综述：免疫介导疾病中诊断抗体的检测：重点关注抗原与检测技术

《ChemBioChem》：Detection of Diagnostic Antibodies in Immune-Mediated Diseases: A Focus on Antigens and Technologies

　　摘要

自身免疫性疾病是一种以B细胞和T细胞对自身抗原的异常反应为特征的疾病。自身抗体是自身免疫性疾病的血清学生物标志物，因此，自身抗体检测是诊断和分类许多自身免疫性疾病、监测疾病活动以及制定治疗策略的关键步骤。鉴于全球受自身免疫性疾病影响的人数不断增加，拥有高灵敏度和特异性、减少样本处理时间以及自动化高通量工作流程的技术就显得尤为重要。在过去的几十年中，新自身抗原和自身抗体的识别与验证，加上技术进步的实现，已经提高了患者的诊断和分层能力。本文回顾了一些最常见的自身免疫性疾病的主要抗原，以及诊断实验室中用于检测其相应抗体的最常用检测方法，并在选定的研究案例中比较了更传统的平台与新兴技术。

图解摘要

本综述探讨了免疫介导性疾病中的自身抗体检测，重点介绍了包括翻译后修饰在内的自身抗原。我们将酶联免疫吸附测定（ELISA）和间接免疫荧光（IIF）与自动化化学发光平台进行了比较。这些创新提高了诊断的准确性和患者的分层能力，支持了个性化医疗的发展。

1 引言

据估计，受免疫介导性疾病（IMDs）影响的人口约为10%，流行病学数据表明，这些疾病的发病率和患病率在过去几十年中持续上升，预计这一趋势将在全球范围内持续。尽管在诊断和治疗IMDs方面取得了显著进展，但这些疾病对健康和经济造成的负担仍然很大。有效的、可靠的诊断和预后检测方法对于早期诊断和监测疾病活动至关重要，以减少发病率、残疾率、死亡率并提高生活质量。自身免疫性疾病是一组多样的疾病，其特征是存在逃避耐受性的自身反应性B细胞和/或T细胞，它们会针对身体本身发起攻击，导致器官特异性（如1型糖尿病、自身免疫性肝病、乳糜泻（CD））或系统性（如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA））的慢性炎症和组织损伤[10-14]。虽然B细胞和T细胞都参与了耐受性的丧失，但识别T细胞抗原更具挑战性，由于使用活细胞的技术难度较大，基于T细胞的检测并不常规进行。因此，疾病特异性自身抗体在自身免疫性疾病的诊断中起着关键作用，这些抗体可以通过多种经过验证的检测方法在血清样本中检测到，其优势在于可以通过微创抽血获得[13, 15, 16]。自身抗体还具有作为自身免疫性疾病生物标志物的优势：一些抗体可以预测疾病的发展（如原发性胆汁性胆管炎（PBC）的抗线粒体抗体（AMA）和类风湿性关节炎的抗瓜氨酸化肽抗体（ACPA），而另一些抗体则随疾病活动而波动，因此具有预后价值（如Goodpasture综合征中的抗肾小球基底膜抗体）[17-20]。然而，尽管自身抗体的检测是自身免疫性疾病的主要诊断工具，但在健康个体中也可能检测到自身抗体。因此，对于有合理患病可能性的患者进行自身抗体检测非常重要[21, 22]。蛋白质的翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、糖基化、瓜氨酸化和泛素化，对于增加蛋白质多样性以及调节蛋白质活性、结构、定位和相互作用至关重要，从而影响许多重要的生物过程[23]。然而，控制PTMs的自发或酶促过程的失调，通常由炎症状态驱动，可能导致异常或过度的修饰，产生新抗原，进而引发抗体或自身反应性T细胞的产生，最终导致自身免疫反应[13, 24-26]。虽然遗传背景增加了患自身免疫性疾病的倾向，但环境因素（如接触感染性微生物或化学物质）似乎对于引发或加剧自身免疫反应和临床疾病表现是必要的[11, 13, 27-30]。在这种情况下，重组或提取的蛋白质抗原可能只能部分再现抗体识别所需的正确修饰。另一方面，合成肽可以通过标准和可重复的合成协议以高质量和大量生产，从而可以直接将非标准的、经过修饰的氨基酸引入序列中，以模拟天然表位[31-34]。自身抗体的研究历史可以追溯到一个多世纪前，当时Ehrlich提出了“恐怖自毒性”概念，并开发了用于梅毒的Wassermann测试。然而，直到20世纪50年代，随着Coons、Kaplan和Weller首次描述了间接免疫荧光（IIF）技术，自身抗体的识别和检测才取得进展。这项技术至今仍被认为是筛查抗核抗体（ANAs）的“金标准”。在识别和编目自身抗体分子靶标方面的显著进展催生了新一代检测平台，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot（WB），随后出现了多重分析物免疫测定（如可寻址激光珠免疫测定（ALBIA）和化学发光免疫测定（CLIA），这些技术可以同时检测多种自身抗体，从而在单次测试中提供患者自身免疫状况的全面概述[35-39]。生物传感器技术作为一种更简单、更快、成本更低的替代方案，正在迅速崛起，它们不需要熟练的人员和设备齐全的实验室。此外，生物传感器凭借其高灵敏度、特异性以及潜在的高通量和即时检测能力，未来可能会彻底改变IMDs的诊断领域。然而，尽管这些新技术具有巨大潜力，但在广泛临床应用之前，还需要进一步完善和彻底评估[40-42]。本文讨论了自身免疫性疾病中的抗体识别方法，概述了方法学考虑因素以及抗原结构、定位和生物化学对多种自身免疫性疾病中抗体识别的根本影响。本文回顾了临床实践中使用的一些最广泛的技术，以特定自身免疫性疾病或特定抗体的例子为例，重点比较了基于不同抗原的、使用更传统或新技术的检测方法的性能。我们承认，由于该领域有大量的文献且不断更新，因此本综述并不全面。

2 免疫测定类型

2.1 组织或细胞上的免疫荧光

免疫荧光利用荧光标记的抗体来检测和可视化生物样本（如细胞或组织切片）中的特定抗原，同时保持其空间结构，使得该技术特别适用于检测针对细胞内或膜相关靶标的自身抗体，以及识别与特定自身免疫性疾病相关的特征性染色模式。经过适当处理后，样本与特异性结合目标抗原的一抗孵育。在直接免疫荧光（DIF）中，荧光染料直接与一抗结合。而在IIF中，使用未标记的一抗和荧光标记的二抗，后者与一抗结合[43, 44]。虽然DIF方法更快、更直接，但如果目标抗原表达量较低，其染色强度可能较低。另一方面，IIF方法允许信号放大和灵敏度提高，因为多个二抗可以结合到一个一抗上。孵育并洗涤以去除未结合的抗体后，使用荧光显微镜检查样本，特定波长的荧光使目标抗原可见[45, 46]。在自身免疫性疾病的诊断中，目标是获得抗原和自身抗体之间的识别。因此，直接IF需要患者的组织样本来检测致病性的自身抗体-抗原复合物，特别是在需要可视化免疫复合物或天然组织内抗原分布的情况下（如自身免疫性皮肤疾病）。IIF侵入性较小，可以检测生物液体（如血清）中的循环自身抗体（作为一抗）。IIF常与HEp-2细胞等底物一起使用，用于检测针对细胞内抗原的自身抗体，因为这些抗原在其天然细胞环境中呈现，保持了构象、PTMs和分子相互作用。由此产生的荧光模式提供了反映潜在抗原特异性的诊断线索。只有少数细胞内自身抗原可以以保持关键表位的重组形式可靠地产生，这意味着固相测定仅覆盖常见靶标，而罕见、结构复杂或依赖PTMs的抗原只能通过特征性的HEp-2 IIF模式检测到[47, 48]。在基于细胞的测定（CBAs）中，通常使用人胚胎肾293（HEK293）细胞，这些细胞被转染编码目标抗原的人类互补DNA（cDNA），使其在细胞表面表达。这些测定对于检测针对膜蛋白构象表位的自身抗体尤为重要，因为这些表位在常规固相测定中使用的变性蛋白质中通常无法保持。由于抗原在细胞环境中表达，CBAs保持了天然的三维结构和多聚化。这使得CBAs特别适合检测针对细胞表面抗原的致病性自身抗体，例如那些参与自身免疫性神经疾病的抗体[49-51]。然后将患者血清、血浆或脑脊液（CSF）与这些细胞孵育，通过荧光二抗识别抗原特异性抗体，通过荧光显微镜终点滴定或流式细胞术定量确定抗体水平[52]。活细胞呈现正确折叠的抗原，但维持活细胞的技术要求较高，因此活细胞CBAs耗时较长，仅限于专业中心使用。临床实验室使用的商业CBAs使用固定和透化的细胞。使用戊二醛进行固定以通过蛋白质交联保存和稳定细胞，并便于运输试剂盒，但这可能会通过掩盖或变性某些表位而降低抗原性；此外，细胞透化可能导致错误阳性结果，因为会识别针对细胞内表位的抗体。因此，细胞固定和透化可能导致非特异性抗体结合，从而降低CBAs的灵敏度和特异性[49, 52, 53]。

2.2 免疫印迹

免疫印迹，也称为Western blotting，是免疫学和分子生物学中广泛使用的技术，用于在复杂混合物中检测特定蛋白质，利用抗体-抗原复合物的特异性。该方法结合了凝胶电泳和基于抗体的检测原理，有助于自身免疫性疾病的诊断和研究，因为它能够识别针对特定抗原的自身抗体[54]。免疫印迹的过程包括几个关键步骤。首先，含有目标蛋白质抗原的样本进行电泳，根据分子量分离蛋白质（使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE））。电泳后，蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，即印迹步骤。转移后，膜与可能含有针对目标蛋白质的一抗的生物样本孵育，该一抗通常来自血清或血浆样本，与膜上的相应抗原结合。洗涤掉未结合的一抗后，应用酶标记的二抗复合物以显示抗体-抗原复合物，形成蛋白质条带[55]。类似免疫印迹的技术包括点印迹（dot blotting）和线印迹（line blot）。点印迹是免疫印迹的简化版本，其中蛋白质直接以点状图案固定在膜上。在线印迹中，高度纯化的重组或天然抗原以细平行线固定在硝酸纤维素或PVDF膜条上。这些技术耗时较少，因为不需要电泳，适用于快速筛查多个样本[56, 57]，但它们基于重组蛋白的使用，而Western blotting在SDS-PAGE分离的样本上可以检测针对天然形式的抗体的抗体。无论如何，DOT blot和LIA提供了更高的灵敏度和简便性，并允许对多种抗原进行快速多参数分析。有商业试剂盒可用于检测与各种自身免疫性疾病相关的多种抗体特异性[58]。然而，免疫印迹技术仅提供定性或半定量结果，提供蛋白质水平的相对比较，而不是绝对浓度测量[55, 56]。定性结果可以通过视觉检查简单地产生，即通过观察是否有斑点来确定。扫描密度测定法被认为是半定量评估印迹的金标准，该方法通过分析条带的强度，并得出与相应阳性和临界对照强度相对的结果[57, 59]。

