《Neuroscience & Biobehavioral Reviews》：The Applications of Single-Cell and Spatial Transcriptomics in Neuroscience and Brain Disorders
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空间转录组学通过量化完整组织内的基因表达同时保留每个细胞的精确空间背景，扩展了传统的转录组学方法。该技术还在生理条件下捕获基因表达，包括与周围微环境的相互作用，从而增强我们对健康和疾病状态下细胞状态的理解。近期的快速进展提高了通量、转录本捕获、准确性和整体数据
空间转录组学通过量化完整组织内的基因表达同时保留每个细胞的精确空间背景，扩展了传统的转录组学方法。该技术还在生理条件下捕获基因表达，包括与周围微环境的相互作用，从而增强我们对健康和疾病状态下细胞状态的理解。近期的快速进展提高了通量、转录本捕获、准确性和整体数据质量。在这篇综述中，我们总结了主要的空间转录组学平台，概述了它们的优势和局限性。我们还强调了在神经科学中的关键应用，包括脑细胞类型鉴定、结构-功能关系以及发育过程。此外，我们检查了精神类疾病和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和抑郁症）的空间基因表达模式。最后，我们讨论了新兴的方向，包括空间多组学整合以及人工智能推动脑研究的潜力。总的来说，这项工作为神经科学和脑部疾病的未来研究提供了基础。
1. 引言
近年来，快速发展的转录组学技术使得在全基因组范围内精确测量基因表达成为可能。迄今为止，转录组学经历了三个主要的发展阶段。最初，批量RNA转录组学被用于分析整个细胞混合物中的转录表达，虽然这种方法可以识别整体基因表达的趋势，但它无法揭示细胞特异性的表达模式。在第二阶段，引入了单细胞RNA测序（scRNA-seq），能够在单细胞水平捕获基因表达并发现新的细胞类型，从而提供对细胞类型多样性和状态的更深入见解。然而，scRNA-seq通常需要酶消化组织，这一过程不仅会破坏空间信息，还会改变转录谱。单细胞测序还存在其他局限性，例如组织解离和单细胞捕获不可避免地引入技术偏差；不同细胞类型和细胞状态的存活率、RNA保留率和扩增效率的差异可能导致测序数据不能准确反映组织中的细胞组成和转录丰度。另一方面，由于测序深度和文库构建策略的限制，单细胞转录组数据通常表现出高度的稀疏性。Dropout现象降低了基因表达的定量准确性，特别是在空间或功能高度异质性的组织中。这些限制对单细胞测序在解析细胞间调控机制及其与组织微环境的关系方面提出了挑战。在第三阶段，最新的空间转录组学（ST）技术结合了完整组织切片内的转录组测量与空间定位。ST不仅保留了细胞间相互作用和周围微环境等背景信息，还能将基因表达和细胞结构可视化。分子表达数据与空间位置信息的深度融合使研究人员能够在组织水平上系统分析基因表达的空间异质性、区域特异性调控和细胞间空间协调。此外，空间转录组学提供了单细胞分辨率下的分子特征与组织水平的功能结构之间的桥梁，允许在单一分析框架内同时表征细胞类型、细胞状态及其空间生态位。这种技术范式不仅弥补了单细胞测序缺乏空间信息的不足，还为揭示复杂组织中分子调控网络的空间组织原则提供了新的研究路径。
2. 空间转录组学技术概览
空间转录组学技术主要分为基于原位杂交、基于原位测序、高通量捕获和基于光激活条形码等几大类。基于原位杂交的方法，如单分子荧光原位杂交（smFISH）、组合smFISH、seqFISH和多重纠错荧光原位杂交（MERFISH），利用荧光标记的探针在固定细胞中可视化目标RNA分子。其中，MERFISH通过二进制条形码和多次成像循环显著提高了准确性和可扩展性，能够检测单个细胞内数千个基因。为了应对临床样本（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织）中RNA降解的挑战，MERFISH 2.0优化了成像化学和流程，显著提高了转录本检测灵敏度。基于原位测序（ISS）的方法，如荧光原位测序（FISSEQ）和STARmap，直接在组织微环境中进行测序化学反应，实现空间锚定的短核苷酸序列读出，能够检测单核苷酸变异，但灵敏度相对较低。高通量捕获技术，如10x Genomics Visium、高清空间转录组学（HDST）和Slide-seq，利用空间条形码表面或珠子捕获mRNA，随后进行测序。Visium平台使用嵌入条形码捕获点的载玻片，结合高分辨率组织成像与下一代RNA测序，能够绘制跨组织切片的时空分辨转录组图谱，尽管其空间分辨率受限于捕获点的大小（约55 μm）。为了解决这一问题，Visium HD提供了接近单细胞尺度的空间分辨率。激光捕获显微切割RNA测序（LCM-RNA-seq）技术则允许直接从组织切片中精确分离微观区域或单个细胞，兼容冷冻、新鲜或石蜡包埋组织，适用于区域特异性转录组分析，尽管该方法耗时费力。空间标记技术，如DBiT-seq和AtlasXomics，利用微流体系统或正交条形码将位置信息记录到转录本上，能够实现同一组织切片内RNA与其他分子层（如蛋白质或染色质标记）的同时分析。
3. 空间转录组测序技术
