《Microchemical Journal》：Development of a triplex Chip digital PCR assay for the absolute quantification of trace fungal nucleic acids in complex agricultural matrices
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沈天池|李进|王琼|郭子宁|李光国|苏晓峰|高海峰|王迪中国国家计量研究院先进测量科学中心，北京100029摘要在环境和生物样本中，痕量核酸的准确定量常常受到基质衍生抑制剂的干扰。在这项研究中，我们开发了一种三重芯片数字PCR（cdPCR）检测方法，用于在富含抑制剂的土壤和植物根
沈天池|李进|王琼|郭子宁|李光国|苏晓峰|高海峰|王迪
中国国家计量研究院先进测量科学中心，北京100029
摘要
在环境和生物样本中，痕量核酸的准确定量常常受到基质衍生抑制剂的干扰。在这项研究中，我们开发了一种三重芯片数字PCR（cdPCR）检测方法，用于在富含抑制剂的土壤和植物根系基质中同时绝对定量两种真菌目标（Fusarium pseudograminearum 和 Fusarium graminearum）以及小麦（Triticum aestivum）的宿主参考基因（TUBβ）。系统评估了cdPCR方法的分析性能，并将其与定量实时PCR（qPCR）进行了比较。cdPCR方法表现出良好的线性，检测限约为2.5拷贝/μL，与qPCR相当或更优。关键的是，在含有腐殖质的高度抑制性根际土壤基质中应用时，cdPCR方法对抑制剂的耐受性更强，比qPCR多检测出21%的阳性样本。通过Bland-Altman分析的方法学比较显示，qPCR在土壤基质中系统性地低估了目标浓度，这可能是由于基质引起的扩增抑制；而cdPCR通过样本分离实现了稳健的绝对定量。该方法采用宿主基因标准化策略来校正采样变异和提取回收率，为复杂农业生态系统中痕量生物污染物的监测提供了高精度的微分析工具。
引言
在复杂的环境和生物样本中精确定量痕量核酸仍然是分析化学和分子诊断领域的一个主要挑战[1]。由于存在腐殖酸、富里酸和酸性多糖等抑制性化合物，土壤和植物根系组织特别难以分析[2],[3]。这些物质可以与DNA聚合酶相互作用或竞争性地结合镁离子，而镁离子是扩增检测方法中酶促反应所必需的[4]。因此，传统的定量实时PCR（qPCR）由于依赖于扩增效率和外部校准曲线，在应用于这些具有挑战性的基质时，通常会表现出灵敏度降低、严重的定量偏差和较差的实验室间重复性[5]。
数字PCR通过消除对标准校准曲线的依赖，并利用泊松统计原理提供绝对定量，从而彻底改变了核酸定量方法。与依赖扩增效率的qPCR不同，数字PCR将样本物理分割成数千个独立的微反应，有效隔离了抑制性物质，允许直接计数阳性终点扩增事件。这一原理确保了更高的稳健性和精度，尤其是在抑制剂普遍存在的农业基质中[6]。此外，数字PCR提倡使用拷贝数浓度作为主要测量单位，而不是质量浓度。由于PCR检测针对特定的遗传序列，“拷贝数”代表了分析物的内在计量单位；相比之下，基于质量的定量（例如ng/μL）往往因基因组大小、质粒纯度或非目标DNA背景的变化而产生不确定性[7]。因此，数字PCR迅速成为计量值分配的主要参考方法，在实验室间比较[8],[9]、转基因生物定量[10]和临床诊断[11],[12]等具有挑战性的应用中得到了广泛采用。
尽管有这些优势，但在富含抑制剂的农业基质中同时使用多重数字PCR进行痕量目标的绝对定量仍然较少探索。在这项研究中，我们开发了一种三重芯片数字PCR（cdPCR）检测方法，以主要镰刀菌冠腐病病原体（Fusarium pseudograminearum 和 Fusarium graminearum）和小麦宿主参考基因（tubulin beta，即 TUBβ）作为生物模型系统。我们系统评估了其分析性能，包括95%检测限（LoD95%）、动态范围和精度。与qPCR进行了全面的方法学比较，以突出微流控分离在克服根际土壤和根系基质效应方面的分析优势。这项工作展示了多重cdPCR作为在复杂固体基质中绝对定量痕量核酸的稳健且精确的分析工具的潜力。
章节片段
样本制备
将真菌参考菌株（F. pseudograminearum 和 F. graminearum）培养在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，以提供标准对照DNA。为了评估基质效应，从中国新疆的农田中收集了小麦根系组织和根际土壤样本。这些样本被选为含有高水平多糖和腐殖质的代表性复杂基质。使用CTAB方法提取土壤的基因组DNA和商业真菌DNA
方法开发和特异性分析
开发了一种三重cdPCR检测方法，用于特异性和同时检测F. pseudograminearum的TEF1α基因、F. graminearum的Tri基因以及Triticum aestivum的TUBβ基因。相应的扩增产物和引物/探针结合位点见补充图S1。与18种非目标真菌没有交叉反应，证实了cdPCR检测方法的高分析特异性（见图2）。
在30至1×10^4拷贝/μL的动态范围内，表现出线性
结论
本研究成功建立并验证了一种新的三重cdPCR方法，用于在复杂且高度抑制性的土壤和植物基质中绝对定量痕量病原体DNA。通过利用微流控样本分离和泊松统计原理，所开发的检测方法在分析灵敏度、精度和对基质衍生抑制剂的耐受性方面优于传统的qPCR。该方法有效解决了基质干扰问题
CRediT作者贡献声明
沈天池：撰写——原始草稿，方法学设计。李进：研究，资金获取。王琼：验证。郭子宁：验证。李光国：研究，资金获取。苏晓峰：数据管理。高海峰：撰写——审阅与编辑，项目管理。王迪：撰写——审阅与编辑，方法学设计。
资助
本研究得到了新疆维吾尔自治区科学技术援助项目（2024E02009）和新疆维吾尔自治区重大研发项目（2023A02009）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
