Vimentin 尾部结构域片段与金属离子的结合

《ChemBioChem》：Metal Ion Binding of Vimentin Tail Domain Fragments

　　摘要

中间丝（IF）蛋白vimentin是细胞骨架的关键组成部分，然而我们对vimentin头部和尾部结构域功能的机制理解仍然不完整。vimentin的C端尾部结构域越来越受到关注，因为它通过与二价金属离子的相互作用来调节丝网络的结构和机械性质。然而，尾部结构域与金属相互作用的分子基础尚未被阐明。在这里，我们分析了vimentin尾部结构域的结构和金属结合特性。质谱、紫外-可见光（UV-Vis）和圆二色性（CD）光谱显示，二价铜（Cu(II)）可以与尾部结构域最后11个残基组成的肽以及完整的、分离的尾部结构域结合。溶液核磁共振（NMR）和CD测量表明，在没有Cu(II)的情况下，完整的vimentin尾部结构域主要是无序的，而Cu(II)的结合涉及尾部结构域的最后11个残基以及中间的另一个片段，使得尾部结构域的N端部分主要保持无序。我们的研究为分离的vimentin尾部结构域提供了一个Cu(II)结合模型，有助于解释Cu(II)在生物环境中对vimentin结构的影响。

1 引言

vimentin中间丝（IFs）对于维持细胞骨架的结构和动态至关重要。vimentin在细胞黏附、迁移和信号传导中发挥着重要作用，并被认为是上皮细胞向间充质细胞转变的活性因子和标志物，这是癌症转移中的一个关键过程[1, 2]。vimentin IFs的表达、结构和组织的改变与多种疾病有关，包括肌病和上皮癌[3]。然而，导致疾病中成熟vimentin丝结构失调和破坏的潜在分子机制以及这些机制与正常生理功能的差异仍然不清楚。vimentin单体具有三部分结构域，包括一个高度有序的中央杆状结构域，以及构象异质的N端头部和C端尾部结构域（图1A）。vimentin的宏观、层次化的组装过程已经被很好地描述，涉及二聚体的形成，这些二聚体经过几个自组装步骤最终组装成延长的成熟丝[5, 6]。先前的结构研究阐明了头部结构域在丝形成中的作用[7-10]，确定了杆状结构域的完整结构[11-16]，并揭示了vimentin寡聚体的分子结构[6, 17, 18]。最近，冷冻电子断层扫描和单粒子方法被应用于研究vimentin IFs的细胞结构，提供了一个7.2 ?的成熟细胞骨架vimentin模型，展示了头部和尾部结构域在IFs整体结构中的重要性[19]。然而，关于完整vimentin IF组装的高分辨率原子级结构表征仍然缺乏[20]，特别是关于vimentin执行其细胞骨架功能时头部和尾部结构域的构象转变。

2 结果与讨论

2.1 尾部结构域片段的制备

为了研究vimentin尾部结构域与金属离子之间的特定相互作用，我们制备了vimentin C端尾部结构域肽（VimTPep）和蛋白质（VimT）片段。图1A显示了全长vimentin蛋白的三个结构域，并突出了本研究中检查的C端区域。尾部结构域（VimT）包含E405–E466残基（62个氨基酸），11个氨基酸长的肽（VimTPep）对应于N456–E466残基。VimTPep是通过基于Fmoc的固相肽合成（SPPS）制备的，包括一个N端乙酰化步骤，并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。VimT蛋白质片段在大肠杆菌中重组表达，通过快速性能液相色谱（FPLC）纯化，并使用阴离子交换（AEX）色谱分离。支持图S1显示了VimT构建的设计和纯化凝胶。VimTPep由vimentin尾部结构域的最后11个残基（NETSQHHDDLE）组成，这些残基被认为对二价阳离子相互作用至关重要[26]，被用作初步筛选直接金属结合的模型。为了评估这11个残基以及其他尾部结构域区域在直接金属离子相互作用中的潜在作用，进行了平行和系统的肽和蛋白质结构及金属结合表征研究。

2.2 直接金属与vimentin尾部结构域肽（VimTPep）的结合

先前的研究表明，尾部截短的vimentin蛋白，特别是删除了最后11个残基（N456–E466）的蛋白，在Ca(II)和Mg(II)介导的丝网络交联方面存在缺陷[26]。因此，我们试图确定金属离子是否可以直接与VimTPep结合。为了评估直接金属离子相互作用，将VimTPep与不同的金属盐一起孵育，并通过电喷雾离子化质谱（ESI-MS）分析所得到的加合物。最初的ESI-MS实验是在单四极杆式LC/MS仪器上进行的。对未乙酰化的VimTPep与各种金属的分析显示，在等摩尔量的Cu(II)存在下出现了肽/金属加合物（图S2）。随后使用高分辨率ESI-MS（Thermofisher LTQ XL Orbitrap）对N-乙酰化的VimTPep形式进行了进一步分析，以探测低丰度或电离潜力低的物种。apo VimTPep的质量谱显示两个主要峰，分别对应于单电荷和双电荷分子离子，m/z值为1366.55 ([M + H]+) 和 683.78 ([M + 2H]2+)（图2A）。apo VimTPep谱还显示了与钾结合的VimTPep加合物，对应于 [M + K]+ (m/z = 1404.51), [M + K]2+ (m/z = 702.75), 和 [M + 2H + 2K]2+ (m/z = 721.73)（图2A）。以1:1的肽与金属比例添加Cu(II)时，出现了一个新的双电荷质量峰，m/z值为714.23 ([M + Cu]2+)，表明形成了Cu(II)/VimTPep加合物（图2B）。同样，添加1摩尔当量的Zn(II)时，出现了Zn(II)/VimTPep加合物，m/z值为714.73 ([M + Zn]2+)（图2C）。通过观察Cu和Zn的同位素分布模式进一步确认了肽/金属加合物的形成（图S3）。添加1当量的Ca(II)或Mg(II)时没有观察到肽/金属加合物的形成（图S4）。因此，ESI-MS的分析表明，Cu(II)和Zn(II)都可以以1:1的肽与金属比例直接与VimTPep结合，在离子化和ESI-MS分析所需的气相中保持这种复合物。表1显示了图2中预期和观察到的质量。

