《Molecular and Biochemical Parasitology》：Anti-inflammatory effects of valdecoxib found in Clonorchis sinensis excretory/secretory products in an Ankylosing Spondylitis
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余正莉（Yu Jeong Lee）|金文珠（Moon-Ju Kim）|尹成民（Sung Min Yu）|赵俊（Jun Cho）|沈承哲（Seung Cheol Shim）|元正元（Eun Jeong Won）|金泰钟（Tae-Jong Kim）韩国全南国立大学生物医学科学研究生项
余正莉（Yu Jeong Lee）|金文珠（Moon-Ju Kim）|尹成民（Sung Min Yu）|赵俊（Jun Cho）|沈承哲（Seung Cheol Shim）|元正元（Eun Jeong Won）|金泰钟（Tae-Jong Kim）
韩国全南国立大学生物医学科学研究生项目（BMSGP），华顺市，58128
摘要
华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）是一种肝吸虫，能够分泌免疫调节分子，这些分子可能抑制类风湿性脊柱炎（AS）等自身免疫性疾病中的炎症。然而，具体参与其中的生物活性化合物尚未被完全鉴定。我们对华支睾吸虫的分泌蛋白（CS-ESP）进行了基于液相色谱-质谱（LC-MS/MS）的代谢组学分析，并检测到一种与选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂瓦德考昔（valdecoxib）相同的化合物，作为潜在的生物活性分子。随后，我们评估了瓦德考昔在曲德兰（curdlan）诱导的AS小鼠模型中的治疗效果。通过临床关节炎评分、爪部厚度和关节组织病理学进行了评估。使用MTS检测法对RAW 264.7细胞以及从AS患者体内获取的外周血单核细胞（PBMCs）进行了体外细胞毒性测试。结果显示，瓦德考昔在浓度达到15 μg/ml时对RAW细胞无显著毒性，在浓度达到200 μg/ml时对AS PBMCs也无显著毒性。在SKG小鼠模型中，瓦德考昔治疗有效延缓了关节炎的发展，并显著降低了其严重程度（疾病对照组与瓦德考昔组相比，平均±标准误：5.28 ± 1.00 vs 3.84 ± 1.08，p < 0.05）。组织学评估显示，接受瓦德考昔治疗的小鼠关节炎症状有所减轻（踝关节组织病理学评分，平均±标准差：阴性对照组 vs 疾病对照组：0.50 ± 0.45 vs 9.33 ± 4.55，p < 0.001；疾病对照组 vs 瓦德考昔组：9.33 ± 4.55 vs 4.75 ± 0.76，p < 0.05）。本研究表明，在华支睾吸虫分泌蛋白中检测到的与瓦德考昔相同的化合物在AS模型中表现出强烈的抗炎和关节保护作用，强调了进一步研究其化学身份和免疫调节机制的必要性。
引言
寄生虫进化出了复杂的策略来调节宿主的免疫反应，通常会减弱炎症以在宿主体内长期存活。来自寄生虫的分子——包括蛋白质、糖类和小型代谢物——作为自身免疫性和炎症性疾病的潜在治疗剂而受到越来越多的关注[17]、[19]。华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）主要因其对肝胆系统的病理影响而闻名[8]。然而，最近的研究强调了华支睾吸虫产物除了致病作用外还具备免疫调节特性[9]。在我们之前的研究中，我们将华支睾吸虫的粗蛋白（CSp）和分泌蛋白（ESP）应用于类风湿性脊柱炎（AS）的小鼠模型中，这是一种慢性免疫介导的炎症性关节炎。CSp和ESP的治疗均显著减轻了AS模型中的炎症，表明华支睾吸虫含有与自身免疫性疾病相关的免疫调节活性成分[13]、[9]。
