Floxine B染色法可与中型底栖生物（meiofauna）的高通量DNA条形码技术兼容

《Ecology and Evolution》：Phloxine B Staining is Compatible With High-Throughput DNA Barcoding of Meiofauna

　　摘要

现代的综合生物多样性研究需要能够弥合详细形态观察与DNA测序可扩展性之间差距的方法。像巨条形码技术这样的综合方法可以生成DNA序列，同时保留形态功能和丰度数据。对于小型、透明且数量众多的动物（如微型动物），从有机物和沉积物中分离样本是一个主要瓶颈，因为用于增强手动或自动样本检测的染色剂可能会抑制后续的分子工作流程。为了解决这个问题，我们测试了荧光素B染色与DNA测序的兼容性，以促进形态和分子样本处理的同步进行。将保存在乙醇、丙二醇或DMSO/EDTA/饱和NaCl溶液（DESS）中的微型动物与荧光素B一起孵育30分钟或24小时。然后手动分离样本，对18S rDNA基因的V1–V2区域进行测序，并量化主要微型动物门类的成功率。无论使用哪种保存剂或染色时间，线虫、桡足类和环节动物的测序成功率都较高。扁形动物的成功率较低，这可能是由于鉴定错误或引物限制，而不是染色剂的影响。总体而言，这些发现表明荧光素B与下游DNA扩增和测序兼容，使得形态和分子数据的有效整合成为可能。这种方法在其他微观分类单元中具有广泛的应用潜力，支持全面的高通量生物多样性评估或生态监测。

1 引言

在复杂的群落中准确高效地识别和量化生物是生物多样性研究中的一个主要挑战。一方面，如宏条形码这样的分子技术是大规模生物多样性评估的强大工具，但它们不提供丰度数据，而且公共参考数据库中缺乏DNA参考序列，这阻碍了序列的分类学分配（de Faria等人2018；Fonseca等人2010；Lefaible等人2023；Macheriotou等人2021；Tang等人2012）。另一方面，形态学方法可以提供关于功能特征、生活阶段和绝对丰度的信息，但它们耗时且劳动密集，并依赖于分类学专业知识，这通常限制了这些研究的时间或空间范围。因此，分子和形态学方法的有效整合至关重要，特别是在由许多小型且形态相似的生物组成的系统中。最近的发展，如巨条形码技术（Chua等人2023），展示了这种整合的潜力（Caterino和Recuero 2024；Hartop等人2024；Vihavainen等人2025）。巨条形码技术最初是为昆虫引入的，它使用高通量成像和测序平台对大量样本进行基于样本的DNA条形码化，同时生成DNA参考序列、形态和功能数据以及丰度估计（Chua等人2023）。通过连接遗传和形态信息，巨条形码不仅增强了生态推断，还扩展了宏条形码应用的DNA参考库。微型动物是极其丰富的小型（<1毫米）动物，是底栖生态系统健康的关键指标（Alves等人2013；Semprucci, Frontalini等人2015；Semprucci, Sbrocca等人2015；Zeppilli等人2015）。然而，它们的许多多样性仍然未被描述（Curini-Galletti等人2012；Garraffoni等人2021）。对于DNA条形码和形态学鉴定来说，由于防腐剂造成的损伤、它们的小体型以及通常透明的身体，从沉积物和有机物中分离微型动物是一个耗时的过程。因此，对微型动物进行染色是一种常见做法（例如，Ngo等人2013；Somerfield和Warwick 2013；Wang等人2019），因为它大大提高了动物与背景的区分度（Mason和Yevich 1967）。然而，形态学和分子工作流程之间的方法学不兼容性限制了数据的整合，因为常见的染色剂如罗丝班加尔（Rose Bengal）会抑制线虫的DNA提取和PCR成功率，无论使用哪种固定剂（Fonseca和Fehlauer-Ale 2012），并且对于桡足类也有不同的记录（Easton和Thistle 2014；Watanabe等人2016）。由于这两个分类群在微型动物群落中占主导地位，不建议将染色与分子技术结合使用（Carugati等人2015；Fonseca和Fehlauer-Ale 2012；van der Loos和Nijland 2021）。这阻碍了形态和分子数据的整合、分子方法的更广泛应用以及通过自动化分选扩大样本处理流程的规模。荧光素B是一种与荧光素相关的黄烷染料，可以将细胞质材料染成红色到粉色，在组织学中有各种应用（Bencosme 1954；Lendrum 1947），尽管使用频率低于罗丝班加尔，但它也被用作底栖生物的染色剂（Bownes和Perissinotto 2012；Daché等人2024；Foulon等人2025；Mason和Yevich 1967；Shimabukuro等人2022）。一种与包含分子方法的综合分类学方法兼容的染色剂可以提供一种适用于广泛生态和分类学研究的统一方法。因此，本研究的目的是测试荧光素B染色与DNA测序在单个微型动物样本上的兼容性。我们评估了防腐剂乙醇（EtOH）、丙二醇（PG）和二甲基亚砜（DMSO）、EDTA以及饱和NaCl（DESS）溶液以及孵育时间（30分钟和24小时）对主要微型动物门类测序成功率的影响。我们的目标是验证一种样本处理流程，该流程能够促进高效的形态分类以及高通量DNA条形码化，从而加速综合生物多样性研究的规模化。