2.3 使用发色螯合剂表征Cu(II)与VimTPep的结合

观察到Cu(II)和Zn(II)与VimTPep结合的潜力后，我们进一步通过电子吸收光谱表征了VimTPep中的Cu(II)和Zn(II)相互作用，以估算水溶液中的结合亲和力。由于Cu(II)的d-d带具有较低的摩尔消光系数，而Zn(II)在光谱上没有明显的特征，因此通过将金属结合的发色螯合剂与VimTPep进行反应来评估肽/金属相互作用；这样，可以利用已知的金属与发色螯合剂之间的亲和力来近似和比较VimTPep与金属的结合亲和力。此外，这些竞争性的金属结合测定允许使用低浓度的肽和蛋白质。使用了两种性质良好的螯合剂，1,10-菲罗啉（phen）和zincon（ZI），分别用于近似Cu(II)和Zn(II)的结合亲和力[40, 41]。准备了10–200 μM VimTPep在20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的溶液，并将其滴定到含有40 μM phen和10 μM Cu(II)或20 μM ZI和10 μM Zn(II)的缓冲溶液中，然后记录吸光度光谱。Cu(II)-phen复合物在265 nm处显示出特征性的电荷转移带[41]，可以用来评估尾部结构域片段与phen之间的竞争结合。将VimTPep滴定到Cu(II)-phen溶液中导致电荷转移带的吸光度降低，表明Cu(II)与尾部结构域肽的竞争性结合（图3A）。根据滴定实验的数据和之前的方法[41-43]，估计Cu(II)与VimTPep的结合亲和力在logK 7.5到8.7之间，最大Kd,app值为32 nM（图3A和表S1）。图3：在图查看器或PowerPoint中打开

使用发色配体1,10-phenanthroline评估Cu(II)与vimentin尾域片段的结合亲和力。(A) 10–200 μM肽在20 μM Cu(II)和40 μM phen的20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的电子吸收光谱。VimTPep与Cu(II)的竞争性结合亲和力估计为logK在7.5到8.7之间（或Kd,app = 2–32 nM）。(B) 6–100 μM VimT蛋白在20 μM Cu(II)和40 μM phen的20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的电子吸收光谱。使用相同的方法测定VimT与Cu(II)的结合亲和力，估计logK在7.5到8.6之间（或Kd,app = 2–27 nM）。由于在MS研究中也观察到了Zn(II)/VimTPep复合物，因此使用发色配体ZI来表征Zn(II)在缓冲溶液中的结合。这些尝试没有成功，导致数据不明确，没有系统性地显示Cu(II)-ZI信号在添加VimTPep时的减少，这表明VimTPep对Cu(II)的竞争性结合效果不佳（图S5）。从这些观察结果来看，Zn(II)与VimTPep的结合可能较弱，或者其结合方式不是竞争性的，无法通过ZI–Zn(II)复合物来评估（Kd ? 2 μM）[41]。基于使用ZI和phen作为金属与VimTPep结合的竞争性报告剂所获得的结果，后续实验集中在检查Cu(II)与尾域的结合以及研究这些金属-蛋白质相互作用的分子基础。

2.4 VimTPep和Vimentin尾片段（VimT）具有相似的Cu(II)结合亲和力

使用相同的竞争性结合方法来表征Cu(II)与较大的尾域片段VimT的结合，以确定N端尾域区域对VimTPep对Cu(II)的纳米摩尔亲和力的影响。在20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备10–200 μM VimT溶液，并将其滴定到含有40 μM phen和10 μM Cu(II)的缓冲溶液中。与VimTPep类似，VimT在Cu(II)-phen溶液中的滴定导致电荷转移带的吸收减少，证明了Cu(II)与尾域蛋白片段的竞争性结合（图3B）。使用这种方法估计Cu(II)与VimT的结合亲和力为logK在7.5到8.6之间，或Kd,app = 2–27 nM（图3B和表S2），这与VimTPep的结果非常相似。相似的Cu(II)结合亲和力表明VimTPep和VimT具有共同的Cu(II)结合基序。

2.5 Cu(II)的结合改变了VimTPep和VimT的构象

通过CD光谱研究了Cu(II)与VimTPep和VimT结合的结构后果。在没有Cu(II)的情况下，这两种片段基本上都是无结构的，这一点从VimTPep（图4A）和VimT（图4B）的远紫外CD光谱中大约198 nm处的特征最小值可以看出。向VimTPep中添加0–10当量的Cu(II)会导致肽的随机卷曲构象减少，表现为190至200 nm范围内负椭圆率的降低，以及在210至230 nm范围内负椭圆率的进一步降低（图S6），其中最显著的变化发生在0至1摩尔当量的Cu(II)之间。这一范围通过更小的滴定增量进一步探究（图4A）。198 nm处负椭圆率的降低（图4A，绿色箭头）可归因于随机卷曲构象的丧失。然而，224 nm处负椭圆率的增加（图4A，红色箭头）不能明确归因于Cu(II)诱导的特定二级结构。表S3显示了光谱分解为二级结构成分的结果，显示出反平行（-3.5%）和转角（-1.7%）二级结构的轻微减少，同时“其他”（+5.0%）类别增加，其中包括无序、环状、π-螺旋和β-桥构象[44]。