2.3 固相平台

固相测定法最初是为替代放射免疫测定法而开发的，它提供了一种更安全、更易获得的替代方案，因为不需要对抗原或抗体进行放射性标记，因此也不需要特殊的设备，同时保持了放射免疫测定法的高灵敏度[60]。这一点，加上这些技术的标准化和自动化可能性，使得它们在全球临床实验室中得到了广泛应用[61]。在这些测定法中，抗原被固定在固体表面上，这可能会部分改变它们的天然结构；因此，固相测定法特别适用于检测针对线性或结构稳定表位的自身抗体，这些表位在抗原纯化和固定后仍然可以被识别，而识别构象或复杂表位的抗体可能检测效率较低。酶联免疫吸附测定法（ELISA）在20世纪70年代被引入[62]，就在用酶标记抗体的技术被报道之后不久；而在过去的几十年里，诊断平台的自动化进步使得固相测定法如CLIA和荧光酶免疫测定法（FEIA）在临床实验室中迅速得到应用。这些新技术在灵敏度和特异性方面有了显著提升，同时提高了通量和缩短了周转时间。多重自身抗体测定法能够同时检测多种自身抗体。这为进行全面的自身抗体谱分析提供了可能，这对于改善自身免疫性疾病的诊断特别有用，有助于患者的分类，尤其是在涉及多种抗体的疾病情况下。抗体谱分析有助于早期诊断，因为可以检测到预测性抗体，并且还可以将患者分类到由特定自身抗体特征的正确疾病亚型中。它们还可以帮助监测疾病的活动和结果，因为某些抗体与疾病的预后有关，从而有助于治疗选择。此外，多重测定法在随访检测中可以检测到一些临床上相关的抗体，这些抗体对于鉴别诊断和预后很有用，但通常不会被常规分析[63, 64]。理论上，由于原理相同，多重测定法获得的抗体特异性结果应该与传统技术获得的结果相当。然而，在单一测定法中结合多种抗原可能会导致个别抗原-抗体相互作用的条件不佳，并可能引入干扰，影响信号检测[65, 66]。围绕多重免疫测定法在临床和研究中的应用的主要担忧是其分析质量和验证问题。许多多重测定法上市时，其针对传统或金标准方法的验证有限，这突显了在广泛临床应用之前进行严格性能评估的持续需求。与单重测定法相比，多重平台引入了更大的质量控制挑战，部分原因是用于解释多重数据的质量控制材料和标准化算法仍然不够完善。同时测量多种异质分析物需要在共同的测定条件下生成稳健且有意义的校准曲线，然而，确定一个适用于所有标记物的单一样本稀释因子往往是不切实际的。这通常需要根据分析物的丰度来分割样本组，从而复杂化工作流程并限制了标准化。此外，优化一个适用于每个组成标记物的通用测定格式，包括稀释因子、捕获和检测系统、孵育时间和洗涤条件，是一个主要的障碍，阻碍了协调和自动化。因此，多重测定组中所有分析物同时满足质量控制规格的可能性远低于单重测定法。额外的挑战来自于抗体的验证：大规模表征亲和力、特异性、交叉反应性和动力学参数既费时又昂贵，而且在单重格式下验证的抗体在多重设置中可能会表现出交叉反应性，需要针对特定应用进行验证[67]。交叉反应性会降低检测限并增加结果不准确或误导的风险。此外，研究表明，随着测定组中分析物数量的增加，非特异性背景和分析物间的干扰可能会降低分析的灵敏度和特异性，进一步强调了确保多重免疫测定法可靠性能的复杂性。交叉反应性是多重免疫测定法的一个主要限制，因为抗体由于特异性不完美而经常结合到非目标上，产生的信号与真正的抗原-抗体信号无法区分。因此，在最理想的情况下，交叉反应性主要增加了背景噪声，从而降低了分析灵敏度；而在最坏的情况下，它会产生假阳性信号，可能导致错误的结论和错误分类。随着多重测定组中分析物数量的增加，这个问题会变得更加严重，因为潜在的交叉反应相互作用的数量大约与目标数量的平方（4N2）成正比，极大地增加了可能发生的非预期抗体-抗原、抗体-抗体和试剂相互作用的数量。因此，即使是一个特异性较差的抗体或污染的试剂也可能影响整个测定组的性能，这突显了交叉反应性作为限制多重测定法规模化和其灵敏度、特异性、重复性和整体分析可靠性的关键因素[68, 69]。许多临床医生可能错误地认为市售的免疫测定法，包括多重平台，都是完全经过验证的，并且与传统方法相当，这强调了了解每种测定法在特定测试人群中的限制的重要性[65]。最常见的多重技术之一是ALBIAs，而许多其他技术，如基于颗粒的多分析物技术（PMAT）、纳米条形码、抗原阵列和生物传感器也在出现，但尚未得到广泛采用[19, 35, 63]。这些新技术在自身免疫性疾病诊断领域变得越来越重要，并正在逐渐取代更传统的固相测定法来检测多种自身抗体[35, 70, 71]。

2.3.1 酶联免疫吸附测定法（ELISA）

ELISA通过使用酶作为标签来检测样本中特定分析物的存在：加入适当的酶底物后，会发生显色反应，通过分光光度分析来监测该反应以量化分析物。基本程序包括首先在塑料表面（现在是微孔板孔）上涂覆抗原或抗体，然后加入样本，接着引入针对该分析物的酶标记抗体[72]。根据样本和分析物的性质，临床实践中可以使用不同的ELISA方案[73]。直接ELISA涉及将抗原吸附在固体支持物上，然后加入酶标记的一抗。之后加入底物，在反应停止后记录最终读数信号。这种方法的一个主要限制是酶标记抗体的可用性，这个问题可以通过间接ELISA来解决：与酶结合的抗体是二抗，它识别一抗，而不是直接识别孔上涂覆的抗原。在自身抗体测定中，一抗存在于患者血清/血浆中要检测的分析物中。这种方法可以（或允许）放大信号，因为多个二抗可以结合到一抗上，从而提高灵敏度。夹心ELISA首先在孔底涂覆抗体（捕获抗体），然后孵育含有分析物的样本。接着加入另一种酶标记的分析物特异性抗体（检测抗体），最后加入底物以显示目标分子的浓度。由于双重识别以及通常使用单克隆抗体作为捕获抗体和多克隆抗体作为检测抗体，夹心ELISA通常具有高灵敏度和特异性，适用于检测非常低浓度的分析物。在竞争性ELISA中，孔表面涂覆有抗原或抗体。含有分析物的样本和与吸附分子连接的酶一起孵育，然后同时放入孔中。标记和未标记的抗原或抗体分子竞争结合到样本中的抗体。在这种情况下，分析物浓度与产生的颜色强度成反比。几个因素影响ELISA的灵敏度，首先是抗体对其目标抗原的亲和力，因为高亲和力的抗体能够检测到更低的抗原浓度。不同的ELISA方案也会影响灵敏度。酶连接的二抗提供的信号放大可以进一步提高测定法的灵敏度。由于抗原、单克隆捕获抗体和多克隆检测抗体之间的双重识别，夹心ELISA通常具有更高的灵敏度。酶-底物系统的选择是另一个关键因素：产生强烈且易于测量信号的反应可以提高测定法的灵敏度，从而允许检测更低量的分析物[74]。最常用的酶是辣根过氧化物酶（HPR）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶[72]。ELISA的特异性主要取决于抗体的质量、使用适当的阻断剂以防止非特异性结合、彻底的洗涤步骤以去除未结合的物质，以及选择产生最小背景噪声的酶-底物系统[74]。

2.3.2 化学发光免疫测定法（CLIA）

发光是指处于激发状态的分子恢复到基态时发出的光。在化学发光中，激发分子的能量由化学反应产生[75]。CLIA使用发光分子作为标签来指示分析物的存在。抗原被结合到固相上，通常是顺磁珠，以获得更大的表面结合面积并避免使用微孔板[76]。在直接CLIA中，发光团（通常是吖啶inium和钌酯）与二抗结合，而在间接CLIA中，底物如1,2-二氧杂环丁烷芳基磷酸酯（AMPPD）或异鲁米诺通过酶（分别AP或HRP）与二抗催化的反应转化为发光分子。因此，发光信号与抗原特异性抗体滴度成正比。CLIA有许多优点：低背景或干扰发射允许高灵敏度和特异性，以及宽的动态范围；高自动化和标准化提高了生产力和重复性[77]。

2.3.3 荧光酶免疫测定法（FEIA）

FEIA是一种酶免疫测定法，其中二抗与一种酶结合，该酶将底物转化为荧光分子，这使得与ELISA相比，可以更快地测量低浓度的抗原[78]。底物通常是4-甲基伞形花烃基-β-D-半乳糖苷，抗体用β-半乳糖苷酶标记[79, 80]。与CLIA一样，FEIA允许高度自动化，从而缩短了诊断实验室的周转时间并提高了生产力[77]。

2.3.4 多重可寻址激光珠免疫测定法（ALBIA）

ALBIAs基于Luminex技术[81]。该技术使用一组具有100种独特颜色的珠子，这些颜色是由两种荧光染料以特定比例组合而成的；为了实现多重检测，不同的抗原被结合到不同颜色的珠子上。然后将这些珠子组合在微孔板孔中，使不同的抗原与患者血清孵育，然后再与荧光标记的二抗孵育。通过双激光系统通过流式细胞术分析这些珠子。红色激光激发每个珠子中的染料以确定染料比例。绿色激光激发荧光标签以量化捕获的分析物[82, 83]。ALBIA是一种快速、经济、定量且可靠的方法，可以同时检测针对不同目标自身抗体的多种自身抗体，是WBs或ELISA等其他固相测定的有效替代方案[81]。然而，这项技术需要流式细胞仪，这种仪器并不总是可用的。