2 材料与方法

2025年6月23日，我们从荷兰瓦登海Texel岛（53°09'N, 4°09'W）的一个贻贝滩采集了一升沉积物，刮取了第一厘米的沉积物。收集的沉积物被分成三等份。为了将生物从沉积物中分离出来，进行了2分钟的淡水冲击处理（Giere 2009），并通过1000-μm和41-μm的筛网级联过滤保留了微型动物部分。提取的微型动物被储存在30毫升70% PG、96% EtOH或DESS（20% DMSO、0.25 M EDTA，并饱和NaCl；Yoder等人2006）中，在4°C下保存2个月，然后进行染色处理。将荧光素B（RAL diagnostics）添加到每种防腐剂的两个5毫升子样本中，最终浓度为1毫克/毫升（0.1%），因为这个浓度之前已被用于自动分类（V. Foulon，个人交流）。每种防腐剂的一个子样本未进行染色，作为对照。试管用铝箔包裹以防止染色剂褪色。一组试管在荧光素B中孵育30分钟，另一组孵育24小时（Foulon等人2025）。在相应的孵育时间后，通过用各自的防腐剂在41-μm筛网上冲洗染色过的微型动物来去除多余的染色剂，然后将微型动物冲洗到培养皿中。样本被单独分装到含有30微升1X PCR缓冲液（Barlow 2019）的PCR板中。如果可能的话，我们在六个孔中填充线虫（48个），四个孔中填充桡足类（32个），两个孔中填充其他微型动物门类（10个），以模拟许多栖息地中线虫和桡足类占主导地位的自然条件（例如，Liu等人2025；Tachibana等人2023；Tong等人2022）。此外，还有一个仅含有30微升缓冲液的阴性提取对照孔，以及一个空孔作为PCR期间的阴性模板对照。DNA提取遵循Barlow（2019）的协议。简而言之，含有样本的PCR板在-80°C下放置10分钟，然后在热循环仪中分别在60°C下孵育70分钟和95°C下孵育15分钟。板子在-20°C下保存，直到进一步处理。使用SSU-F04（GCTTGTCTCAAAGATTAAGCC）和SSU-R22（GCCTGCTGCCTTCCTTGGA）引物（Blaxter等人1998）扩增18S rDNA基因的V1–V2区域。SSU-F04和SSU-R22在微型动物的宏条形码研究中经常使用，因为它们可以成功扩增许多微型动物分类单元（Gielings等人2021）。PCR在最终体积为20微升的溶液中进行，其中包含9.4微升无核酸酶水（UltraPure）、4微升反应缓冲液（Phire Green，10×；Thermo Scientific）、0.8微升牛血清白蛋白（Promega，10毫克/毫升）、0.4微升dNTPs（2.5毫摩尔）、0.4微升DNA聚合酶（Phire Green Hot Start II，Thermo Scientific）、1微升Oxford Nanopore-tailed引物（10皮摩尔/微升）和3微升模板。初始变性在98°C下进行30秒，35个循环：98°C下5秒、57°C下10秒、72°C下15秒，最后在72°C下延伸5分钟。每个PCR板的两排样本在1%琼脂糖凝胶上检查是否成功扩增。使用C. Wash（Cytena）和0.9×磁珠体积（NucleoMag NGS Clean-up and Size Select，Machery-Nagel）进行珠子清洗。使用Oxford Nanopore条形码引物（BC01-96）EXP-PBC096进行索引PCR，在10微升反应体积中包含2.5微升条形码引物、5微升LongAmp Taq 2× Master Mix（New England Biolabs）和2.5微升PCR模板。初始变性在95°C下进行3分钟，12个循环：95°C下15秒、62°C下15秒、65°C下50秒，最后在65°C下延伸3分钟。每个板的两排样本在1%琼脂糖凝胶上检查是否成功扩增。使用Cytena的Bead Cleanup方法进行珠子清洗，比例为0.8:1。使用4150 Tapestation系统和D5000 DNA ScreenTape（Agilent）对池进行量化。使用Oxford Nanopore Ligation Sequencing Kit V14（SQK-LSK114）和Native Barcoding Kit 24 V14（SQK-NBD114.24）进行文库制备。使用Oxford Nanopore PromethION 2 Solo和R10.4.1 PromethION Flow Cells（FLO-PRO114M）对池进行测序。在MinKnow（v24.02.16）中使用Dorado（v1.3；Oxford Nanopore）进行超精确的碱基调用，并使用Guppy（v6.5.7）进行多路复用，设置“require barcode both ends”为true。生物信息学处理在Naturalis Galaxy平台（v25.0；The Galaxy Community 2024）中进行。使用Snakemake流程对读段进行过滤（最小平均读段质量：15，最小大小：250，最大大小：600）；使用Cutadapt识别并移除引物，最大错误率为20%，最小重叠率为80%。丢弃剩余读段少于30的样本。使用NGSpeciesID（v0.3.1；Sahlin等人2021）生成共识序列，设置如下：k—13，w—20，映射阈值—0.7，对齐阈值—0.4，最小分数—0.8，最小无命中概率—0.1。构建的共识序列少于5个读段或占样本读段的1%的被丢弃。使用medaka（v2.0.1）对剩余的共识序列进行优化；从FastQ描述行中自动检测medaka模型。根据NCBI Genbank版本258的子集对读段进行分类，仅选择描述中包含“18S”一词的记录，并使用至少75%的查询覆盖率和80%的身份百分比截止值。我们将成功测序结果定义为生成超过500个读段的共识序列，这些读段占该孔总读段的至少80%，且读段鉴定与NCBI Genbank中现有参考序列的相似度至少为75%。在统计测试之前，由于样本量较少（n=2），我们从数据集中移除了双壳类动物。然后使用广义线性混合模型和car::Anova()函数模拟了防腐剂、孵育时间和分类群对成功测序结果数量的影响。使用ggplot2包制作图表。所有统计都在Rstudio（版本4.5.1）中进行。