图4：在图查看器或PowerPoint中打开
VimTPep和VimT与Cu(II)的CD光谱。(A) CD光谱显示了在20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中逐渐添加0–1摩尔当量Cu(II)时，100 μM VimTPep的随机卷曲构象的变化。198 nm处负椭圆率的降低由绿色箭头表示，224 nm处负椭圆率的增加由红色箭头表示。添加0–1摩尔当量的Cu(II)对应于0–100 μM Cu(II)。(B) CD光谱显示了在20 μM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中添加0–10当量Cu(II)时，37 μM VimT的随机卷曲构象的适度减少。绿色箭头表示198 nm处负椭圆率的轻微降低。在224 nm附近没有观察到显著的椭圆率变化。对于VimT，需要至少14 μM的浓度才能正确评估Cu(II)的相互作用，最佳CD光谱是在VimT浓度约为37 μM（约0.3 mg/mL）时获得的（图4B和S7）。对VimT的CD分析表明，在pH 7.4下添加0–10当量Cu(II)时随机卷曲构象减少（图4B），以及在pH 6.5下添加0–0.5当量Cu(II)时也观察到减少（图S8，该pH用于NMR实验）。与VimTPep不同，Cu(II)的滴定导致VimT在198 nm处的椭圆率降低幅度较小，在210至230 nm之间没有观察到变化（图4B）。使用BeStSel程序[44, 45]对图4的数据进行CD分析，预测VimTPep和VimT都为无序状态。BeStSel估计的二级结构含量对于这两种构建物都没有显著的Cu(II)依赖性，在整个滴定过程中大致保持30%的反平行β-折叠、17%的β-转角和50%的其他构象（表S3）。

2.6 VimT的构象主要是无序且动态的

使用NMR光谱进一步研究了VimT与Cu(II)相互作用时发生的结构变化。由于之前没有通过溶液NMR对vimentin的孤立尾域进行过表征，我们首先分析了在没有金属的情况下的尾域蛋白片段。图5A显示了均匀标记有13C、15N的VimT的1H–15N异核单量子相干（HSQC）光谱，其1H分散宽度窄，这与在0 Cu(II)当量时CD光谱的解析结果一致，表明蛋白质基本上是无序的。为了确定残基特异性的结构信息，在均匀标记有13C、15N的VimT样本上记录了一组标准的3D实验，以进行序列特异性共振分配。在62个非脯氨酸残基中观察到了信号，其中51个（或82%）可以在我们实验中使用的67个残基的VimT片段中明确分配，该片段包含4个脯氨酸残基。未分配信号的区域是P416–S420、P432、H437–R440、R450、H461–H462。补充表S5–S7包含了分配和未分配的信号。分配在图5A的1H–15N HSQC光谱中标出。在未分配的信号中，除了一个之外，所有信号的强度都比分配信号的强度低一个数量级（表S6和S7）。所有实验和数据采集参数都在表S4中提供。分配的NMR化学位移已存入BMRB（访问号52964）。

图5：在有无Cu(II)的情况下对vimentin尾域蛋白片段的NMR表征。(A) 在20 μM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，13C、15N标记的VimT蛋白的1H–15N异核单量子相干（HSQC）光谱，记录在600 MHz 1H频率下。总共51个明确分配的信号用黑色标出，低信噪比的未分配峰用灰色X标记表示。(B) 基于分配的VimT NMR化学位移，TALOS-N‘随机卷曲指数’（RCI-S2）对主链刚性的分类。RCI-S2值为0.6（水平红色虚线）表示无结构且高度移动的区域[46]。从R1和R1ρ测量中获得的残基特异性R1（C）和R2（D）松弛率，记录在600 MHz 1H频率下。(E) 在800 MHz 1H频率和pH 6.5下，apo VimT（黑色）和含有0.5当量Cu(II)（红色）的VimT的1H–15N HSQC光谱。箭头指向被顺磁Cu(II)最大程度抑制的信号。M*对应于TEV蛋白酶切割后剩余的组氨酸纯化标签中的甲硫氨酸残基。(F) 每个Cu(II)当量（eq）的残基特异性积分峰强度（I/I0），相对于0 eq Cu(II)的光谱进行了归一化。右侧面板上方的图表显示了VimT的氨基酸序列和AlphaFold 3.0结构预测（Cu(II)存在时（顶部）和不存在时（底部）。黑色线条代表高置信度区域（pIDDT值> 70），缺乏二级结构，蓝色箭头代表高置信度的β-链区域。红色字母和星号在主序列中表示在AlphaFold 3.0模型中与Cu(II)配位的残基。通过使用蛋白质主链结构预测程序TALOS-N[47, 48]和NMR松弛实验获得了尾域的进一步结构信息。TALOS-N对分配的VimT化学位移的分析主要预测为随机卷曲，大多数残基的随机卷曲指数（RCI-S2）[46, 49]值小于或等于0.6（图5B），反映了尾域的主要无序性质。残基400–403、416–420、436–440、461–462、466由于NMR化学位移未分配或TALOS-N预测缺失而无法获得RCI-S2值。NMR 15N松弛测量用于更精确地探究VimT内的残基特异性运动（图5C–D）。记录了报告纵向松弛率（R1）和旋转框架纵向松弛率（R1ρ）的光谱。横向松弛率（R2）是根据测量的R1和R1ρ值计算的，遵循之前报道的方法[50, 51]。VimT的残基特异性R1和R2率在整个序列中始终较小（图5C–D）。没有任何显著偏离预期无序结构值的偏差，也没有证据表明存在构象交换，这表明在没有Cu(II)的情况下VimT主要是无序的。