2.4 表面等离子体共振（SPR）

基于表面等离子体共振（SPR）的免疫测定法通过光的激发记录传感器表面折射率或厚度的变化，从而实时检测生物识别分析物，无需使用二次标签[84]。抗原被固定在金传感器芯片表面上，而分析物在溶液中流动。全自动和快速响应是SPR的主要优点之一，此外还可以检测在其他技术（如ELISA）中可能被低估的低亲和力抗体，例如在MS中检测抗葡萄糖基肽抗体[85]。已经描述了SPR生物传感器在抗磷脂综合征（APS）[86]、类风湿性关节炎（RA）[87]、系统性红斑狼疮（SLE）[88, 89]、多发性硬化症（MS）[90]和CD[91]中的自身抗体检测。在自身免疫性疾病（AD）中应用SPR的一个显著例子是Trabucchi等人的研究，他们通过SPR研究了1型糖尿病患者的胰岛素自身抗体，从浓度和亲和力两个方面进行了表征，并展示了与胰岛素前体自身抗体不同的模式[92]。实际上，对儿童期发病和成人期发病糖尿病患者进行的比较测试表明，这两种糖尿病患者之间存在不同的自身免疫过程。SPR作为一种强大的技术，有助于深入理解抗原-抗体相互作用的动力学参数，这有助于患者的分类，尽管到目前为止，它尚未被明确纳入常规标志物筛查中。

3. 自身免疫性疾病的自身抗体检测

3.1 自身免疫性大疱性皮肤病及其抗原特异性

自身免疫性大疱性疾病（AIBDs）的特点是皮肤和黏膜出现水疱，这是由于自身抗体攻击角质形成细胞的黏附分子所致。在天疱疮的情况下，主要的目标抗原是钙粘蛋白类型的桥粒连接蛋白，特别是桥粒胶蛋白（Dsg1和/或3，具体取决于疾病亚型），这些蛋白负责连接相邻的角质形成细胞[93, 94]。钙粘蛋白形成了一大类细胞表面受体，介导钙依赖性的细胞-细胞识别和黏附。所有钙粘蛋白成员都共享一个保守的结构单元——EC结构域，这是一个大约由110个残基组成的β折叠结构域，并根据这些重复序列的数量和排列被分类为不同的亚家族。连续EC结构域之间的连接区可以结合三个Ca2+离子，从而稳定结构并赋予外域特有的弯曲性。在黏附连接处，钙粘蛋白通过顺式（同一细胞内）和反式（细胞间）界面结合，后者由穿过细胞膜间隙的外域形成。经典的钙粘蛋白通过其膜远端的EC1结构域形成链交换二聚体来进行反式黏附：一个分子的N端A*链插入到另一个分子的保守疏水口袋中，这一过程由一个锚定色氨酸残基稳定（图1）。这种相互作用体现了三维结构域的交换，其中A*链可以在分子内部对接形成封闭的单体，或者在分子间对接生成交换的二聚体[95]。天疱疮中的水疱形成被认为通过两种主要机制发生：一种是空间阻碍，即致病性自身抗体直接阻断桥粒胶蛋白的反式或顺式相互作用；另一种是细胞反应，其中自身抗体触发桥粒胶蛋白的内化及其降解。

图1：钙粘蛋白链交换过程的示意图。左侧示意性地显示了两个单体（酒红色和蓝色）处于闭合构象，右侧显示了链交换后的二聚体。仅展示了EC1和EC2结构域，以及中间的钙离子（绿色）（PDB: 2O72）。致病性自身抗体主要识别这些跨膜蛋白的N端EC结构域，这些结构域对于桥粒胶蛋白的相互作用至关重要[96-99]。在天疱疮样疾病中，抗原目标是半桥粒蛋白和结构纤维，导致表皮与下层真皮分离[48, 100, 101]。在大疱性天疱疮（BP）中，自身抗体针对的是胶原XVII（BP180）和 dystonin-e（BP230）[102, 103]。BP180是一种跨膜糖蛋白，其C端细胞外部分由15个胶原结构域组成，每个结构域之间由非胶原（NC）结构域分隔。胶原结构域由重复的甘氨酸-X-Y基序构成，其中X是脯氨酸，Y是羟脯氨酸。胶原三螺旋的形成使BP180成为三聚体。除了多个潜在的细胞内结合位点外，BP180还在一个细胞外丝氨酸残基处含有一个罕见的磷酸化位点。具体来说，人类BP180第16个NC结构域中的丝氨酸544位点被酪蛋白激酶II磷酸化，这增强了其作为BP自身抗体表位的识别能力，并可能具有调节生理作用[104, 105]。实际上，NC16是大多数患者中IgG自身抗体所针对的关键抗原位点。对于BP230这种plakin蛋白家族的细胞内蛋白，主要表位位于其球形的C端结构域[106, 107]。抗BP230自身抗体的产生被认为是通过表位扩散机制：针对BP180细胞外表位的抗体可以导致细胞损伤，暴露出细胞内的BP230，从而在疾病过程中促进抗BP230自身抗体的产生。BP230的N端区域可能首先被识别，因为它通过与BP180和β4整合素亚单位的相互作用定位于半桥粒上，随后C端区域通过表位扩散被识别[108, 109]。

3.1.1 IIF技术在AIBDs中的应用

对病变周围活检标本的冷冻切片进行直接免疫荧光（DIF）被认为是诊断的金标准，其特异性为98%，敏感性在82%–91%之间[48, 110-112]。观察到的荧光模式可以指示疾病的亚型：IgG和/或C3的细胞间沉积呈蜂窝状是落叶性天疱疮（PF）、寻常型天疱疮（PV）和其他类型天疱疮的特征，而BP和其他罕见亚型则表现为基底膜区（BMZ）沿线的线性IgG和/或C3沉积[113, 114]。间接免疫荧光（IIF）可以在患者血清中检测特定的底物上的循环自身抗体，如人皮肤、猴食管、啮齿动物或猴膀胱。使用天疱疮患者的血清时，猴食道的敏感性为81%–100%，特异性为89%–100%，使其成为疑似PV和PF病例中检测细胞间抗体的最佳底物[48, 115, 116]。盐裂皮肤特别适用于检测抗BMZ自身抗体，其敏感性为73%–96%，特异性为97%。它还有助于根据抗原在裂片顶部或底部的位置来确定天疱疮的类型[48, 112, 117]。AIBDs的血清学诊断是一个多步骤过程，首先使用IIF作为金标准来观察荧光模式，但需要后续的抗原特异性免疫测定，如广泛可用的ELISA或专门的免疫印迹和免疫沉淀，以确定确认诊断所需的特定自身抗体特异性[110]。

3.1.2 IIF在AIBDs中的前景

常用的IIF底物包含多种抗原。为了简化解释，已经开发了重组IIF测定方法，其中只评估一种抗原。底物可以是重组表达选定抗原的HEK293细胞，或者是纯化的抗原本身，这些底物被涂覆在微型BIOCHIP上（Euroimmun，德国吕贝克），然后排列在显微镜载玻片上。不同的底物可以在一个马赛克BIOCHIP中组合，以便在单次孵育中筛查多种抗原，节省时间和血清，并允许区分不同的疾病亚型，所有这些都可以使用单个样本。这种BIOCHIP技术产生的结果与标准且耗时的多步骤方法相当，因此是一种实用、特异性强且敏感的AIBD筛查替代方法，适用于IIF和ELISA[115, 118-120]。尽管ELISA和IIFT-BIOCHIP在天疱疮和BP的诊断准确性上相当，但IIFT-BIOCHIP仅具有半定量特性，无法可靠地监测抗体水平，并且依赖于主观解释，这限制了其临床应用。相比之下，ELISA具有高特异性、高敏感性、定量检测能力，并适合高通量测试，但它对操作条件敏感，容易发生交叉反应，检测范围有限，成本较高，且无法直接检测抗原-抗体复合物。

3.1.3 ELISA在AIBDs中的应用

用于检测AIBDs主要抗原的ELISA非常普遍，包括抗Dsg1和Dsg3 ELISA，这些ELISA对天疱疮类型疾病具有高敏感性和特异性，有助于区分不同类型的疾病[121-123]。对于BP，有针对BP180和BP230的ELISA：BP180 ELISA的诊断价值远高于BP230 ELISA，因为只有大约60%的BP患者存在BP230自身抗体。值得注意的是，结合这两种测定方法可以略微提高BP诊断的敏感性[48, 124, 125]。此外，ELISA不仅适用于诊断，还适用于监测疾病进程，因为抗体水平通常与疾病活动相关[125-129]。为了进一步改进和标准化AIBDs的血清学诊断，已经开发了多变量ELISA，使用6种主要的天疱疮（桥粒胶蛋白1、桥粒胶蛋白3、envoplakin）和天疱疮样疾病（BP180、BP230、VII型胶原）的重组靶抗原，这些靶抗原被分别涂布在不同的孔中。现在有两种商业化的试剂盒（MBL，Euroimmun），可以同时筛查不同的AIBD相关抗原。它们的多变量特性，结合ELISA平台，使得筛查更加客观、快速和标准化，与传统的IF技术相比具有优势。尽管如此，与单克隆ELISA相比，共享相同的临界值可能会产生一些不明确的结果[122, 130, 131]。在抗原特异性测定的背景下，CLIA通过提供更高的敏感性、更宽的动态范围和精确的抗体定量来克服ELISA的一些局限性，从而监测疾病活动。此外，其简化且自动化的操作流程提高了效率，而成本效益高的设备和试剂使用使得CLIA特别适合大规模临床测试[132]。

3.2 系统性风湿性疾病中的抗核抗体（ANA）

ANA是一组多样化的自身抗体，它们针对细胞成分，如核酸（DNA或RNA）、蛋白质及其复合物。某些ANA与特定的疾病密切相关，这些疾病被称为ANA相关风湿性疾病（AARD），例如系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SSc）、干燥综合征（SjS）和特发性炎症性肌病（IIMs）等（表1）[11, 71, 133]。表1显示了与各种风湿性疾病相关的ANA的自身抗原特异性和HEp-2 IIF染色模式。

ANA的IIF检测是在HEp-2细胞上进行的，HEp-2细胞是一种源自人类喉癌的上皮细胞系。HEp-2细胞已经取代了组织切片，因为它们便于观察和识别许多自身抗体，主要是因为这些细胞具有较大的细胞核，并以扁平的单层形式生长，而且目标抗原在细胞周期的不同阶段都有表达[35, 134]。此外，HEp-2细胞不仅能够检测针对核抗原的抗体，还能检测针对细胞质和有丝分裂组分的抗体，这些在临床上同样重要；因此，从字面上讲，使用“ANA”这个术语可能有些误导[71, 133, 135-138]。

