通过将表面增强拉曼纳米探针与基于纸张的介电电润湿数字微流控技术相结合，实现对人类心血管疾病生物标志物的同时多重检测

《Microchemical Journal》：Simultaneous multiplex detection of human cardiovascular disease biomarkers by integrating surface-enhanced Raman nanoprobes with paper-based electrowetting-on-dielectric digital microfluidics

　　陈安治|王志贤|詹佩辰|洪建治|曹来宽|王绍春
国立中兴大学化学与生物化学系及纳米生物检测中心， chiayi 621301，台湾

**摘要**
心血管疾病（CVD），特别是心肌梗死（MI），是全球主要的死亡原因之一，因此迫切需要快速的多重检测方法用于临床诊断，以便及时管理这种状况。包括心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶-MB（CKMB）和肌红蛋白（Myo）在内的生物标志物对于确认典型的MI症状至关重要。在这项研究中，采用了一种结合表面增强拉曼散射（SERS）纳米探针和数字微流控技术的悬浮阵列方法，用于同时多重检测这三种CVD生物标志物cTnI、CKMB和Myo。SERS纳米探针利用三种拉曼报告分子——龙胆紫、四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯和甲酚紫，构建了一组超灵敏的SERS纳米探针，称为纳米聚集体嵌入珠子（NAEB）。三对NAEB与特定的适配体配对，分别与磁性纳米粒子结合，以识别这三种生物标志物并形成夹心纳米复合物。基于纸基电润湿-on-介电（pEWOD）平台的数字微流控技术用于高效样品预处理和收集纳米复合物以进行拉曼光谱测量。检测限分别为Myo 1.2 fM（23 fg/mL）、CKMB 12 fM（0.52 pg/mL）和cTnI 15 fM（0.40 pg/mL），总分析时间仅需20分钟。该方法成功应用于三种CVD生物标志物的同时多重检测，在PBS缓冲液和50倍稀释的血清样本中均获得了良好的回收率（90%–110%），证明了这种多重检测方法在心血管疾病诊断中的有效性。

**引言**
心血管疾病（CVD）是一类心脏和血管的疾病，被认为是全球主要的死亡原因[1][2][3]。根据世界卫生组织的数据，2022年全球约32%的死亡病例由CVD引起；其中85%归因于心肌梗死（MI）或所谓的心脏病发作加中风[4]，这些通常是急性事件。MI是最具生命威胁性的CVD形式之一，其原因是冠状动脉突然阻塞[5]，导致心肌组织缺血和随后的坏死。早期诊断和治疗MI是减少发病率和改善患者预后的关键。因此，已经提出了两种快速早期排除或确认急性MI的算法[6]，建议从抽血到获得检测结果的时间应少于60分钟[7]。目前的MI诊断方法包括临床检查、心电图（ECG）、血液样本中生物标志物的分析以及成像技术[8]。然而，大约25%的MI患者在早期阶段没有典型的临床症状[9]，约50%的MI患者在急诊科就诊时心电图显示正常或无法确诊[9][10][11]。尽管许多成像技术可以检测到心肌壁运动异常或存活心肌的丧失，但无法排除小范围MI[8]。此外，成像技术通常成本较高且耗时较长。

对于疑似MI患者的早期诊断和重症监护，快速准确的诊断和治疗至关重要。常用的MI检测生物标志物包括心肌肌钙蛋白（cTnI）、肌酸激酶MB（CKMB）和肌红蛋白（Myo）[1][11][12]。对于MI，心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）被认为比CKMB和Myo更敏感和特异[13]。虽然CKMB的特异性低于cTnI，但在急性MI后其释放动力学对于诊断再梗死非常重要[14][15]。另一方面，尽管Myo的特异性低于cTnI和CKMB，但由于其分子量低，它是最早释放到血液中的生物标志物[11][15]。临床上，Myo常与其他CVD生物标志物一起使用以提高诊断的准确性和可靠性。因此，医院中常采用同时多重检测这三种CVD生物标志物的方法来评估有症状患者的急性MI[16]。

尽管医院中常用的CVD生物标志物检测设备主要基于电化学发光和化学发光原理，但这些设备大多为复杂的高成本自动化仪器，需要昂贵的试剂和耗材，维护费用较高[1][16]，限制了其作为即时检测（POCT）技术的应用。也有商用的手持式CVD生物标志物检测设备[1][16]，但这些设备均为单通道设计[1][16]，限制了其通量。此外，这些设备的灵敏度不足以在早期阶段定量cTn水平以排除MI，且一次性卡盒的成本较高[16]。因此，开发更简单、更快、更灵敏且更具成本效益的同时多重检测平台和方法至关重要。

目前有两种主要的多重检测方法：基于位置的平面阵列检测和条形码珠子悬浮阵列检测[17][18]。虽然平面阵列方法传统上较为流行，但悬浮阵列方法在使用的阵列数量、更快的结合动力学、更小的样品体积以及更高的制造重复性方面具有优势[19][20]。表面增强拉曼散射（SERS）检测技术因其能够检测单个分子而受到广泛关注[21][22]。此外，SERS技术因SERS光谱的窄带宽能够提供大量可区分的代码而适用于多重检测[23]。最近，微流控技术作为POCT技术用于心脏生物标志物的检测受到了关注[1][23]，特别是数字微流控技术，通过精确控制电驱动平面上的液滴，可以实现皮升到微升大小的液滴的分配、移动、合并和分割[1][24]。因此，将SERS与数字微流控技术结合用于生物分析，提供了更高的多重检测程度、更小的样品体积、更快的检测时间和更低的成本。