2.7 Cu(II)与VimT的最后11个氨基酸片段和中心结合，且结构变化最小

为了确定介导Cu(II)与VimT结合的残基，将一系列Cu(II)摩尔当量（0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5）滴定到13C、15N标记的VimT溶液中，并记录了一系列1H–15N HSQC光谱（图S9）。顺磁Cu(II)会抑制靠近Cu(II)的残基的NMR信号。图5E显示，添加0.5当量的Cu(II)显著降低了VimT中一部分残基的信号强度。图5F中显示的积分峰强度表明，L431之后的残基受到Cu(II)的影响比N端的VimT部分更大。与预期的二价金属结合作用一致，该区域的残基N456–E466的信号显示出Cu(II)依赖性的信号损失（图5E–F）。然而，L433–V434的残基在这些光谱中也表现出强烈的信号损失，支持VimT的多个区域参与金属结合。弱甲硫氨酸（M*）信号是纯化His标签中未去除的残基，在添加Cu(II)后消失，但没有观察到附近残基的信号减弱，这表明该位置不是Cu(II)结合的主要贡献者（图5E,F）。注意，残基P414、P416–S420、H437–R440、R450和H461–H462在1H–15N HSQC NMR光谱中未观察到，因此无法分析这些区域中Cu(II)依赖性的效应。无论Cu(II)的抑制程度如何，所有信号的峰位置都没有变化。相对不受Cu(II)抑制影响的残基，主要是L431之前的残基，在Cu(II)结合状态下仍然保持无序。对于表现出严重信号减少的位点，剩余的强度可能来自未与Cu(II)结合且仍处于无序构象的VimT分子。

2.8 讨论

在这项研究中，我们分析了vimentin尾域的结构和金属结合特性。质谱分析（图2和S2–S4）显示二价阳离子Cu(II)和Zn(II)（但不是Mg(II)和Ca(II)）与VimTPep（残基N456–E466）的结合足够紧密，可以在气相中检测到。对VimTPep和VimT（残基E405–E466）进行的竞争性结合测定（图3和S5，以及表S1–S2）显示Cu(II)的纳米摩尔亲和力，确认C末端的最后11个残基（NETSQHHDDLE）与Cu(II)结合，并未检测到Zn(II)的结合。CD测量（图4和S6–S8，以及表S3）显示由于Cu(II)的存在而引起的光谱变化很小，所有光谱都显示主要为无序构象，带有一些反平行β-链特征。核磁共振（NMR）测量结果（图5和S9）显示，在没有Cu(II)的情况下，VimT主要处于无序状态；揭示了尾部结构域中心一个先前未被识别的位点，该位点与Cu(II)发生相互作用；并表明在Cu(II)存在的情况下，N端部分（残基E405–S430）仍然保持无序状态。与对杆状结构域的广泛研究相比，对vimentin尾部结构域的结构表征较为有限。在没有Cu(II)的情况下，我们的圆二色性（CD）测量、NMR化学位移和NMR弛豫测量结果表明，如果没有相互作用伙伴（例如金属、vimentin杆状结构域或其他尾部结构域），vimentin尾部结构域主要处于无序状态。相反，最近对体外制备的vimentin中间纤维（IFs）进行的冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析显示，尾部结构域表面有电子密度[19]，这表明尾部结构域至少存在一定的结构。然而，这些区域的电子密度图的分辨率不足以提供具体的尾部结构域构象，也无法确定整个结构域是否具有结构[19]。与此一致的是，对体外组装的vimentin IFs进行的电子顺磁共振（EPR）研究表明，尾部结构域的一部分（残基K445–G452）与其他vimentin单体的尾部结构域紧密相邻，可能采用了有序且刚性的构象[35]。在成熟的vimentin IFs中，提出了一个“瓶刷”结构，其中单个vimentin单体的尾部结构域从纤维核心伸出，从而实现各种功能，如纤维间的网络相互作用以及其他蛋白质的相互作用[52]。因此，我们研究中发现的尾部结构域内在无序性赋予了其与成熟纤维以及其他蛋白质和金属相互作用的灵活性，这种灵活性取决于具体情境。实际上，对于其他蛋白质系统来说，内在无序性已被证明是一种促进与多种结构不同伙伴相互作用的方式[53]。先前的研究表明，像Mg(II)和Ca(II)这样的金属离子可以与vimentin尾部结构域相互作用，并调节vimentin纤维网络的结构[26]。在我们对分离的尾部结构域进行的实验中，我们只观察到了强烈的Cu(II)结合，有微弱的Zn(II)结合证据，但没有Mg(II)和Ca(II)结合的证据。我们的质谱结果（图2B–C和S2–S4）表明，Cu(II)和Zn(II)可以与尾部结构域以1:1的比例结合，但这并不排除其他二价金属离子以更高比例结合的可能性，或者这种结合依赖于vimentin的头部和杆状结构域；也有可能存在在质谱条件下不稳定的四级结构；或者存在其他类型的相互作用。详细的表征证实，VimTPep和VimT都能以纳摩尔级的亲和力直接结合Cu(II)（图3–5），这表明它们具有共同的Cu(II)结合位点。Cu(II)结合后，VimTPep和VimT的CD光谱发生了变化，尽管通过二级结构对光谱进行去卷积后，发现VimTPep和VimT都保留了一小部分β-链特征，大约一半的区域处于不确定的构象中，而这些区域的相对数量基本上不受Cu(II)结合的影响。vimentin已被确定为一种潜在的Cu结合蛋白[34]，尽管这种相互作用的分子基础及其结合位点尚未得到明确。在我们的竞争性结合实验中获得的等效结合亲和力表明，vimentin尾部结构域的最后11个残基负责Cu(II)的结合，这证实了成像实验和vimentin截短突变体的结果[26]。对VimT的溶液NMR研究（图5和S9）使我们能够更详细地了解Cu(II)与尾部结构域的相互作用。一系列在逐渐增加的Cu(II)浓度下进行的1H–15N HSQC测量显示，信号的抑制程度不同，其中L431残基C端的信号平均在0.5 Cu(II)当量时损失超过60%。L431残基N端的信号损失较少，不到50%。根据一级序列以及已知组氨酸残基倾向于结合阳离子的特性，我们预期会在受Cu(II)影响最大的区域（即H437、H461和H462）观察到Cu(II)与组氨酸残基的相互作用。然而，在我们的实验中并未观察到组氨酸残基的信号，这可能是由于实验pH值6.5接近组氨酸侧链的pKa值，导致信号变宽。在VimT的C端半部分，受影响最大的残基（>90%信号损失）是V434、D435、E457、T458、D463、D464、L465和E466，这些残基与H437、H461和H462相邻，这意味着如果这些残基的信号能够被观察到，它们也会被抑制。因此，我们的结果与一个Cu(II)与VimT中的两个位点最强烈相互作用的观点一致，一个位于尾部结构域的中间，另一个位于最C端，这两个位点都含有Cu(II)的结合残基（组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸）。Cu(II)滴定中没有出现新的信号或可见峰位置的移动，表明Cu(II)结合不会在未参与结合相互作用的尾部结构域片段中引起显著的结构变化，这与在Cu(II)存在下VimT的CD光谱中观察到的微小变化一致。然而，Cu(II)的顺磁性特性阻碍了直接观察结合Cu(II)的残基。我们的发现部分得到了AlphaFold 2.0[54]（AF2）和3.0[55]（AF3）对vimentin尾部结构域结构和金属结合特性的预测的支持。AF2高度预测L443–Q460残基之间的β-链和转角区域，而AF3高度预测L442–H461残基之间的β-发夹结构（见图6A和图5B中的示意图）。虽然在没有Cu(II)的情况下，β-发夹尾部结构域的预测（占序列的30%）与我们的CD测量结果（30%的反平行β-链含量）一致，但在NMR测量中并未观察到刚性的β-链结构。可能是因为在我们的样品中缺乏头部和杆状结构域以及四级结构，导致预测的β-发夹没有完全形成，VimT保持了足够的流动性，从而产生随机的线圈NMR化学位移。AF3模型中结合Cu(II)的VimT也与我们的NMR测量结果一致，显示了那些表现出最强Cu(II)依赖性NMR信号抑制的残基（H437、H461和D463）结合Cu(II）（见图6B）。AF3模型还显示了VimTPep与Cu(II)相互作用时，两个组氨酸和一个天冬氨酸的金属离子相互作用。在这种情况下，肽中的H461和H462都参与其中。有趣的是，VimTPep中结合Cu(II)的组氨酸-天冬氨酸对相对于VimT向前移动了一个残基，使用的是H462和D464而不是H461和D463。肽模型中的H461靠近Cu(II)，尽管在五个AF3模型中其位置不太明确。图6D显示，VimT中的H461/D463和VimTPep中的H462/D464的对齐精度很高，RMSD为1.0 ?。对齐结果显示，VimT和VimTPep都使用相同数量和类型的残基与Cu(II)相互作用，尾部结构域最C端的HHDD氨基酸序列促进了两种略有不同的结合模式。这些模型的一种解释是，当H461在VimTPep中与Cu(II)结合时，存在一定的空间应变。较长的VimT序列中额外的组氨酸残基通过将组氨酸-天冬氨酸对向前移动一个残基来缓解这种应变，并利用了距离较远的H437残基，后者在与Cu(II)相互作用时可能具有较小的结构应变。此外，这些模型有助于解释我们在VimTPep和VimT中观察到的相似结合亲和力，以及VimTPep中不存在的第二个Cu(II)结合位点。预测动态结合位点的复杂协调几何结构仍然是一个挑战[56]，这些模型需要谨慎解释，并需要通过高分辨率的实验进行验证。