3.2.1 HEp-2 IIF在ANA检测中的性能

HEp-2 IIF不仅可以确定ANA的存在与否，还可以提供其他有价值的信息，例如它们的染色模式和产生阳性测试结果的抗体滴度[135, 139]。主要的ANA染色模式包括均匀型、斑点型、核型和着丝粒型。这些模式有助于确定抗体特异性，但还不够充分，建议进一步使用抗原特异性固相免疫测定（SPAs）进行表征（图2）[43, 140-142]。国际抗核抗体模式共识组织（ICAP - https://www.anapatterns.org/index.php）已经尝试对染色模式进行标准化，承认在日常诊断工作中观察到的模式并不总是清晰且容易归类[136, 138]。间接免疫荧光（IIF）是ANA筛查的金标准技术：观察到的荧光模式提供了关于ANA特异性的信息。然而，要确诊特定的自身抗体，还需要使用抗原特异性固相免疫测定（SPAs）进行进一步表征。HEp-2免疫荧光（IIF）检测方法被美国风湿病学会（ACR）认定为ANA筛查的金标准，因为与固相免疫吸附（SPA）相比，它具有更高的灵敏度和检测广泛自身抗体的能力[143-145]。然而，该检测方法存在特异性较低的问题，因为ANA也存在于非风湿性疾病患者和健康个体中，并且不同制造商和实验室之间的重复性也存在差异。造成这种变异性的因素有很多，首先是市场上多种检测试剂盒之间的不统一性，特别是在培养HEp-2细胞、制备载玻片以及所用试剂的多样性方面，这些因素都会影响抗原及其表位的暴露程度。结果的不一致可能会影响诊断和临床评估、临床试验的纳入，或者治疗药物的处方[141, 146, 147]。IIF还是一种耗时的技术，而且结果的解释依赖于操作者，这也增加了结果的变异性[148]。最近，诸如自动载玻片处理系统和计算机辅助诊断（CAD）等技术的进步有助于减少主观性并提高重复性。然而，其中一些问题仍然存在争议，一方面是因为手动操作目前仍无法完全避免[149, 150]；另一方面，我们正面临着一个人工智能和机器学习将在临床医学分析策略中发挥越来越重要作用的未来[151, 152]。

3.2.2 ANA检测的前景

最近SPA技术的改进以及HEp-2 IIF在ANA筛查中的局限性，使得许多人重新考虑其作为金标准的地位：当HEp-2 IIF被指定为金标准时，SPA主要基于ELISA平台，其性能较差，尤其是在灵敏度方面，但由于其更高的通量和更快的结果，在临床实验室中得到了广泛应用[153]。然而，现在ELISA正被更精确的化学发光（CLIA）和荧光免疫酶（FEIA）方法所取代，根据不同的疾病类型，这些方法的表现有时甚至更优[71]。此外，这些技术的自动化降低了样本处理时间，从而提高了实验室的生产效率，并优化了检测的标准化[70]。同时，像ALBIA和PMAT这样的多重检测方法也被开发出来，能够以高度自动化的程度同时测量针对多种自身抗体的特异性。最后，基于线性免疫印迹（line immunoblot）技术的商业检测方法的出现，为识别与疾病相关的抗体特异性提供了另一种策略[71, 154]。然而，固相ANA检测方法受到其有限抗原谱的限制，通常只能覆盖大约15种主要抗原，这排除了仅通过HEp-2细胞上的IIF才能检测到的罕见特异性抗原[154]。此外，抗原的来源也是一个额外的挑战，因为重组蛋白可能缺乏在IIF中可识别的天然蛋白质修饰或构象表位。总体而言，尽管这些多重平台具有操作上的优势，但它们引入了重要的分析挑战，包括复杂的校准要求、需要为不同分析物优化共享的检测条件，以及增加了交叉反应性和分析物间干扰的可能性，这可能会影响灵敏度和特异性，尤其是在抗原谱扩大时[65, 67, 69]。关于这些SPEs与Hep-2 IIF的诊断性能比较，目前仍存在争议。共识是，结合使用IIF和SPA进行ANA筛查可以提高诊断的准确性和效率，因为它们可以提供互补的信息：双重阳性时，假阳性率会降低[71, 144, 150, 154-156]。

3.3 自身免疫性肝炎中的自身抗体

在自身免疫性肝病中，建议首先使用IIF在啮齿动物组织上进行ANA筛查。然而，阳性结果应通过HEp-2-IIF进一步确认荧光模式，因为75%的1型自身免疫性肝炎（AIH）患者和30%-50的原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者中都存在ANA[157]。抗平滑肌抗体（SMA）与AIH早期相关，并在肾脏组织上显示三种不同的染色模式：动脉血管（V）、肾小球系膜（G）或肾小管（T）的染色。虽然V模式不具有疾病特异性，但VG和VGT模式与1型AIH高度相关，尤其是在同时检测到ANA的情况下[157]。SMA识别的自身抗原是细胞骨架的结构：主要靶标是丝状肌动蛋白（F-actin），这是一种高度聚合的蛋白质，在80%的VGT模式患者中存在，其被识别的表位主要是构象性的。聚合F-actin的复杂性以及提取过程中其天然构象的丧失可能解释了ELISA在检测SMA时的表现差异。IIF仍然是唯一能够可靠检测AIH相关抗原谱的方法，尽管不同实验室之间的IIF技术存在差异且缺乏标准化。尽管如此，人们仍在努力开发非操作者依赖的检测方法，例如使用其他细胞骨架蛋白作为抗原的ELISA，但这些方法的灵敏度目前仍低于IIF对于AIH-1的检测[159, 160]。其他抗原靶标包括波形蛋白、微管蛋白和纤连蛋白，尽管许多靶标仍需在分子水平上进行表征，因此尚未在基于纯化或重组抗原的分子检测中得到应用[159, 160]。虽然慢性乙型或丙型肝炎患者中也可能检测到低滴度的ANA和/或SMA，但这些抗体通常缺乏对F-actin的特异性[161]。抗肝肾微粒体（LKM）抗体是2型AIH的血清学标志物，在70%的AIH-2患者中可以检测到抗-LKM1抗体。主要抗原靶标是细胞色素P450酶（CYP2D6）的2D6亚型，同时还能识别蛋白质二硫键异构酶ERp57和羧酸酯酶1（CES1）[159, 162, 163]。表位映射确定了几个免疫优势区域，特别是氨基酸193–212、257–269和321–351，在大多数AIH-2患者中都能被识别。在没有丙型肝炎病毒（HCV）感染的情况下，抗-LKM1抗体被认为是AIH-2的诊断标志物，因为一些抗-HCV抗体会与CYP2D6上的构象表位发生交叉反应[164-166]。抗肝细胞质（LC1）抗体针对的是参与叶酸代谢的多功能酶formiminotransferase cyclodeaminase，在约30%的AIH-2患者中可以检测到，而在三分之一的病例中，它们是唯一被检测到的抗体，因此将其纳入初步筛查至关重要[159]。

3.3.1 AIH相关抗体的检测

IIF能够同时检测主要的肝脏相关自身抗体，并且能够检测到目标抗原尚未明确的自身抗体。尽管IIF是金标准，但它也有几个缺点。在啮齿动物组织上进行IIF时，抗-LKM1会强烈染色肝细胞胞质和近端肾小管，但不会染色胃组织。抗-LC1抗体也会染色肝细胞胞质，但不会染色中央静脉周围的细胞层，因此可能会被抗-LKM1抗体掩盖[167]。仅使用肾脏组织或准备不当的基底物可能导致结果解释错误，从而混淆染色结果。此外，IIF是一种耗时、依赖操作者且繁琐的技术，需要高质量的基底物。确定这些抗体的分子靶标促进了基于重组或纯化抗原的分子检测方法的发展，特别是针对AMA、抗-LKM1和抗-LC1的抗体的检测，这些方法现在已商业化并广泛使用。普遍的共识是，SPA不应作为筛查工具，而应用于确认IIF的结果[163, 168, 169]。因此，已经建立了其他针对特定抗原的技术，如免疫印迹或反向免疫电泳，以及基于纯化或重组抗原的固相检测方法。特别是抗可溶性肝抗原抗体（anti-SLA），这是唯一针对AIH的特异性抗体，只能通过固相检测方法检测到，最常见的是竞争性ELISA[161, 163, 170, 171]。如前文第3.3节所述，AIH根据血清学特征分为两个主要亚型。1型AIH（AIH-1）通过SMA和ANA的存在来识别。虽然SMA在大约35%的AIH-1患者中存在，当与ANA结合时这一比例上升至60%，但它们也存在于其他多种感染性、风湿性或肝脏疾病中，然而针对其特定靶标——丝状肌动蛋白（F-actin）的抗体是AIH-1的典型特征。相比之下，2型AIH（AIH-2）通过检测抗-LKM1（anti-LKM1）和/或抗肝细胞质1型（anti-LC1）抗体来定义[157, 159, 172]。虽然目前还没有确定SMA F-actin识别的金标准方法，但国际共识是将啮齿动物组织上的IIF作为基本的自身抗体检测方法。另一方面，针对F-actin的可靠固相免疫检测方法（SPA），如ELISA和免疫印迹，已经得到验证，ELISA现在已被纳入更新的诊断评分标准中。这些SPA方法具有明显的临床优势：ELISA提供定量数据，适合监测疾病活动和治疗反应，适用于高通量实验室；而免疫印迹能够同时检测多种自身抗体，有助于确认F-actin的特异性以及其他抗原，从而提高临床实践中AIH诊断的准确性和效率[172, 173]。

3.4 原发性胆汁性胆管炎

AMA对PBC具有高度特异性，在90%-95%的患者中可以检测到[174, 175]。在啮齿动物肝脏、肾脏和胃组织的IIF检测中，AMA表现为肾小管细胞、胃壁细胞和肝细胞的颗粒状胞质染色[176]。抗线粒体抗体（AMAs）对原发性胆汁性胆管炎（PBC）具有高度特异性，在90%-95%的患者中可以检测到[174]。（A）AMA针对的是线粒体内膜中的抗原，特别是2-氧酸脱氢酶复合物（2-OADC）的E2亚单位，其中丙酮酸脱氢酶复合物（PDC-E2）是主要的AMA靶标。这些抗原的免疫优势表位包含一个重要的翻译后修饰（PTM），即赖氨酸173的脂酰化，这突显了脂酰基结构域在AMA识别中的关键作用。（B）小鼠组织切片上的AMA免疫荧光染色模式：胃（左）、肾脏（中）和肝脏（右）。这些自身抗体针对的是线粒体内膜中的特定抗原，特别是2-氧酸脱氢酶复合物（2-OADC）的E2亚单位[177-179]。主要抗原靶标是丙酮酸脱氢酶（PDC-E2）的E2亚单位，其他线粒体自身抗原还包括支链2-氧酸脱氢酶复合物（BCOADC-E2）和氧代戊二酸脱氢酶复合物（OGDC-E2）的E2亚单位，以及E3结合蛋白（E3BP）。免疫优势表位精确地定位在E2亚单位的脂酰酸结合域（lipoyl domain）内，其中包含赖氨酸173的ε基团的脂酰化修饰。这种修饰对于蛋白质的酶活性至关重要，同时也对于AMA的识别和结合至关重要[158, 182]。脂酰基结构域的抗原性可能部分归因于其独特的构象，以及脂酸相对于PDC-E2主分子的“摆动臂”旋转能力，以及在氧化磷酸化过程中脂酸二硫键的动态开闭[180, 181]。然而，这种反应性使得这些抗原容易发生异常修饰，从而产生新的抗原，导致耐受性的丧失和AMA识别的失败[180, 181]。事实上，研究发现，一些外源性修饰的PDC-E2衍生物比天然脂酰基PDC-E2更容易与AMA发生反应：在遗传易感个体中，长期接触电活性物质如阿司匹林和对乙酰氨基酚可能会触发或加速对PDC-E2的免疫耐受性的丧失，最终导致PBC[183]。推荐的、最常用的AMA检测方法是在冷冻切片上的大鼠肝脏、肾脏和胃组织上进行IIF[177, 178]。使用其他检测方法测试血清样本对于确认不确定的IIF结果和确定抗体特异性是必要的。Western免疫印迹（W-IB）是一种常用的技术，因为它比IIF具有更高的灵敏度和特异性[184]。W-IB的抗原来源是来自牛或猪心脏的线粒体制备物，这些抗原在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后转印到硝酸纤维素滤膜上，与PBC患者血清孵育后显示出主要的74 kDa（PDH-E2）、52 kDa（BCOADC-E2）和48 kDa（OGD-E2）条带[176, 177]。然而，W-IB是一种耗时且需要主观判断的技术，因此自动化和定量的抗原特异性检测方法，如ELISA或PMAT，正在逐渐取代它[185, 186]。最新的ELISA方法同时使用了纯化的PDC和一种重组融合蛋白（MIT3），该蛋白包含了三种主要AMA靶标的主要免疫优势表位[187]。这使得检测灵敏度得到了提高，因为可以同时检测到被频繁识别和不频繁识别的抗原[188]。

