综述：利用内源性ADAR进行遗传性视网膜疾病致病性变异的RNA编辑：现状与未来展望

《Molecular Aspects of Medicine》：RNA editing of pathogenic variants causing inherited retinal diseases using endogenous ADAR-current and future perspectives

　　

遗传性视网膜疾病（IRDs）是一组临床和遗传异质性的疾病，影响全球数百万人，目前针对大多数患者的治疗选择有限。近年来，RNA编辑技术——特别是由作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）介导的腺苷到肌苷（A-to-I）编辑——为在RNA水平上纠正致病性变异提供了一种极具前景的方法，且无需改变基因组。本综述全面概述了ADAR介导的RNA编辑的分子基础、其在视网膜组织中的自然发生情况，以及利用内源性ADAR酶进行位点特异性RNA编辑（SDRE）的多种策略。文章讨论了引导RNA（gRNAs）的设计原则和优化策略，包括线性、环状和化学修饰形式，如LEAPER、RESTORE、CLUSTER、CadRNAs和AIMers。此外，还探讨了用于引导筛选的高通量筛选系统、评估RNA编辑效率的细胞模型，以及目前针对IRD致病性变异的体外和体内方法。最后，文章强调了基于内源性和外源性ADAR的RNA编辑的转化潜力，强调其作为IRDs及其他疾病精准医疗策略的相关性。

1. 遗传性视网膜疾病（IRDs）

该章节详细阐述了IRDs的流行病学、遗传学、临床多样性以及与RNA编辑治疗的关联。流行病学数据显示，IRDs是全球视力损伤的重要原因，在不同人群中的患病率存在显著差异，平均约为1/3450，但在某些近亲结婚率高的群体中，这一比例可高达1/1043至1/1249。遗传学方面，IRDs具有极高的遗传异质性，涉及超过350个基因，遗传模式包括常染色体隐性（AR，50-60%）、常染色体显性（AD，30-40%）、X连锁（XL，5-15%）和线粒体遗传。最常见的致病基因包括ABCA4、USH2A、EYS、RPGR、CRB1、PRPH2和RHO。由于基因数量庞大且每个基因的变异类型多样，导致健康携带者频率极高（约1/2.7），这极大地增加了开发针对特定变异甚至特定基因疗法的复杂性。临床上，IRDs可分为静止性疾病（如全色盲ACHM、蓝锥单色视BCM、先天性静止性夜盲CSNB）和进行性变性病（如视网膜色素变性RP、视锥视杆营养不良CRD、Leber先天性黑蒙LCA）。RP是最常见的表型，约占IRD病例的35%。此外，约10%的IRD病例伴有综合征表现，如Usher综合征、Bardet-Biedl综合征（BBS）和Alstr?m综合征。目前，绝大多数IRD缺乏有效疗法，唯一获批的AAV基因增补疗法Luxturna仅适用于RPE65双等位基因变异患者，且大基因难以装入AAV载体。因此，本章强调了开发新型疗法（如RNA编辑）的必要性。

2. 作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADARs）

本章深入探讨了ADAR蛋白家族的结构、功能、底物偏好及在疾病中的作用。ADAR酶在进化上保守，包含两个主要功能域：双链RNA结合域（dsRBD）和催化C端脱氨酶域（ADAR_DD）。哺乳动物中ADAR家族有三个成员：ADAR1（又称ADAR）、ADAR2（ADARB1）和催化失活的ADAR3（ADARB2）。ADAR1有两个主要亚型：受干扰素诱导的p150（主要在核质穿梭）和组成性表达的p110（主要在核内）；ADAR2主要定位于细胞核。ADAR1和ADAR2在底物偏好上存在差异：ADAR1倾向于长互补双链RNA，而ADAR2更倾向于带有凸起和错配的双链区域。机制研究表明，ADAR通过“碱基翻转”机制将目标腺苷翻转至活性位点进行水解反应，这一过程需要肌醇六磷酸（IP6）的辅助。在视网膜中，基于蛋白质图谱数据库，ADAR1在视网膜中普遍表达，而ADAR2主要在视网膜神经节细胞中高表达。小鼠模型研究显示，ADAR1敲除会导致胚胎致死，这与MDA5/MAVS通路激活有关；而ADAR2敲除则会导致癫痫和早逝，证明了其在中枢神经系统中的关键作用。人类疾病方面，ADAR1的功能丧失性变异可导致Aicardi-Goutières综合征（AGS），而ADAR2的功能异常则与神经退行性疾病及代谢紊乱相关。