图6：AlphaFold预测显示了VimT和VimTPep的β-链结构和Cu(II)结合。(A) VimT的预测结构模型叠加图。蓝色/红色棒状图表示结合Cu(II)的孤立VimT，灰色棒状图表示全长vimentin中的VimT，黑色棒状图表示未结合Cu(II)的孤立VimT。T441–D463残基的CA原子位置的RMSD约为0.5 ?。(B) 显示结合Cu(II)的VimT的预测模型。对于两个面板，都显示了L431–E466残基的骨架原子。在(B)中，还显示了适当位置上能够与Cu(II)结合的侧链残基。(C) 五个预测的VimTPep与Cu(II)结合模型与H462和D464残基对齐的叠加图。Q460–E466的骨架残基以橙色显示，H462和D464的侧链以绿色显示。所有显示的残基都有高置信度的预测。(D) VimT和VimTPep与Cu(II)结合后的预测模式，这些Cu(II)结合的His和Asp残基对齐。这两个模型中这些His和Asp残基的重原子RMSD为1.0 ?。VimT的标签为洋红色和黑色，VimTPep的标签为绿色。为了更清楚地显示VimT和VimTPep之间相似的His和Asp残基，VimTPep中的H461被省略了。金色球体代表Cu(II)。N端尾部结构域的残基E405–S430在所有三个VimT模型中的预测置信度较低，位置变化较大，因此从图中省略了。vimentin和其他中间纤维（IF）蛋白会经历多种翻译后修饰（PTMs），这些修饰可以微调它们的结构和功能[57, 58]。磷酸化是最重要且研究最充分的IF PTM。vimentin在头部和尾部结构域中包含多个磷酸化位点，这些位点的变化会导致成熟纤维结构的重组，调节细胞运动和分裂等关键功能[59-62]。vimentin的磷酸化位点的突变或变化与疾病的发生有关[63-66]。在我们的研究中，已经确定尾部结构域的T457和S458残基是磷酸化位点[67, 68]，并且发现它们与结合的Cu(II)非常接近。已知IF尾部的电静力学性质会因磷酸化而改变[4]，但vimentin尾部、金属离子和PTMs之间的关系尚未明确。磷酸化位点与金属结合区域的共定位进一步强调了尾部结构域在调节vimentin IF功能和功能障碍中的重要作用。