3.5 类风湿性关节炎（RA）的抗瓜氨酸化肽/蛋白抗体ELISA

在RA的诊断和分类中，主要涉及的抗体是类风湿因子（RF）和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体（ACPA）[189]。这些抗体在RA诊断中的重要作用在2010年的ACR/EULAR分类标准中得到了强调，因为检测到高水平的RF或ACPA可以占到诊断RA所需分数的50%[190]。RF是第一个与RA相关的抗体，它针对的是IgG的Fc部分。RF检测具有很高的灵敏度，但不具有特异性，因为RF也可以在其他风湿性疾病、感染性疾病或慢性疾病中检测到，甚至在某些健康人群中也能发现[191]。RF的检测通常使用的方法包括散射比浊法、浊度法或ELISA，其中ELISA的优势在于能够区分IgM、IgG和IgA亚型[191]。ACPA是一种能够识别含有瓜氨酸残基的肽和蛋白质的抗体，而瓜氨酸化是通过酶促脱亚胺作用将精氨酸残基转化为瓜氨酸的过程[192]。1998年，Schellekens等人证明了瓜氨酸化对于RA特异性自身抗体识别抗原表位是必需的[193]。他们首次基于瓜氨酸识别的ELISA使用了来自人类丝聚蛋白（filaggrin）序列的合成瓜氨酸化线性肽作为抗原，虽然灵敏度较低，但特异性很高[194]。为了提高检测性能，他们将线性肽替换为环状肽，这样可以更好地暴露瓜氨酸化表位[194]。这种第一代抗环状瓜氨酸化肽ELISA被称为anti-CCP1，它能够在68%的RA血清中检测到抗体，特异性达到98%（图4）[195]。然而，CCP1仍然使用丝聚蛋白衍生的环状肽作为抗原底物，而丝聚蛋白并不存在于滑膜关节中。因此，研究人员从瓜氨酸化的滑膜蛋白中筛选出了大约1200万种环状肽，并将其中最好的几种纳入了一种新的检测方法，即第二代CCP测试（CCP2测试），其性能优于CCP1测试，并有助于评估疾病的预后[196, 197]。该测试于2002年投入市场，至今仍是RA诊断和预后中最常用的检测方法[191, 195, 198]。

从丝聚蛋白到CCP1：抗原的瓜氨酸化对于RA特异性自身抗体的识别至关重要。瓜氨酸化的丝聚蛋白是最早被确定的抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体（ACPA）的抗原目标之一。因此，基于其序列的瓜氨酸化肽被用作抗原探针。肽的环化改善了检测性能，从而开发出了anti-CCP1测试及其后续版本。最近又有几种新的ACPA测试问世。第三代anti-CCP（anti-CCP3）测试包含多个瓜氨酸化表位的抗原，在早期和晚期RA患者中的检测性能与anti-CCP2测试相当[199, 200]。还开发了一种变体anti-CCP3.1，它可以检测IgA和IgG抗体，提高了灵敏度同时保持了与anti-CCP2和anti-CCP3相似的特异性[195, 201]。其他合成瓜氨酸化肽也能被ACPA识别。VCP1和VCP2是多抗原肽（MAPs），其序列分别来源于Epstein-Barr核抗原1和2（EBNA-1/EBNA-2），这些肽中含有被瓜氨酸取代的精氨酸残基重复序列，周围环绕着中性和小氨基酸[202, 203]。实际上，Epstein-Barr病毒（EBV）被认为在RA的发病机制中起作用[204, 205]。HCP1和HCP2也是MAPs，但它们的瓜氨酸化序列来源于活化中性粒细胞的组蛋白-4[206]。这四种肽是RA诊断的敏感且特异的抗原，结合使用HCPs和VCPs可以提高检测单特异性和交叉反应性ACPA的灵敏度[207]。此外，anti-VCP和anti-HCP抗体在RA患者出现症状之前就可以被检测到，并能预测疾病的发展和器官受累[208]。anti-MCV测试基于突变的瓜氨酸化波形蛋白（vimentin），这是一种细胞骨架蛋白，也是最早发生瓜氨酸化的细胞蛋白之一。然而，anti-MCV的灵敏度较高，但特异性较低，诊断准确性低于anti-CCP[209]。最后，anti-ENO CEP-1是一种基于环状形式的α-烯醇化酶（alpha enolase）瓜氨酸化表位的固相检测方法，其特异性和灵敏度分别为83%和65%[210]。尽管ACPA检测最初是基于ELISA开发的，但现在也有适用于多种自动化分析仪的版本，这些分析仪基于CLIA、电化学发光（ECLIA）和FEIA技术[191, 211]。

3.6 抗磷脂综合征（Antiphospholipid Syndrome, APS）

APS是一种自身免疫性疾病，其特征是存在抗磷脂抗体（aPL），这些抗体针对磷脂或更具体地说是磷脂结合辅因子蛋白，导致患者出现静脉和动脉血栓形成以及妊娠并发症[212]。aPL是一组针对多种不同抗原的自身抗体[213]。在APS中，主要的抗原是β2-糖蛋白I（β2GPI），这是一种由五个重复同源结构域（DI到DV）组成的血浆糖蛋白，其中第五个C末端结构域（DV）包含一个大的赖氨酸环，可以与细胞膜中的阴离子磷脂（如膜相关的心磷脂CL）相互作用。这种相互作用会导致β2GPI从圆形结构转变为开放的“鱼钩”结构，暴露出新的抗原位点[214]。β2-糖蛋白I的结构转变：当蛋白质与含有CL的膜相互作用时，会从圆形结构（DI和DV结构域相互作用）转变为开放结构，暴露出新的抗原位点并触发自身抗体的产生，这是APS的一个特征。β2GPI的分子量中有近20%（19%）由糖链组成，包含四个N-糖基化位点和一个O-糖基化位点。糖链对于维持其环状结构至关重要，而脱糖基化会促进其转变为开放结构，从而有利于与阴离子表面的相互作用[215]。在APS患者中观察到唾液酸化三聚糖减少和唾液酸化双聚糖结构增加，这可能改变了β2GPI的稳定性和折叠方式，从而在APS抗体的生成中起重要作用[216, 217]。APS的分类标准不仅包括抗β2-糖蛋白I抗体（aβ2GPI），还包括狼疮抗凝剂（LAC）和抗心磷脂抗体（aCL）[218]。LAC是一组抑制磷脂依赖性凝血反应的抗体，尽管名称如此，但实际上与静脉和动脉血栓形成以及妊娠丢失的风险增加有关，其“抗凝”效应仅在体外实验中观察到[219]。由于LAC测试可以同时检测所有抗磷脂抗体，因此可以使用固相检测方法来检测抗原特异性抗体[220]。抗心磷脂抗体和抗β2-糖蛋白1抗体分别针对细胞膜中的心磷脂[221]。然而，aCL ELISA测试依赖于β2GPI，因此实际上检测的是抗β2GPI抗体，因为试剂或患者血清中的β2GPI会与涂有心磷脂的板结合。需要注意的是，要避免检测直接针对CL的抗体，因为这些抗体通常由感染性疾病引起[222, 223]。aCL和anti-β2GPI测试通常基于ELISA，2023年的ACR/EULAR APS分类标准也继续依赖标准化的ELISA测量来评估抗体水平[218]。anti-β2GPI ELISA涉及将纯化的β2GPI直接涂覆在经过辐照的板上。理论上，这种更具选择性的方法应该能识别出更具临床意义的抗体，但有证据表明，塑料表面上的β2GPI可能会暴露不同的表位，从而降低检测的特异性[224]。此外，这种方法的局限性在于它无法检测针对其他可能具有临床意义的磷脂结合蛋白的抗体[212, 225]。 newer的技术，如化学发光、荧光免疫酶和多重流式免疫测定，正在取代ELISA，因为它们具有更统一的协议、更高的自动化程度和更强的分析灵敏度，后者能够检测到比ELISA更高的抗体滴度[222, 223, 226-229]。然而，新2023年ACR/EULAR分类标准中排除了非ELISA aPL抗体检测方法，这可能会影响某些APS患者的诊断或临床试验的纳入[230]。最近，评估针对β2-糖蛋白第1结构域（Anti-Beta-2 GPI D1）的抗体的免疫测定方法已被引入常规检测，因为它们能够识别与血栓形成更相关的抗体。从这个角度来看，anti-β2GPI-D1抗体可能是评估APS患者血栓风险的有用工具[231]。