尽管这些发现展示了华支睾吸虫产物的抗炎潜力，但具体负责这些效果的分子尚未确定。为了进一步研究活性成分，我们使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对CSp和ESP组分进行了非靶向代谢组学分析。在检测到的代谢物中，有一种特别显著的化合物与瓦德考昔相匹配，瓦德考昔是一种已知能选择性抑制环氧化酶-2（COX-2）的合成小分子。鉴于其明确的抗炎机制和药理学历史，在华支睾吸虫分泌蛋白中检测到类似瓦德考昔的化合物，值得进一步研究其是否可能是我们观察到的抗炎效果的原因之一。
瓦德考昔曾被批准作为非甾体抗炎药（NSAID）用于治疗类风湿性关节炎和骨关节炎等炎症性疾病[3]。选择性COX-2抑制剂（如塞来昔布）已被证明能减轻小鼠抗原诱导的关节炎模型中的关节炎症和白细胞-内皮细胞相互作用，为其在炎症性关节炎研究中的应用提供了关键的临床前支持[4]。类风湿性脊柱炎的特点是轴向骨骼和附着点的慢性炎症，常伴有骨重塑和强直[10]、[18]、[2]。COX-2驱动的前列腺素信号传导被认为会促进疾病进展，NSAIDs仍是症状管理的一线治疗手段[15]。鉴于华支睾吸虫分泌蛋白在AS中的抗炎效果，以及在中检测到类似瓦德考昔的化合物，我们推测这种化合物可能是观察到的治疗效果的部分原因。
在这项研究中，我们旨在使用体外实验和体内实验评估在华支睾吸虫分泌蛋白中检测到的瓦德考昔的抗炎效果，重点关注AS的小鼠模型。我们试图确定这种代谢物是否对华支睾吸虫分泌蛋白的抗炎特性有贡献，并评估其作为治疗脊柱关节炎的重新利用药物的潜力。
章节摘录
华支睾吸虫分泌蛋白的收集与处理
按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，并遵循国家关于实验动物护理和使用的指南，从口服给予华支睾吸虫囊蚴的兔子体内收集成年华支睾吸虫。收集后，立即用预热的PBS将成年虫体清洗三次，以彻底去除残留的宿主胆汁、血清蛋白和其他杂质，然后进行体外培养。
瓦德考昔对细胞活力的评估
为了评估瓦德考昔对小鼠巨噬细胞的潜在细胞毒性，我们使用MTS方法进行了细胞活力检测（图2A）。结果显示，在较低浓度（5、10和15 μg/ml）下，瓦德考昔对细胞活力没有显著影响，表明在这些浓度下它不具有细胞毒性。然而，在较高浓度（50、100和200 μg/ml）下，观察到细胞活力显著下降，表明存在剂量依赖性的细胞毒性。
讨论
已知华支睾吸虫具有强大的免疫调节能力，能够诱导宿主对华支睾吸虫感染的耐受性，因为在慢性阶段促炎细胞因子较少。这促使人们寻找具有抗炎或免疫调节作用的寄生虫衍生物。最近的一项研究提出了两种来自华支睾吸虫分泌蛋白的亚分子（Cs-GT或Cs-Severin），这可能部分解释了华支睾吸虫分泌蛋白本身对AS的保护作用[9]。
伦理声明
本研究遵循所有相关机构指南进行。所有动物实验均获得了机构动物护理和使用委员会（CNU IACUC-H-2023-3）的批准。
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由教育科学技术部资助（项目编号：NRF-2022R1C1C1002741, RS-2024-00410713），以及全南国立大学医院生物医学研究所的CNUH-GIST研究合作项目（项目编号：BCRI25065）的支持。
沈承哲（Seung Cheol Shim）：撰写——审阅与编辑、监督、资源提供、方法学设计。元正元（Eun Jeong Won）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、软件使用、资源提供、项目管理、方法学设计、资金获取、数据管理、概念构思。赵俊（Jun Cho）：撰写——审阅与编辑、监督。金泰钟（Tae-Jong Kim）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、软件使用、项目管理、方法学设计、资金获取。金文珠（Moon-Ju Kim）：撰写——审阅与编辑
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