3 结果

荧光素B在DESS和乙醇中都产生了明亮的粉红色个体。相比之下，在PG中的染色效果不太一致，强度也较低。孵育30分钟后，只有一部分个体显示出轻微的染色。24小时后，染色强度增加；然而，一些样本仍然未染色，一些染色的样本比在DESS或乙醇中保存的样本明显更浅。尽管如此，染色有助于样本的处理，使得更容易定位不动的样本，并与非染色对照样本相比验证它们的存在。总共测序了846个样本，包括线虫（n=495）、桡足类（n=247）、环节动物（n=79）、扁形动物（n=23）和双壳类（n=2）。不同防腐剂和孵育时间的整体测序成功率在83%到91%之间（图1）。数据显示防腐剂和染色时间之间没有显著交互作用（p=0.77）。染色时间和防腐剂均没有显著影响测序成功率（p=0.50和p=0.21，分别）。图1显示了在乙醇（EtOH）、丙二醇（PG）或DESS中保存并用荧光素B染色不同时间的样本的测序成功率（+?se）：无染色（对照）、30分钟或24小时。序列样本的分类对测序成功率有显著影响（p<0.001）。线虫、桡足类和环节动物在不同处理下的成功率都很高（图2）。特别是，扁形动物的测序成功率显著低于其他分类单元。尽管在91%（21个样本）的扁形动物样本中成功达成了共识分类，但实际分配的分类单元与预期不符，导致最终的成功率仅为17%（4个样本）。所有成功的测序结果均来自未经染色的乙醇保存样本。双壳类动物的染色和测序过程也取得了成功，但仅包含了两个个体。图2可以在图查看器或PowerPoint中打开。