3.7 ANCA相关血管炎（ANCA-Associated Vasculitis）

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关血管炎（AAV）是一组自身免疫性疾病，其特征是小到中等大小的血管发炎，主要影响肾脏、肺和上呼吸道等器官。这种疾病的特点是存在ANCA，主要是针对中性粒细胞中的髓过氧化物酶（MPO-ANCA）或蛋白酶3（PR3-ANCA）的抗体，这些抗体主要存在于嗜酸性粒细胞的颗粒中。MPO是一种阳离子二聚酶，由两个通过二硫键连接的单体组成，其中一个重链含有修饰的铁原卟啉IX基团和一个糖基化的轻链。MPO在先天免疫反应中起关键作用，通过催化过氧化氢和卤素离子生成次卤酸来帮助杀死病原体[232, 233]。PR3是一种丝氨酸蛋白酶，具有四个二硫键，在免疫系统中发挥多种作用[234, 235]。AAV包括肉芽肿病伴多血管炎（GPA）、显微镜下多血管炎（MPA）和嗜酸性粒细胞肉芽肿病伴多血管炎（EGPA）等疾病，其中PR3-ANCA在GPA中最常见，而MPO-ANCA在MPA和大约一半的EGPA患者中最为常见[236]。旧的共识认为应首先使用免疫荧光（IIF）进行初步筛查，只有阳性样本才需要进一步进行抗原特异性免疫检测[237]。IIF用于ANCA筛查时，样本需用乙醇固定，染色模式有两种：胞浆型通常与PR3反应相关，用于诊断GPA；而核周型则与MPO反应相关，用于诊断MPA。IIF阳性结果后，通过特异性免疫检测确定抗体的特异性[238, 239]。然而，2017年修订的国际共识推荐将抗原特异性免疫检测作为ANCA的初步筛查方法[240]。实际上，在过去几十年中，固相检测方法（尤其是ELISA）有了显著改进。最早的PR3和MPO检测方法是直接ELISA，其中抗原通过疏水相互作用与板结合，这可能会改变其构象并影响相邻表位的检测，导致检测性能不稳定和灵敏度较低。第二代ELISA利用抗体作为捕获分子来结合抗原，减少了塑料板对表位的遮蔽，保持了抗原的构象，但无法检测到由捕获抗体结合的表位。因此，灵敏度有所提高，但仍有限。这促使了第三代ELISA的发展，其中抗原通过一个连接小分子（即适配肽）固定，从而保持了抗原的构象和表位，使得检测性能优于直接ELISA[241-244]。此外，现在还有其他类型的固相检测方法上市，其性能与ELISA相当[240, 245]。研究表明，与ELISA相比，Dot Blot方法在PR3检测中表现出优异的性能，灵敏度为100%，特异性为98%，一致性为99%；而在MPO检测中灵敏度较低（53%），但特异性较高（97%），总体一致性为86%[246]。在另一项研究中，Dot Blot检测与标准ELISA具有高度一致性，并且与IIF相比具有更高的特异性，这支持了其作为快速可靠的诊断工具的临床实用性，用于检测抗PR3、抗MPO和抗GBM抗体，尤其是在高度怀疑患有AAV的患者中[247]。此外，一个多中心的欧洲血管炎研究组（EUVAS）评估了不同的抗原特异性免疫测定方法，包括ELISA、FEIA、多重流式免疫测定和CLIA，发现它们之间的准确性相当，范围在0.944到0.954之间，基于ROC曲线分析的AUC值分别在0.936（95% CI 0.912–0.960）和0.959（95% CI 0.941–0.976）[245]。

3.8 糖尿病中的抗GAD抗体

谷氨酸脱羧酶（GAD）是一种将谷氨酸转化为神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的酶，存在于神经元和胰腺β细胞中。GAD有两种异构体，GAD65和GAD67，它们的分子量分别为65 kDa和67 kDa，前者是胰岛细胞自身抗体的主要靶标，也是自身免疫性糖尿病的生物标志物[248, 249]，与胰岛素、蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白IA2和锌转运蛋白-8（ZnT8）一起[250]。在1型糖尿病（T1D）中，抗GAD抗体（GADA）是糖尿病前期亲属和新发患者中最常见的自身抗体，出现在70%–80%的病例中，其滴度会随时间下降[249, 251]。抗GAD65抗体也存在于各种神经系统疾病中，但通常滴度远高于T1D中的水平，而且它们识别的是线性表位而非构象表位[252-254]。液相放射结合测定（RBA）被认为是测量GADA的金标准，由于其高灵敏度和特异性而仍在广泛使用。尽管如此，市场上可用的非放射性测定方法，如桥接ELISA，在许多实验室中也在普及，其性能与RBA相当甚至更好[255, 256]。在RSR的GAD65桥接ELISA中[257]，微孔板上涂有高度纯化的重组GAD65。首先将患者的血清加入每个孔中，使任何存在的抗GAD抗体通过一个表位与固相固定的抗原结合。孵育后，引入生物素化的GAD65，后者随后与患者抗体的另一个表位结合。这样，患者的抗体就形成了一个“桥”，将固相GAD65与生物素化的GAD65连接起来。然后使用链霉亲和素-过氧化物酶结合物来检测这种三元复合物，后者特异性地结合抗原的生物素部分[258]。具有多种类型胰岛自身抗体的个体比那些只有单一抗体或没有抗体的个体患T1D的风险显著更高。由于连续检测这些自身抗体是一个劳动密集且成本高昂的过程，因此需要一种能够同时检测多种胰岛自身抗体的新工具，这对于诊断和评估T1D的未来风险非常有用[259]。使用三种或更多抗原（如GAD65、IA-2和ZnT8）的多重ELISA在同一孔中进行检测，显示出比单一抗体测试更优的性能[260, 261]。除了T1D之外，胰岛细胞自身抗体，特别是抗GAD65抗体，也是成人潜伏性自身免疫性糖尿病（LADA）的生物标志物，在LADA中其患病率约为91%。LADA是一种缓慢发展的免疫介导的糖尿病，其特征是成年发病、胰岛细胞自身抗体阳性以及暂时的胰岛素独立性，因此其临床特征介于T1D和T2D之间。由于LADA的发病逐渐且初期具有胰岛素独立性，常常被误诊为T2D；因此，检测抗GAD抗体对于正确的诊断和治疗至关重要[258, 262, 263]。

3.9 乳糜泻中的抗组织转谷氨酰胺酶（tTG2）抗体

乳糜泻（CD）是一种慢性、免疫介导的肠病，由饮食中的麸质在遗传易感个体中引发，其中抗体针对的是麸质，即脱酰胺的麦胶蛋白肽（DGP）和自身抗原组织转谷氨酰胺酶2（TG2），这些抗体的存在与麸质摄入量相关。在CD中，T细胞对经过脱酰胺的麸质肽产生反应，这一过程是由TG2本身催化的，某些谷氨酰胺残基被转化为谷氨酸，生成带负电荷的麸质肽，这些肽与抗原呈递细胞上的HLA-DQ2或HLA-DQ8高亲和力结合，从而驱动CD4+ T细胞的反应。因此，TG2具有双重作用，既是修饰酶也是主要的自身抗原[264, 265]。TG2是一种钙依赖的普遍存在的酶，其主要生物学功能是交联蛋白质中的谷氨酰胺和赖氨酸残基，形成异肽键，这一过程称为转酰胺作用[264, 266]。血清中抗TG2抗体的存在是CD的标志。最初，诊断基于针对未修饰麦胶蛋白的血清学检测，结合使用猴食管或人脐带进行内肌层抗体（EMA）的IIF检测。然而，尽管这种技术已经标准化，但它既耗时又费力，需要技术娴熟的技术人员来解释结果，导致了一定程度的操作者差异。在确定TG2是EMA的主要抗原靶标后，TG2的固相测定成为最常用的检测方法，从手动ELISA到自动化的荧光或化学发光免疫测定[267-269]。根据欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养学会（ESPGHAN）的建议，抗TG2 IgA测定是主要检测方法，通常在IgA缺乏的患者或幼儿中结合抗TG2 IgG或抗DGP IgG一起使用。抗EMA常用于确认抗TG2阳性结果或支持儿童的非活检诊断[270, 271]。基于TG2和DGP之间共价结合的复合物代表CD中体内生成的新生表位的假设，已经开发了基于重组tTG与选定麦胶蛋白肽交联的抗原，以提高IgA和IgG抗体的检测率[272, 273]。通过分析组织转谷氨酰胺酶的异构体（即tTG3和tTG6），可以将与麸质相关的自身免疫的临床范围扩展到肠道之外。实际上，tTG3不仅与CD诊断时的年龄相关[274]，还是疱疹样皮炎的主要自身抗原之一，因此是CD皮肤表现的关键标志物，在一些没有明显皮肤病变的患者中也可以检测到循环中的抗tTG3抗体[275, 276]。此外，通过经典ELISA检测到的抗tTG6抗体与麸质相关的神经系统疾病有关，表明可能存在独立于经典肠病的肠道外自身免疫反应[278]。

3.10 多发性硬化症的免疫测定

多发性硬化症（MS）是最常见的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，其特征是炎症性脱髓鞘、神经元损伤和神经退行性变。它是年轻人非创伤性残疾的最常见原因之一[279]。虽然传统上认为MS是一种T细胞介导的疾病，但B细胞清除疗法在MS患者中的显著成功突显了B细胞在MS病因和进展中的核心作用[280, 281]。诊断是通过评估一系列症状和体征、放射学发现（主要使用磁共振成像（MRI）以及实验室发现（如脑脊液中的特异性寡克隆带（OCBs）来进行的。根据2017年McDonald标准的修订，对于具有典型临床孤立综合征和临床或MRI证据显示疾病扩散的患者，脑脊液中特异性OCBs的存在被认为是MS的诊断依据[282, 283]。OCBs是MS的标志物，因为它们在高达95%的患者中被检测到，尽管它们并非MS所独有。在特定的临床背景下，脑脊液中OCBs的存在仍然是确认MS诊断的最可靠参数[284]。OCBs是高度浓缩的免疫球蛋白种类，主要是IgG，表明异常的鞘内免疫球蛋白产生与疾病活动增加和预后不良相关[285]。此外，在MS患者中检测到IgM OCBs与更严重的疾病进程相关[286]。正如名称所示，OCBs的检测是通过等电聚焦（IEF）然后进行免疫印迹或免疫固定来实现的，以显示IgG条带。IEF是一种根据蛋白质的等电点（pI——蛋白质不带净电荷的pH值）分离蛋白质或肽的电泳技术。在此过程中，将脑脊液样本和血清样本应用于琼脂糖凝胶，并在pH梯度下进行电泳，使蛋白质迁移到凝胶中pI与凝胶pH值相匹配的位置。如果使用免疫印迹，则将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上，然后用特异性抗体进行检测。另一种方法是免疫固定，在IEF后直接将特异性抗血清应用于凝胶，以沉淀免疫球蛋白，使其作为离散条带显现[287, 288]。尽管对潜在的病毒和自身抗原靶标进行了大量研究，但OCBs的确切抗原特异性仍不清楚。因此，除了MRI等成像技术外，当前的研究重点在于验证脑脊液和血液中的几种分子生物标志物，用于诊断和预后[285, 288]。在MS患者中检测到了针对多种候选自身抗原的抗体，包括少突胶质细胞和髓鞘来源的蛋白质，这表明B细胞对这些CNS抗原的耐受性不完全。然而，这些发现并未确凿证明对任何单一靶标的MS特异性抗体反应。例如，针对细胞内抗原髓鞘碱性蛋白（MBP）的抗体不仅在MS患者中被检测到，也在其他神经系统疾病患者和健康对照组中被检测到[289]。最近，EBV转录因子EBNA1与CNS抗原之间的分子相似性被发现，EBV与MS密切相关，并被认为是疾病发展的前提条件，包括anoctamin 2（ANO2）、胶质细胞粘附分子（GlialCAM）、Alpha-B结晶蛋白（CRYAB）和MBP[290-293]。在大多数情况下，EBNA1与这些CNS抗原之间存在高度的序列同源性。值得注意的是，这些同源区域聚集在EBNA1的特定片段内，位于第二个甘氨酸-精氨酸重复序列和C末端DNA结合域之间，针对这一区域的抗体反应性增强与MS密切相关[294]。此外，通过经典ELISA检测到的抗tTG6抗体与麸质相关的神经系统疾病有关，表明可能存在独立于经典肠病的肠道外自身免疫反应[278]。