3 结论
vimentin IFs的架构非常多样且复杂，这一点通过vimentin纤维在各种细胞条件和刺激下的不断重塑得到了证明[69]。早期的成像工作表明，二价阳离子与尾部结构域最后11个C端残基的相互作用对于vimentin纤维的有效交联非常重要[26]。我们的研究证实了这一区域存在Cu(II)的相互作用，识别出了第二个相互作用位点，并提出了关于其他二价阳离子如何与vimentin相互作用的重要新问题。结合AlphaFold的预测，我们的实验研究为vimentin尾部结构域提供了一个Cu(II)结合模型，该模型独立于其他vimentin结构域或四级结构的存在。我们的结合模型，加上Ca、Mg和Zn结合尾部结构域可能需要其他vimentin结构域或四级结构的事实，为解析二价阳离子的精细结合及其导致的vimentin组装的构象变化提供了坚实的基础。

4 实验部分
4.1 材料
所有溶剂和化学品均从Thermo Fisher Scientific、Sigma–Aldrich或Spectrum Chemicals购买，除非另有说明。Fmoc-氨基酸、树脂和偶联试剂从CEM、ChemImpex、AAPPTec、Advanced ChemTech或Sigma–Aldrich购买。VimT质粒（残基E405–E466）由德克萨斯大学西南医学中心的Steven L. McKnight博士实验室慷慨提供。用于蛋白质表达的化学感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞是内部制备的。用于生产均匀标记（13C, 15N）VimT蛋白的同位素标记材料来自Cambridge Isotope Laboratories。用于缓冲溶液和金属盐溶液的水是通过Direct-Q 3或PURELAB Flex水纯化系统制备的，该系统的电阻率为18.2 MΩ。

4.2 肽的合成和纯化
野生型人类C端尾部结构域vimentin肽（NETSQHHDDLE）（VimTPep）是手动合成或使用CEM Liberty Blue 2.0自动化微波肽合成器按照标准Fmoc SPPS策略合成的。通过手动SPPS生成的VimTPep肽没有N端修饰，而通过自动化SPPS生成的肽则被N-乙酰化。为了最好地代表肽在较大蛋白质环境中的天然状态，使用了乙酸酐将肽转化为乙酰化形式（Ac-NETSQHHDDLE）。肽的合成量在0.1–0.2毫摩尔范围内，使用预先装有Fmoc-Glu(OtBu)-OH的Wang树脂进行。合成过程从20分钟的树脂膨胀步骤开始。氨基酸的偶联是在CEM优化的微波合成条件下进行的：使用DIC和Oxyma Pure活化试剂，在90°C下进行1分钟的脱保护，然后在90°C下进行2分钟的偶联。在最后一个氨基酸偶联完成后，合成的最后一步是对N端残基进行脱保护。合成完成后，将所有树脂/肽混合物从肽合成器中取出，用DMF（5次）和DCM（5次）洗涤，然后在室温下干燥1–2小时。肽和保护基团使用含有95:2.5:2.5比例的TFA/水/TIPS的溶液进行切割。将溶液中的树脂在室温下以145转/分钟的速度振荡3–4小时。切割液缓慢转移到含有40毫升冷却的乙醚的锥形管中以沉淀肽物质，以3900转/分钟的速度离心10分钟，然后倒掉上清液。此步骤重复三次。最后一次倒掉上清液后，将得到的粗肽物质在真空干燥机中干燥过夜，并储存在-20°C直到进一步纯化。肽的纯化是通过使用Agilent Technologies 1260 Infinity II HPLC仪器和Infinity II UV–vis检测系统进行的反向相HPLC。粗VimTPep肽使用Atlantis T3 Prep OBD C18柱（100 ?，5 μm，19 x 250 mm）进行纯化，流速设置为17.6毫升/分钟，溶剂A（含0.1% FA的水）和溶剂B（含0.1% FA的乙腈）的梯度如下：5%溶剂B保持5分钟，从5–85分钟线性增加到45%溶剂B，从85–90分钟最终增加到100%溶剂B。VimTPep肽在20–25分钟或A/B比例为90–87.5%时洗脱出来。纯化的肽通过ESI或基质辅助激光解吸质谱法进行确认，冻干后储存在-20°C直到使用。

4.3 蛋白质生产和纯化

人类野生型vimentin尾域蛋白（VimT）包含E405–E466残基和一个N端可被TEV切割的His标签，通过重组表达在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。所有细菌生长都在设置为37°C和220转/分钟的摇床培养箱中进行。对于所有VimT蛋白（未标记和标记的），细菌细胞在含有100微克/毫升氨苄西林的2升Luria肉汤培养基中生长，直到600纳米处的光密度（OD600）在0.6到0.8之间。通过添加0.5毫摩尔的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）来诱导蛋白质生长。细菌细胞再生长3小时后，以6000转/分钟的速度离心10分钟收集。收集到的细胞沉淀物在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直到纯化。对于13C和15N同位素标记的VimT蛋白，从OD600在0.6到0.8之间的2升Luria肉汤培养基中收集细胞，以6000转/分钟的速度离心10分钟，然后转移到含有100微克/毫升氨苄西林、2.0克U-13C6 D-葡萄糖和1.0克15N氯化铵的1升M9最小培养基中。培养物在37°C和220转/分钟下摇动30分钟后，通过添加0.5毫摩尔的IPTG来诱导蛋白质生产。细菌细胞再生长3小时后，以6000转/分钟的速度离心10分钟收集。最终的细胞沉淀物在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直到纯化。所有VimT蛋白都使用Bio-Rad NGC Discover 10 FPLC系统通过Ni-IMAC亲和纯化，并遵循相同的步骤。细胞沉淀物（约1–2克湿细胞质量）在冰上解冻，并重新悬浮在含有6摩尔盐酸胍、1%体积比Triton X-100、50毫摩尔Tris（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）pH 7.5、500毫摩尔氯化钠、3片Mini EDTA-free Pierce蛋白酶抑制剂和0.25毫克/毫升鸡蛋白酶溶菌素的溶液中。重新悬浮的细胞溶液在装有1/4英寸微尖头的Branson SFX-250超声仪中以脉冲模式进行超声处理，设置如下：开启0.3秒，关闭3秒，总超声时间为1分钟，功率为30%（总时间为20分钟）。超声处理后，将裂解的细胞在4°C下以75600转/分钟的速度离心30分钟以分离不溶性物质。得到的上清液流经一个预先用6摩尔尿素、20毫摩尔4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH 7.5和500毫摩尔氯化钠平衡的5毫升Bio-Rad Bio-Scale Mini Nuvia IMAC柱；然后用6摩尔尿素、20毫摩尔HEPES（pH 7.5）和500毫摩尔氯化钠洗涤；接着使用20–200毫摩尔咪唑的梯度进行洗脱，以及6摩尔尿素、20毫摩尔HEPES（pH 7.5）和500毫摩尔氯化钠。洗脱峰被收集在1毫升的 aliquots 中，并储存在-80°C直到进一步分离/纯化。纯化的蛋白质材料通过SDS-PAGE和Coomassie染色进行分析，蛋白质浓度通过在280纳米处的吸光度测量确定，并使用计算出的摩尔消光系数5,960 M?1 cm?1（ProtParam [71]）。