**按分类单元划分的测序成功率**

**4 讨论**

我们的研究表明，通过对主要中型底栖动物进行Fluxine B染色，能够成功地对单个样本进行DNA测序，这证明了Fluxine B染色方法与分子生物学分析的兼容性，直接反驳了染色技术与基于DNA的分析不兼容的假设。测序成功率与保存剂和孵育时间无关，但可能需要进一步优化实验方法。首先，虽然仅使用96%的乙醇保存的样本获得了成功的扁形动物测序结果，但这种浓度的乙醇通常会导致显著的脱水和形态收缩（Marquina等人2021年；Naem等人2010年），从而影响准确的分类鉴定。我们建议研究人员根据其主要研究目标选择合适的保存剂，例如最大化形态保存或优化DNA的长期稳定性。70%或80%的乙醇可能是测试其与Fluxine B染色兼容性的替代方案。其次，尽管没有相关数据记录，但在PG培养后所有分类单元都观察到了轻微的染色现象。可能是因为PG的较高粘度减缓了Fluxine B在组织中的吸收，因此需要延长孵育时间以达到足够的对比度以便进行分类。相比之下，Fluxine B在加入乙醇保存的样本后30分钟内即可有效染色，其效率与福尔马林和水溶液相当（V. Foulon根据COPAS Vision Cytometer上的红色荧光水平个人观察）。然而，Fluxine B并不能永久固定组织中的物质，重新将染色样本转移到无染色的乙醇溶液中时可能会发生褪色现象，这可能是由于Fluxine B渗入保存剂所致。褪色的速度和程度因样本而异。分类是预测测序成功最重要的因素。线虫、环节动物和桡足类动物的测序成功率较高且稳定，而扁形动物的成功率显著较低。这些个体之间预期的分类身份与实际分类结果之间的显著差异表明，可能存在分类错误或非目标DNA的扩增。用于提取潮间带黏附性生物的新鲜样本可能因渗透压作用导致形态收缩，从而在分类过程中出现错误鉴定。另外，SSU4/R22引物在扁形动物中的扩增效率较低，可能导致非目标DNA的扩增。扁形动物作为捕食者和清道夫的角色（Armonies 1986年；Menn和Armonies 1999年；Nore?a等人2015年），其肠道内容物可能会掩盖宿主DNA的信号，导致错误的分类结果。尽管这两种解释都不支持Fluxine B的主动抑制作用，但应使用更特异性的扁形动物引物进一步探讨这一潜在效应。此外，未来针对高度敏感的软体动物进行研究时，可以采用更温和的提取方法（如氯化镁处理），以减少细胞裂解和收缩，从而评估Fluxine B染色的适用性。

**5 结论**

我们证明，Fluxine B染色技术能够同时实现形态学鉴定和分子条形码分析，支持中型底栖动物生态学和生物多样性研究的扩展，为大规模样本的快速、标准化和全面生物多样性评估铺平了道路。除了海洋底栖中型底栖动物外，该方法对于其他仍以分类为瓶颈的微观生物类群（包括土壤（微）动物和有孔虫）也具有巨大潜力。将这一工作流程应用于这些系统同样可以加速分类鉴定、减少处理时间，并扩大不同环境下的综合生物多样性监测范围。

**作者贡献**

Romy Lisanne Gielings：概念构思（平等参与）、数据管理（主导）、正式分析（主导）、研究设计（主导）、方法学（平等参与）、数据可视化（主导）、初稿撰写（主导）。Valentin Foulon：概念构思（平等参与）、方法学（平等参与）、指导（平等参与）、初稿撰写（协助）、审稿与编辑（平等参与）。Willem Renema：概念构思（平等参与）、方法学（平等参与）、指导（平等参与）、初稿撰写（协助）、审稿与编辑（平等参与）。Jan-Niklas Macher：概念构思（平等参与）、数据管理（协助）、正式分析（协助）、方法学（平等参与）、指导（平等参与）、初稿撰写（协助）、审稿与编辑（平等参与）。

**致谢**

本研究是MEIODYSSEA项目的成果，该项目得到了Sasakawa Peace基金会Ocean Shot Research Grant Program的支持。Sasakawa Peace Foundation的Ocean Shot Research Grant Program得到了日本基金会的资助。我们感谢Judit Carbonell Varea在实验室工作中的帮助。

**资金支持**

本研究由Sasakawa Peace基金会资助。

**披露**

样本采集与分析工作在欧洲进行，所有作者均来自该地区。作者们认识到公平的研究合作的重要性，并致力于在未来项目中推广包容性的研究方法。

**利益冲突**

作者声明没有利益冲突。

**数据公开**

所有数据和代码已上传至figshare（doi:10.6084/m9.figshare.31047427）。条形码序列也已上传至NCBI GenBank，登录号为PX722042—PX722877。