3.10 多发性硬化症的免疫测定

多发性硬化症（MS）是中枢神经系统（CNS）最常见的自身免疫性疾病，其特征是炎症性脱髓鞘、神经元损伤和神经退行性变。它是年轻人非创伤性残疾的最常见原因之一[279]。尽管传统上认为MS是一种T细胞介导的疾病，但B细胞清除疗法在MS患者中的显著成功突显了B细胞在MS病因和进展中的核心作用[280, 281]。诊断是通过评估一系列症状和体征、放射学发现（主要使用磁共振成像（MRI）以及实验室发现（如脑脊液中特异性寡克隆带（OCBs）来进行的。实际上，根据2017年McDonald标准的修订，在具有典型临床孤立综合征和临床或MRI证据显示疾病扩散的患者中，脑脊液中特异性OCBs的存在被认为是MS的诊断依据[282, 283]。OCBs是MS的标志物，因为它们在高达95%的患者中被检测到，尽管它们并非MS所独有。在特定临床背景下脑脊液中OCBs的存在仍然是确认MS诊断的最可靠参数[284]。OCBs是高度浓缩的免疫球蛋白种类，主要是IgG，表明异常的鞘内免疫球蛋白产生与疾病活动增加和预后不良相关[285]。此外，在MS患者中检测到IgM OCBs与更严重的疾病进程相关[286]。如名称所示，OCBs的检测是通过等电聚焦（IEF）然后进行免疫印迹或免疫固定来实现的，以显示IgG条带。IEF是一种根据蛋白质的等电点（pI——蛋白质不带净电荷的pH值）分离蛋白质或肽的电泳技术。在此过程中，将脑脊液样本和血清样本应用于琼脂糖凝胶，并在pH梯度下进行电泳，使蛋白质迁移到凝胶中pI与凝胶pH值相匹配的位置。如果使用免疫印迹，则将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上，然后用特异性抗体进行检测。或者，在免疫固定中，IEF后直接将特异性抗血清应用于凝胶以沉淀免疫球蛋白，使其作为离散条带显现[287, 288]。尽管对潜在的病毒和自身抗原靶标进行了广泛研究，但OCBs的确切抗原特异性仍不清楚。因此，除了MRI等成像技术外，当前的研究重点在于验证脑脊液和血液中的几种分子生物标志物，用于诊断和预后[285, 288]。在MS患者中检测到了针对几种候选自身抗原的抗体，包括少突胶质细胞和髓鞘来源的蛋白质，这表明B细胞对这些CNS抗原的耐受性不完全。然而，这些发现并未确凿证明对任何单一靶标的MS特异性抗体反应。例如，针对细胞内抗原髓鞘碱性蛋白（MBP）的抗体不仅在MS患者中被检测到，也在其他神经系统疾病患者和健康对照组中被检测到[289]。最近，EBV转录因子EBNA1与CNS抗原之间的分子相似性被证实，EBV与MS密切相关，并被认为是疾病发展的前提条件，包括anoctamin 2（ANO2）、胶质细胞粘附分子（GlialCAM）、Alpha-B结晶蛋白（CRYAB）和MBP[290-293]。在大多数情况下，EBNA1与这些CNS抗原之间存在高度的序列同源性。值得注意的是，这些同源区域聚集在EBNA1的特定片段内，位于第二个甘氨酸-精氨酸重复序列和C末端DNA结合域之间，针对这一区域的抗体反应性增强与MS密切相关[294]。此外，抗PLP抗体与MS疾病严重程度增加相关，并能识别少突胶质细胞上的天然PLP，支持其在脱髓鞘中的直接致病作用[295]。对血清患者中髓鞘翻译后修饰成分的体液反应分析表明，β-葡萄糖吡喃糖基（Glc）与Asn残基（N-Glc）的连接对于MS患者群体中的抗体识别至关重要[296-298]。这促使开发了一种名为CSF114(Glc)的肽抗原探针，由于其独特的I′ β-转角结构，该探针最佳地暴露了Asn(Glc)表位，强调了这一PTM在检测MS特异性抗体中的重要性，使用ELISA和SPR技术[85, 299, 300]。Asn(Glc)修饰在人类中几乎不存在，但在原核生物的细胞表面蛋白（如粘附素）中可以找到，支持了外来病原体感染在MS病理生理学中的参与假设。实际上，发现来自不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）的粘附素蛋白的超高糖基化蛋白域HMW1优先被MS患者血清中的抗体识别[301, 302]。

3.11 中枢神经系统脱髓鞘综合征中的CBA

中枢神经系统（CNS）的抗体介导的疾病是免疫相关的神经性疾病，其特征是存在针对CNS中表达的特定抗原的神经自身抗体，并具有各种临床和MRI特征。特别是针对表面抗原的自身抗体被认为是致病的，因为它们容易受到循环抗体的影响[303, 304]。最近确定，水通道蛋白-4-IgG阳性的视神经脊髓炎谱系疾病（AQP4+ NMOSD）和髓鞘-少突胶质细胞糖蛋白相关疾病（MOGAD）是抗体介导的CNS脱髓鞘自身免疫性疾病，长期以来被认为属于MS的亚型，因为它们在临床和放射学上有重叠。然而，明确诊断是必要的，因为这些疾病具有不同的临床特征、治疗考虑和预后。这些疾病的生物标志物分别是针对水通道蛋白-4（AQP4）和水通道蛋白和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的自身抗体[305]。这些蛋白质的膜定位使得相应的抗体非常适合通过CBA进行检测。事实上，根据国际共识，CBA是检测这两种抗体的推荐方法[306, 307]。2005年，证明AQP4是NMOSD患者中发现的特异性抗体的抗原靶标[308]。AQP4是13种哺乳动物水通道蛋白之一，存在两种主要异构体，全长M1异构体和较短的M23异构体，两者在N末端有22个残基的不同。像所有水通道蛋白（AQPs）一样，AQP4也能在膜中形成四聚体，这些四聚体可以是同型四聚体（M1或M23），也可以是异型四聚体（同时包含M1和M23），每个单体都含有一个选择性通透水分子的孔道。M1亚型主要以单独的四聚体形式存在，而M23则组装成大型超分子聚集体，这些聚集体可以包含多达600个M23-AQP4四聚体，被称为正交粒子阵列（OAPs）[309, 310]。最初用于检测抗AQP4抗体的方法基于组织免疫印迹（TIIF），后来被免疫沉淀法和ELISA取代，后者虽然提高了灵敏度，但也偶尔会出现假阳性结果，这表明需要更特异性的检测方法。使用HEK293细胞（转染了编码人类AQP4的质粒）进行的CBA（细胞结合分析）具有最高的灵敏度和特异性。尽管最初仅限于专业实验室，但随着CBA商业试剂盒的出现，这种检测方法得到了广泛的应用[306, 311-313]。可能有多种因素会影响AQP4-IgG CBA的检测性能。研究表明，由于M23亚型能够形成OAPs，抗AQP4 IgG对M23的亲和力更高[314]。然而，关于在免疫检测中应使用哪种亚型作为抗原仍存在争议，因为M23不仅提高了灵敏度，还提升了信噪比[313, 315]。总体而言，不同AQP4-IgG CBA的性能可能会因为使用的是M1还是M23亚型，或者使用的是活细胞还是固定细胞而略有差异，但与其他检测方法相比，CBA的诊断准确性仍然更高，并且在不同抗体滴度下也能保持高度一致[305, 312]。不过，在许多情况下，ELISA仍然是最容易获得的检测方法，它比CBA更快、更易于使用，并且可以自动化。对于临床怀疑度高的患者或检测结果为低或中度的阳性患者，应考虑进一步使用CBA进行评估。一种新的自动化商业ELISA方法使用M23亚型，其性能表现与CBA相当[316, 317]。

MOG是一种跨膜糖蛋白，仅表达在中枢神经系统（CNS）少突胶质细胞的髓鞘表面。尽管其在髓鞘中的含量非常少（0.05%），但其生物学作用尚不清楚[318, 319]。MOG的N端区域形成了一个Ig-V结构，由两个反平行的β折叠片组成。此外，它在天冬酰胺31位点有一个N-连接糖基化位点[320, 321]。早期研究中，使用ELISA或免疫印迹检测时发现，多发性硬化症（MS）患者中抗MOG IgG的阳性率较高。然而，这些技术提供的结果不一致且不可重复，加之健康对照组中也有较高的阳性率，因此认为这些抗体的检测可能是由于识别了非天然MOG表位[50]。针对MOG IgG的CBA的发展对于将MOGAD（一种特定疾病）明确区分开来起到了关键作用。有研究表明，可能需要CBA是因为抗MOG抗体的双价结合能力，因为CBA中使用的完整MOG蛋白的细胞内部分会导致MOG的聚集，而MOG的细胞外部分的结构使得这种双价结合成为可能[323]。尽管如此，MOG分子在少突胶质细胞中的结构、数量或密度如何促进MOG IgG的结合仍不清楚[323]。据认为，MOG可以形成二聚体或四聚体，在放射免疫分析（RIA）中这些形式能更好地识别抗体[321, 324]。根据国际指南，应使用表达全长MOG（α1亚型）的活细胞进行检测，并使用IgG Fc或IgG1特异性二抗进行检测，以获得最佳效果[307]。然而，与AQP4-IgG不同，使用活细胞进行的CBA检测似乎比使用固定细胞的CBA更具优势。在一项国际多中心研究中，不同检测方法之间的一致性很高，阳性结果和阴性结果都很明确；而使用固定细胞的CBA时结果略差，这表明细胞的固定可能会掩盖一些重要的构象表位。对于低阳性水平的MOG-IgG需要谨慎处理，因为在1%到2%的对照组中也可能检测到阳性结果[305, 325]。