3. 体内内源性天然RNA编辑，重点关注视网膜

本章构建了人体组织中A-to-I RNA编辑的图谱，并重点分析了视网膜中的编辑特征。通过分析转录组与基因组序列，研究发现虽然RNA编辑广泛存在，但只有少数位点在物种间是保守的，这些保守位点通常具有较高的编辑水平和表达水平，表明其功能重要性。在视网膜中，最常被编辑的转录本包括谷氨酸受体基因（GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRIK1、GRIK2）和5-羟色胺受体基因（HTR2C），这些基因在视网膜色素上皮（RPE）、神经节细胞和水平细胞中均有表达。这些结果证实了ADARs在视网膜中具有较高的活性，为利用内源性ADAR纠正疾病致病变异提供了理论基础。值得注意的是，天然的RNA编辑通常发生在顺式（同一RNA分子内），而治疗性策略通常需要反式（引入外源gRNA）配置，这在效率上相对较低，是需要克服的挑战。

4. 利用非工程化内源性ADAR进行位点特异性RNA编辑（SDRE）

这是综述的核心部分，详细介绍了利用内源性ADAR进行靶向编辑的各种gRNA设计策略及其演变。SDRE的优势在于仅需引入短RNA分子，免疫原性低，且避免了外源ADAR过表达带来的风险。然而，其主要挑战在于如何实现治疗水平的靶向编辑。文章列举了多种优化策略：

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  LEAPER：利用长链反义RNA（51-211 nt）招募内源性ADAR，虽能达到较高编辑效率（高达80%），但较长的gRNA可能导致旁观者编辑（bystander editing）增加。
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  RESTORE：结合了GluR2发夹结构的招募域和短反义序列（18-40 nt），通过化学修饰（如2'-O-甲基、硫代磷酸酯键）提高稳定性，在某些细胞系中编辑效率可达85%，且IFNα处理可进一步提高效率。
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  CLUSTER：通过在反义序列中引入多个短的招募序列（RSs），优化了gRNA设计，提高了特异性，减少了旁观者编辑，并在体内模型中显示出治疗效果。
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  CadRNAs/LEAPER 2.0：利用TORNADO系统在体外或体内产生环状gRNA。环状结构显著提高了gRNA的稳定性，延长了编辑持续时间。通过引入G>U摆动碱基配对或去除尿嘧啶，有效抑制了旁观者编辑，在MPS I（Hurler综合征）小鼠模型中成功恢复了IDUA酶活性。
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  AIMers：短链（30 nt）化学修饰的gRNA，采用立体纯骨架（如PS和PN修饰）和糖基修饰（如2'-脱氧氟），能够高效招募内源性ADAR1，在非人灵长类动物中显示出持久的编辑效果和良好的安全性，目前已进入临床试验阶段（WVE-006）。

5. 用于gRNA筛选的系统

鉴于目前无法高效预测gRNA的有效性，本章提出了两种高通量筛选系统：酵母系统（可同时筛选数百万个gRNA）和人细胞系系统（可并行筛选数千个gRNA）。尽管酿酒酵母缺乏内源性ADAR，但通过异源表达ADAR，它已成为解析ADAR底物识别和RNA编辑结构要求的强大替代系统，有助于快速识别出针对特定靶标最有效的gRNA。

6. 评估RNA编辑效率的细胞模型

为了在临床前验证RNA编辑的效果，研究者建立了多种细胞模型。这些模型包括携带特定IRD致病变异（如RPE65、USH2A、ABCA4等基因变异）的患者来源的成纤维细胞、永生化淋巴细胞系，以及利用CRISPR/Cas9技术在细胞系中引入特定变异的等基因模型。通过这些模型，研究人员能够量化不同gRNA设计对特定变异位点的编辑效率，并评估其对mRNA剪接、蛋白功能恢复的影响，为后续的体内实验和临床转化提供关键数据支持。

7. 针对IRD致病变异的体外和体内RNA编辑方法

本章总结了利用上述SDRE策略在IRD治疗中的具体应用进展。体外研究显示，通过优化gRNA，已成功在含有RHO p.P23H、RPE65 p.R91W、ABCA4 p.G1961E等IRD常见变异的细胞模型中实现高效的RNA修复和功能挽救。在体内方面，研究采用了多种递送载体，包括腺相关病毒（AAV）和脂质纳米颗粒（LNP），在视网膜变性小鼠模型（如Rho^P23H/WT、Rpe65^rd12）中实现了视网膜组织的靶向编辑。结果显示，治疗后小鼠的视网膜电图（ERG）反应得到显著改善，光感受器细胞存活率提高，证实了基于ADAR的RNA编辑作为一种精准医疗手段在治疗IRDs方面的巨大转化潜力。