本文中，我们将高灵敏度的纳米聚集体嵌入珠子（NAEB）作为条形码纳米探针与数字微流控技术结合，展示了这些SERS纳米探针能够同时多重检测三种CVD生物标志物cTnI、CKMB和Myo。NAEB是通过金纳米粒子（AuNP）的自组装产生的“热点”来实现的，这些“热点”增强了拉曼强度[25]。NAEB中的“热点”效应提供了强烈的SERS信号，能够在单纳米粒子和单细胞水平上进行检测[25][26][27][28][29]。我们采用的数字微流控技术基于我们最近开发的纸基电润湿-on-介电（pEWOD）平台[30][31]，该平台具有成本效益、简化制造过程、减少试剂消耗和便携性等优点，为CVD生物标志物的多重检测提供了潜在的POCT解决方案。图1展示了这一检测策略的示意图。在这种检测策略中，pEWOD与生物共轭磁性纳米粒子（MNP）的结合对于样品预处理和目标物种的富集非常有用，从而提高了样品的清洁度和回收率[31]。通过外部磁铁固定MNP并移除上清液滴，pEWOD平台可以以高度一致的方式快速高效地进行洗涤。这大大降低了背景噪声，这对于在单个液滴中区分多个拉曼散射特征以实现多重检测至关重要。（见表1。）

经济实惠的一次性pEWOD卡片增强了数字微流控平台上的珠子基多重免疫测定，尤其是在使用磁性或传感珠子组合时。每次运行的原始表面防止了可重复使用系统中常见的珠子交叉污染，而新鲜的介电层和疏水层确保了液滴的稳定驱动、可靠的珠子悬浮以及高效的磁捕获和洗涤。这些改进减少了非特异性结合，抑制了背景信号，并提高了灵敏度和重复性。一次性格式还简化了生物安全问题，并允许针对特定检测进行定制或预加载试剂，使其非常适合用于稳健的高性能即时诊断。

此外，由于核酸适配体在成本效益、稳定性和生产重复性方面的优势[32][33]，正成为抗体在诊断和生物传感中的有前途的替代品，本研究还从文献中选择了针对Myo、CKMB和cTnI的适配体对，开发了一种成本效益高且稳健的多重夹心适配体传感器[34][35][36][37]。Myo适配体最初由Wang等人通过SELEX方法鉴定[36]，随后由Li等人截短成夹心适配体对[35]。cTnI的夹心适配体是根据Jo等人的研究结果选择的[34]。CKMB的夹心适配体是根据Zhang等人的研究结果，通过SELEX筛选和后续实验验证选定的[37]。总的来说，这种新型集成技术能够在20分钟内同时多重检测三种CVD生物标志物cTnI、CKMB和Myo，检测限达到飞摩尔浓度水平。

**材料与试剂**
四氯金酸氢盐（三水合物，99.99%）和氢氧化钠购自Showa公司。柠檬酸钠（三碱式脱水物，99%）和Tris购自J.T.Baker公司。硝酸和氢氧化铵（33%）购自PanReac AppliChem公司。乙醇（99%）购自HY Biocare Chemical Enterprise Co.。四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯（TRITC）、2- morpholinoethanesulfonic acid（MES）、盐酸（37%）、四乙基正硅酸盐（TEOS，99.0%）和人血清也用于实验。

**NAEB的制备与表征**
为了制备NAEB中的前体成分AuNPs，首先合成了柠檬酸包覆的AuNPs。然后分别使用三种双功能拉曼报告分子——龙胆紫（GV）、四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯（TRITC）和甲酚紫（CV）诱导AuNPs聚集，随后在纳米聚集体周围形成二氧化硅壳，生成三种类型的NAEB（GV-NAEB、TRITC-NAEB、CV-NAEB）。AuNPs和合成NAEB的峰值吸收波长和大小分别进行了测量。

**结论**
我们成功展示了一种同时多重检测三种CVD生物标志物Myo、CKMB和cTnI的方法，该方法使用三种类型的拉曼报告分子编码的适配体共轭NAEB与相应的适配体共轭MNPs结合，在pEWOD平台上进行样品预处理。pEWOD平台显著提高了NAEBs、MNPs和目标分析物形成的纳米复合物的收集效率，同时缩短了回收时间。

**作者贡献声明**
陈安治：研究、数据分析。王志贤：撰写——初稿、可视化、方法学、数据分析。詹佩辰：可视化、研究。洪建治：资源提供。曹来宽：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。王绍春：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取、概念化。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了台湾国家科学技术委员会（Grant numbers MOST 111-2113-M-194-006、MOST 111-2113-M-194-002、NSTC 112-2113-M-194-005、NSTC 112-2113-M-194-009）的资助。同时感谢国立中兴大学仪器中心提供的TEM支持。