3.12 重症肌无力

重症肌无力（MG）是一种影响神经肌肉接头（NMJ）的自身免疫性疾病，其特征是肌肉无力和疲劳。该疾病的特异性自身抗体针对NMJ中的蛋白质。主要抗原是肌肉突触后膜上的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）。nAChR是一种配体门控离子通道，由五个亚单位组成，每个亚单位包含一个大的细胞外域（包含配体识别位点）和四个螺旋形跨膜域。自身抗体结合在nAChR亚单位的细胞外域上的表位，尤其是α1亚单位中的一个片段，这个片段被称为主要免疫原区域（MIR）。MIR由氨基酸66-76组成的环状结构，可能参与抗体的致病机制，因为它允许双价结合，从而导致nAChR分子的交联[326-328]。一些患者的自身抗体则针对肌肉特异性激酶（MuSK），这是一种参与诱导AChR聚集和维持NMJ的突触后分子；或者在某些情况下，针对脂蛋白相关蛋白4（LRP4），这也与AChR聚集有关。这些自身抗体被认为是疾病的生物标志物，对于将患者分类为不同的亚组至关重要[329, 330]。放射免疫沉淀法（RIPA）是检测AChR和MuSK抗体的金标准方法：其诊断灵敏度取决于MG的亚型，而在所有情况下特异性接近100%。ELISA被提出作为一种替代方法，旨在避免使用放射性试剂，但其诊断性能较差，且可能出现假阳性结果。活细胞CBA显示出更高的灵敏度和与RIPA相当的特异性，但它们仅限于专业实验室使用。然而，最近出现了用于检测MG特异性自身抗体的固定CBA方法，这些方法比活细胞CBA更易于常规诊断[331, 332]。AChR CBA的灵敏度提高是因为细胞同时转染了rapsyn蛋白，这促使AChR分子在培养细胞膜上聚集，从而能够检测到低亲和力的抗体，即使在那些通过放射免疫测定无法检测到抗体的患者中也是如此。对于MUSK抗体，更好的诊断性能是由于蛋白质的正确糖基化和折叠，使用IgG Fc二抗可以进一步提高检测效果[331]。虽然很少有大规模的前瞻性研究比较CBA、RIPA和ELISA在MG自身抗体检测中的效果，但普遍认为CBA的出现标志着MG诊断领域的重大突破[331-333]。

4 结论与未来展望

自身抗体是自身免疫性疾病中的关键分子标志物，能够提供关于疾病各个方面的信息。从临床角度来看，自身抗体在疾病的诊断、预后和治疗管理中起着至关重要的作用。实际上，自身抗体谱型分析对于区分具有相似临床表现的疾病至关重要。此外，某些自身抗体模式与疾病的严重程度或活动性相关，长期监测抗体滴度可以非侵入性地评估治疗反应和复发风险[17-20, 334]。不断发现新的自身抗原和自身抗体加深了我们对疾病发病机制的理解，揭示了每个患者或亚组特有的分子特征。鉴于AIDS患者表现出的异质性，针对患者个体的抗体谱型分析对于实现早期和精准诊断、改善疾病进程预测以及更精准的治疗干预至关重要，这支持了个性化医疗（PM）的原则。技术进步极大地扩展了自身抗体检测的诊断和研究潜力。选择哪种检测方法主要取决于目标抗原的性质。识别细胞内抗原或线性表位的自身抗体通常适合使用固相检测方法，如ELISA、CLIA或线免疫测定，因为这些抗原在固定在固相支持物后仍能保持足够的结构完整性和表位可及性。另一方面，针对膜蛋白或构象表位的自身抗体往往在其自身细胞环境之外会失去天然结构，因此需要使用特定技术，如免疫荧光（IF）或CBA，这些方法能够保持分子的3D折叠和翻译后修饰。在这种情况下，包括IIF、ELISA和免疫印迹在内的传统方法在临床实验室中仍然非常重要，因为它们具有较高的特异性和经过验证的可靠性。然而，它们的通量低且多重检测能力有限，限制了它们在大规模血清学分析中的应用。基于蛋白质组学的多重免疫测定方法（如抗原微阵列和展示技术）的出现彻底改变了这一领域，允许在单个样本中同时检测数百种自身抗体特异性[19, 63, 335, 336]。平面阵列最大化了多重检测能力，通常能在玻璃载玻片上检测到数千种独特的抗原，使其成为新抗原发现的理想平台。相比之下，基于珠子的阵列将抗原固定在彩色编码的微球上，通过流式细胞术读取，具有更高的样本通量，非常适合生物标志物的验证和确认。根据抗原类型，我们可以将其分为两大类：蛋白质阵列和肽阵列。蛋白质阵列展示全长蛋白质，通常需要通过细胞表达系统或无细胞系统（如核酸编程蛋白质阵列）进行生产，适用于检测针对构象或不连续表位的自身抗体。肽阵列使用较短的线性片段（通常12-20个氨基酸），非常适合精细映射线性表位，并且易于结合蛋白质翻译后修饰（如 citrullination）。下一代展示技术，如噬菌体免疫沉淀测序（PhIP-Seq）在噬菌体上展示肽，以及快速细胞外抗原分析（REAP）在酵母上展示蛋白质，利用下一代测序技术快速分析整个蛋白质组中的自身抗体反应[336-341]。总之，自身抗体检测领域正从简单的单参数检测方法迅速向多重和高通量平台转变。这些进步不仅仅是技术上的，它们代表了自身免疫疾病诊断和管理方式的根本性转变。通过分子水平理解抗体特异性，考虑结构构象、蛋白质翻译后修饰（PTMs）和表位多样性，将有助于进一步优化个性化医疗（PM），使临床医生能够根据每个患者的独特免疫特征制定个性化的治疗策略。随着新型自身抗原的持续发现和多重免疫测定技术的改进，诊断领域将继续发生变化，将血清学复杂性转化为可操作的临床见解。

致谢

A. M. P. 感谢欧洲大学联盟EUniWell在2025-2026年度授予她的Peptides4 Wellness Champion称号，这支持了她推广肽作为体外诊断领域创新和可靠分子的使命。开放获取出版由佛罗伦萨大学提供支持，这是Wiley - CRUI-CARE协议的一部分。资金支持

本工作得到了S. B.的博士奖学金资助，该奖学金由欧盟下一代计划（Next Generation EU）和意大利国家恢复与韧性计划（PNRR）M4 C2项目（PNRR MUR M4 C2 Inv. 1.5）提供，项目编号为ECS00000017 Tuscany-Health Ecosystem-Spoke 6（CUP B63C2200068007），以及Tuscany-Health Ecosystem（Grant ECS_00000017）的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

传记

Silvia Bracci于2023年在佛罗伦萨大学获得化学科学硕士学位，并因她的硕士论文（关于通过天然化学偶联优化酯胰岛素的全合成）而获得“Alberto Bardazzi”奖。她目前是佛罗伦萨大学化学科学专业的博士三年级学生（属于Tuscany-Health Ecosystem的PNRR项目），在Florenza大学跨部门肽与蛋白质化学及生物学研究单元（PeptLab）工作，在Anna Maria Papini教授的指导下从事基于肽的诊断方法的研发工作，以识别免疫介导疾病的生物标志物。Feliciana Real-Fernandez是意大利国家研究委员会（ICCOM-CNR）有机金属化合物化学研究所的研究员，她的研究兴趣包括设计、合成和生物表征生物活性分子，用于研究肽/蛋白质-抗体相互作用。她的其他研究活动包括量化生物流体中的内分泌干扰化学物质以及使用酶进行解聚过程。她是45篇科学论文和1项专利的合著者。Federico Pratesi是比萨大学的意大利免疫学家，目前担任普通病理学副教授。他于1997年获得生物学学位，2001年在巴黎第七大学（法国）进行研究后，完成了临床免疫过敏学的专业学习。2009年，他获得了医学病理生理学和药理学博士学位，之后继续在比萨大学开展研究工作。2018年，他曾作为访问学者在伦敦玛丽女王大学（英国）进行研究。他的主要研究兴趣包括自身抗体精细特异性的分析、自身免疫疾病中中性粒细胞胞外陷阱的特征研究，以及基质细胞与免疫细胞之间的相互作用。他还参与了托斯卡纳生物标志物（Toscana Biomarkers）的开发和科学活动，该公司是比萨大学和佛罗伦萨大学的衍生机构，专注于转化研究和生物标志物的开发。他是5项专利和89篇同行评审科学论文的合著者。弗朗切斯卡·努蒂（Francesca Nuti）于2001年在佛罗伦萨大学获得化学学士学位，并于2005年获得化学博士学位。目前，她是佛罗伦萨大学的技术专家，在糖肽合成、翻译后修饰以及免疫介导疾病的生物标志物开发方面拥有丰富的经验。她的研究重点在于诊断肽、自身免疫性疾病和内分泌干扰物。自2020年起，她参与了欧盟项目“母婴二元组：减少牛奶中的内分泌干扰化学物质对健康生活的影响”。她发表了多篇同行评审的论文，并共同发明了一项国际专利。

保罗·罗韦罗（Paolo Rovero）是佛罗伦萨大学的药物化学教授。他的研究兴趣涉及具有药用和化妆品价值的肽的设计、合成及其生物学特性研究。他的职业生涯始于一家意大利领先的制药公司（Menarini，佛罗伦萨，1986-1991年），随后在多个学术机构继续从事研究（意大利国家研究委员会，比萨，1991-1998年；萨莱诺大学，1998-2003年；佛罗伦萨大学，2003年至今）。2003年，他创立了佛罗伦萨大学的首家学术衍生公司EspiKem Srl，该公司目前致力于开发具有化妆品价值的肽活性成分。2007年，他是托斯卡纳生物标志物公司（Toscana Biomarkers Srl）的学术创始人之一，该公司在基于肽的诊断领域开展研究。他是290多篇科学论文和25项具有药物相关性的专利的合著者，并担任《肽科学杂志》（Journal of Peptide Science）的主编。

安娜·玛丽亚·帕皮尼（Anna Maria Papini）是佛罗伦萨大学的生物有机化学教授兼PeptLab实验室主任。作为法国“Chaire d’Excellence Senior”项目的获奖者（2009–2015年），她在CY塞日巴黎大学（CY Cergy Paris University）建立了PeptLab平台。她与本文的其他合著者共同创立了托斯卡纳生物标志物公司，并因此获得了2009年的Frost & Sullivan奖（在自身免疫诊断领域）。她的荣誉包括莱奥尼达斯·泽拉斯奖（Leonidas Zervas Award，2008年）、丽塔·莱维·蒙塔尔奇尼奖（Rita Levi Montalcini Award，2019年）和巴里·科恩奖（Barry Cohen Award，2024年），同时还获得了韩国（2019年）和波兰（2025年）化学学会颁发的奖项。

**数据可用性声明：**
由于本研究过程中未生成或分析任何数据集，因此不适用数据共享的规定。