4.4 蛋白质分离通过His-标签切割和阴离子交换色谱

为了防止金属结合实验的干扰，使用TEV蛋白酶以1:100的蛋白质与TEV的比例（图S1B）从纯化蛋白质中去除N端的6xHis标签。去除His标签的方法是将TEV加入到约4–5毫升的纯化VimT蛋白质溶液中，并将TEV-VimT混合物透析到含有20毫摩尔Tris-HCl（pH 7.5）、1毫摩尔DTT和1毫摩尔EDTA的250毫升缓冲液中。3小时后更换缓冲液，并在室温下继续透析过夜（约19小时）。TEV切割后立即，使用5毫升Bio-Rad EconoFit Macro-Prep DEAE柱通过AEX将VimT蛋白质与切割产物分离。AEX操作是通过将DEAE柱连接到环形支架上，并通过柱子运行氯化钠缓冲液来完成的。所有对柱子的操作都使用10毫升的注射器进行。低盐和高盐缓冲液的内容物如下：低盐缓冲液为20毫摩尔Tris-HCl（pH 7.5）、6摩尔尿素和1毫摩尔EDTA（pH 8），高盐缓冲液为1摩尔氯化钠、20毫摩尔Tris-HCl（pH 7.5）、6摩尔尿素和1毫摩尔EDTA（pH 8）。首先按照柱子说明书中的步骤准备柱子。简而言之，先通过柱子运行20毫升（4次循环）的超纯水以去除储存的乙醇溶液（20%体积比），然后是12毫升（2.4次循环）的低盐缓冲液和30毫升（6次循环）的高盐缓冲液，最后用30毫升（6次循环）的低盐缓冲液平衡。柱子准备完成后，缓慢将蛋白质溶液加载到柱子上，并使用5毫升低盐缓冲液帮助完全转移和加载所有蛋白质物质。样品加载后和收集前，让柱子静置10分钟。以50毫摩尔氯化钠的增量运行0–300毫摩尔的氯化钠梯度。每个步骤都通过混合高盐和低盐缓冲液并流经柱子来制备10毫升的溶液。每个10毫升的步骤分成两个5毫升的部分，并在4°C下储存1–3天。通过SDS-PAGE和Coomassie染色（图S1C）确认分离出的VimT蛋白质物质的存在，并将部分储存在-80°C直到使用。由于His标签切割后的蛋白质物质不含有在280纳米处有吸光的残基（0 M?1 cm?1摩尔吸光度），所有蛋白质浓度都是通过使用205纳米处的吸光度测量和217,310 M?1 cm?1的摩尔消光系数（根据Anthis和Clore [72]的详细说明）以及在线蛋白质参数计算器（http://nickanthis.com/tools/a205.html）来计算的。

4.5 质谱

最初的ESI-MS实验是在Agilent Technologies InfinityLab单四极杆LC/MSD仪器上进行的。高分辨率MS实验使用Thermofisher LTQ XL Orbitrap在正离子模式下进行，扫描分辨率为60,000。所有50或100微摩尔的VimTPep溶液都用5毫摩尔醋酸铵（pH 7.4）制备，并加入等摩尔量的CaCl2、CuSO4、MgCl2和ZnCl2金属溶液（在纳米纯水中制备），加入到每个肽样品中。Orbitrap仪器的源条件如下：喷雾电压为3.5千伏，毛细管温度为275°C，流速为0.2毫升/分钟。使用的检测设置如下：自动增益控制目标为3.0×10^6，最大注射时间为200毫秒，微扫描为1次，扫描范围为250–2000 m/z。Orbitrap MS光谱使用Thermo Scientific Xcalibur软件分析，平均50次扫描，并导出为文本文件。

4.6 紫外-可见光谱

所有测量都是在室温下使用Shimadzu UV-1900分光光度计进行的，使用1厘米路径长度的石英比色皿（Starna Cells）。竞争性结合研究改编自Stevenson等人[42]，使用1,10-菲罗啉（phen）配体。Cu(II)-phen复合物的制备是通过分别将CuCl2和phen溶解在Milli-Q水中制成1毫摩尔的储备溶液，然后结合Cu(II)和phen至最终浓度分别为10和40微摩尔。Cu(II)-phen混合物在室温下孵育10分钟，然后加入肽或蛋白质。VimTPep和VimT溶液使用20毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制备，并滴加到Cu(II)-phen中，最终肽/蛋白质浓度范围从0到200微摩尔。每次添加肽/蛋白质后，溶液在室温下平衡3–5分钟，并在200–900纳米范围内收集光谱。Cu(II)-phen的吸光度在265纳米处监测。吸光度测量以水为参考，然后减去以水为参考的缓冲液值，并对数据进行归一化以考虑稀释效应。Cu(II)/VimTPep和Cu(II)/VimT复合物的形成常数计算是按照之前概述的方法[41-43]进行的。VimTPep和VimT的相应值和计算结果分别显示在表S1和S2中。

