms、517 V cm^-1的脉冲进行电穿孔。细胞立即稀释到含有0.5 mL预温培养基的24孔板中，并覆盖盖玻片，然后让细胞贴壁。对于基因沉默实验，注射器中的siRNA浓度为2 μM。

4.7 细胞同步
细胞通过双次胸苷阻断法[11, 49]进行同步。从100 μM储备液中加入2 μM胸苷到培养基中，细胞在37°C下孵育16小时。用PBS洗涤三次后，细胞转移到正常生长培养基中继续培养8小时，然后进行第二次胸苷阻断（2 μM，16小时）。

4.8 单克隆抗体的荧光标记
将Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯（0.65 μL，浓度为1 μM，溶于无水DMF中，0.65 nmol）与20 μL单克隆抗体（浓度为1 μg μL^-1，溶于PBS中，0.13 nmol）混合。反应在4°C下进行16小时，之后通过凝胶过滤（Bio-Rad P100树脂， bed体积2 mL）纯化，并使用0.5 mL Microcon 100 kDa离心过滤器（Merck，Ref. UFC5100BK）浓缩。蛋白质浓度通过PAGE和Bradford测定法进行估算。Alexa Fluor 488的浓度通过488 nm处的消光系数（ε488 = 73,000 M^-1 cm^-1）进行光谱测量。

4.9 活细胞成像
电穿孔后，细胞被接种到含有10%血清的Gibco FluoroBrite培养基中，置于35 mm或8孔玻璃底培养皿中，让细胞贴壁约4小时。随后将培养基更换为新鲜的FluoroBrite培养基（含10%血清和抗生素），用于活细胞成像。使用Olympus IX83倒置显微镜和Pecon cellVivo孵育箱（维持在37°C和5% CO2条件下）进行时间延迟显微镜观察。图像通常每3分钟（U2OS-3F8*）、6分钟（HeLa-3F8*、U2OS-siPLK3F8*、HeLa-siPLK3F8*）、9分钟（H2BGFP-HeLa）或10分钟（H2BGFP-HeLa；视频M9、10和11）拍摄一次，持续24–48小时，使用Hamamatsu Orca-Fusion CMOS相机（C14440-20UP）在相位对比和荧光模式下进行拍摄。荧光激发使用XC-LED-385-XYLIS灯系统和GFP滤光片组（U-F39002）。图像采集使用40×物镜（LUCPLFLN40XPH2/0.60）或20×物镜（LUCPLFLN20XPH1/0.45）。每种实验条件下至少记录九个独立视野。图像分析使用Olympus cellSens软件（v3.2）和ImageJ/Fiji进行。

4.10 统计分析
图7的ANOVA分析使用Microsoft Excel中的XLMiner分析工具包完成。蛋白质组数据的统计分析由IGBMC服务提供。支持信息
额外的支持信息可以在支持信息部分在线找到。作者贡献
Clément Steyer和Mariel Donzeau分析了单克隆抗体对PLK1的结合特异性。Karie Shen、Manuela Chiper和Jean-Christophe Amé进行了时间延迟显微镜实验。Guy Zuber进行了额外的实验工作并撰写了手稿。Manuela Chiper参与了最终文本的修订。致谢
本研究得到了ITI InnoVec（ANR-10-IDEX-0002和ANR-SFRI-0012）的支持。作者感谢Bastien Morel在蛋白质组分析方面的帮助，感谢Muriel Philipps在细胞测量方面的支持，以及Luc Negroni和Sylvain Daujat在机制方面的讨论。开放获取出版物的资金由COUPERIN CY26提供。资助
法国国家研究署（ANR-10-IDEX-0002；ANR-SFRI-0012）。利益冲突
作者声明没有利益冲突。数据可用性声明
支持本研究结果的数据可以在本文的补充材料中找到。