4.7 CD光谱

CD测量是在JASCO J-715光谱仪上进行的，使用1毫米路径长度的石英比色皿（Science Outlet）。冻干的VimTPep（100微摩尔）样品在20毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备，VimT（约10–40微摩尔或约0.1–0.3毫克/毫升）样品通过将1–4毫升的分离蛋白质物质透析到20毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 7.4或pH 6.5）中制备。金属储备溶液是通过将金属盐溶解在Milli-Q水中制备的，浓度为0.5、1或10毫摩尔。金属溶液以0–1或0–1摩尔当量添加到VimTPep和VimT中，每种混合物在室温下孵育10分钟后再进行数据收集。光谱采集是通过连续扫描模式在190–250纳米范围内进行，扫描速度为20纳米/分钟，平均扫描次数为2次，带宽为1.0纳米。CD光谱在分析前进行了基线校正和缓冲液光谱的减除。使用BetStSel CD光谱分析程序（在线访问地址：https://bestsel.elte.hu）来估计二级结构的百分比，并应用“Disordered-Ordered Classification”选项来大致分类VimTPep和VimT的无序性质。

4.8 NMR光谱

NMR实验是在Bruker 600 MHz或800 MHz Avance III光谱仪上进行的，配备了三共振低温TCI探针，温度为303 K。所有NMR数据采集和处理参数都在表S4中概述。VimT蛋白质样品是通过将1毫升通过阴离子交换色谱分离出的蛋白质材料透析到20毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中2–3小时来制备的。透析后用新鲜缓冲液在室温下继续过夜。透析后，通过使用205纳米处的吸光度测量来确定蛋白质浓度，并使用计算出的消光系数217,310 M?1 cm?1 [72]。最终的蛋白质NMR样品（44微摩尔）通过加入纯D2O来制备，使得最终的H2O:D2O比例为90%:10%（体积比）。所有蛋白质NMR光谱使用NMRPipe [73, 74]处理，并在SPARKY [75]中进一步分析。收集并分析了VimT的二维1H–15N HSQC光谱以及三维HNCO、HNCACB和HNCACOCB光谱，以进行序列特异性赋值。VimT的序列特异性赋值是根据标准的NMR化学位移分配策略[76, 77]手动确定的，并通过POKY[79]软件平台使用I-PINE网络服务器[78]进行了验证（见表S5）。表S6和表S7分别列出了已明确赋值和未赋值的峰。VimT赋值的BMRB访问号为52964。松弛测量（R1和R1ρ值）是使用热补偿的1H–15N HSQC脉冲程序在600 MHz的1H频率下记录的[80, 81]。R1测量使用了具有40、120、200、320、520和820 ms松弛延迟的交错光谱。R1ρ测量使用了具有1、21、41、111和151 ms松弛延迟的交错光谱，以及1,400 Hz的B1场。根据已建立的方法[50, 51, 81, 82]，从R1和R1ρ值计算了15N R2速率。2D光谱中的峰强度是通过在1H–15N HSQC光谱中去除重叠信号，并使用NMRPipe软件包[73]在两个维度上对剩余信号进行±1点积分得到的。对于Cu(II)滴定实验，蛋白质样品（38 μM）按照上述相同步骤制备，同时在纳米纯水中制备了500 μM的CuCl2储备溶液。将0–0.5摩尔当量的Cu(II)直接加入到相同的蛋白质样品中，并在每次添加金属后于室温下孵育5–10分钟。记录了一系列2D 1H–15N HSQC光谱，每个Cu(II)当量对应一个光谱（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）。通过过滤光谱中的重叠信号，并使用NMRPipe在两个光谱维度上进行±2点积分来获得峰强度。

4.9 AlphaFold预测

2025年9月22日，从AlphaFold[54, 83]数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载了vimentin单体的预测结构。通过将VimT氨基酸序列（残基E405–E466）输入AlphaFold Server[55]应用程序（https://alphafoldserver.com/），获得了含有和不含有Cu(II)的vimentin尾域（VimT）的模型。通过将VimTPep氨基酸序列（N486–E466）输入AlphaFold Server应用程序，获得了含有Cu(II)的尾域肽（VimTPep）的模型。支持信息

额外的支持信息可以在支持信息部分在线找到。致谢

Steven L. McKnight博士慷慨提供了本研究中使用的vimentin尾域质粒。作者感谢John Voss博士和Madhu Budamagunta博士在UC Davis蛋白质结构与动力学核心设施提供的CD光谱极化仪培训和使用机会，以及他们宝贵的见解和项目支持。作者还感谢Upasana Sridharan博士和Blake Fonda博士在NMR实验和数据处理方面的帮助，感谢UC Davis的NMR和校园质谱设施，以及Heffern和Murray实验室的所有成员提供的有益讨论。这项工作得到了美国国家普通医学科学研究所通过UC Davis化学生物学项目培训拨款T32GM136597（E.J.C.）和MIRA奖项R35GM133684（M.C.H.）和R35GM142892（D.T.M.）的支持。美国国家科学基金会的CAREER奖项2048265（M.C.H.）也提供了支持。核心设施的支持来自美国国家科学基金会的DBI-0722538和DBI-0079461（UC Davis NMR设施）奖项以及美国国立卫生研究院的S10OD025271（UC Davis质谱设施）奖项。内容仅代表作者的观点，不一定代表美国国立卫生研究院或美国国家科学基金会的官方立场。资金支持

本研究得到了美国国家普通医学科学研究所（拨款R35GM133684、R35GM142892、T32GM136597）、美国国立卫生研究院（拨款S10OD025271）和美国国家科学基金会（拨款CAREER-2048265、DBI-0722538、DBI-0079461）的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。数据可用性声明

支持本研究结果的数据可以在生物磁共振数据银行（https://doi.org/10.13018/BMR52964，参考编号52964）公开获取。数据可以在补充信息中找到，并可根据作者的合理请求提供。