10x Genomics Visium平台通过在载玻片上嵌入数千个条形码捕获点，每个点涂有含有poly(T)序列、唯一分子标识符（UMI）和空间条形码的寡核苷酸，实现全转录组分析与形态学背景的保留。该技术已被广泛应用于绘制复杂大脑结构的区域表达模式，例如在肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型中识别与疾病进展相关的空间组织脂质信号网络，或在人背外侧前额叶皮层（dlPFC）中发现层特异性标记物。Visium HD作为下一代平台，通过显著增加捕获特征的密度和改进分子捕获效率，实现了更接近单细胞尺度的空间分辨率，这对于解析皮质分层、细微的神经胶质组织以及脑内微观区域异质性尤为重要。HDST和Slide-seq则致力于实现更高的分辨率，分别通过将条形码捕获位点微型化至约2 μm和利用固定在玻璃表面的10 μm条形码磁珠，实现了近乎单细胞的精度。LCM-RNA-seq技术利用聚焦激光束精确切割目标区域，随后提取RNA进行测序，虽然在通量上受限，但对于采样稀有细胞群体和验证高通量方法获得的空间特征具有重要价值。空间标记技术通过微阵列、光激活或微流控系统（如DBiT-seq）将独特的空间条形码分配给完整组织内的转录本，为组织切片转化为定量分子图谱提供了基础。
4. 空间转录组数据分分析技术
空间转录组数据的分析主要分为基于成像和基于高通量测序两种途径，前者提供靶向、高分辨率的离散特征定位，后者提供非靶向的全转录组覆盖。降维技术是处理高维数据的核心，主成分分析（PCA）作为线性方法常用于保留大部分原始数据特征，但忽略了空间邻近性。为此，研究人员开发了空间感知软件SpatialPCA，结合邻域相似性以提高分辨率。非线性方法如t分布随机邻域嵌入（t-SNE）和均匀流形逼近与投影（UMAP）旨在保留高维空间中的局部或全局距离关系，其中UMAP因其优异的可扩展性和稳定性，成为可视化复杂高维数据和识别空间结构、细胞类型分布的首选工具。聚类分析旨在基于转录组相似性和解剖背景对空间位点或细胞进行分类，传统的层次聚类、k-means和Leiden算法往往忽略空间信息。因此，研究者开发了结合空间坐标或形态学特征的算法，如利用贝叶斯先验建模空间依赖性的BayesSpace，以及利用图卷积网络（GCN）整合基因表达相似性和空间邻接性的SpaGCN和STAGATE，这些方法能够识别与组织学区域更精确对应的生物学意义簇。差异表达分析则用于识别具有显著空间变异性的基因（SVG），SpatialDE利用高斯过程回归（GPR）检测随空间坐标系统性变化的转录本，而后续的扩展如trendsceek和SPARK进一步提高了统计稳健性和计算效率。近年来，深度学习框架如GraphCellNet、SpatialFusion、MNiST和SpaOmicsVAE通过整合图神经网络、对比学习和变分自编码器，实现了空间域识别、细胞类型反卷积和多尺度、多模态空间组学数据的联合分析。
5. 单细胞测序与组学数据分析的整合
整合空间转录组学与单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以同时提供具有空间和细胞精度的基因表达全景视图。整合过程通常涉及映射和反卷积两种计算框架。映射方法（如Seurat Integration、LIGER、Harmony）通过将单细胞数据投影到空间坐标系中推断细胞类型的定位，减少批次效应并对齐跨模态的转录组特征。反卷积方法（如SPOTlight、Cell2location、NMF回归）则将每个空间点视为多个细胞转录信号的混合物，并根据单细胞参考光谱估计存在的细胞类型比例，从而揭示不同细胞群的空间组织和特定细胞类型的功能域。多组学整合进一步将空间转录组学与基因组学、蛋白质组学和表观基因组学相结合，超越RNA分析的范畴，构建连接染色质可及性、转录和蛋白质活性的空间调控网络。例如，MISAR-seq利用微流控索引同时分析染色质可及性和RNA表达，而AtlasXomics等平台则扩展到空间多组学，整合转录组、表观基因组和蛋白质组信息。这些整合技术在构建跨物种（小鼠、绒猴、人类）神经元细胞类型统一分类以及揭示阿尔茨海默病等脑部疾病的分子通路方面展现了巨大潜力。尽管面临数据异质性、高维度和计算复杂性等挑战，人工智能和机器学习有望通过整合异构数据集、提高数据连贯性和揭示隐藏的分子相互作用，成为未来精准神经科学和治疗开发的核心。
6. 空间转录组学在神经科学中的应用
空间转录组学通过结合实验资源、技术和分析框架，生成空间分辨的转录组数据，进而应用于神经科学中的脑细胞类型鉴定和结构-功能关系探索。在脑细胞类型鉴定方面，该技术能够系统地表征哺乳动物大脑中多样化的细胞类型，例如利用MERFISH技术分析小鼠初级运动皮层中的约300,000个细胞，识别出95个不同的神经元和非神经元细胞簇；同时，研究还通过整合空间数据揭示了星形胶质细胞、内皮细胞和血管周细胞的区域多样性。在发现脑结构与功能关系方面，空间转录组学克服了传统神经解剖学方法的局限，将基因表达谱与解剖特征联系起来，揭示了功能亚区和层级结构。例如，一项研究利用基于图的无监督聚类和机器学习方法将成年小鼠大脑划分为181个转录不同的区域，构建了全面的空间图谱；另一项研究比较了人类和小鼠大脑的空间基因表达模式，揭示了纹状体回路的高度进化保守性。此外，高分辨率平台如10x Genomics Visium成功描绘了人dlPFC切片的六层皮质及其独特的转录特征，并识别了层特异性的星形胶质细胞群。在探索脑发育方面，空间转录组学使研究人员能够在原位可视化这些发育轨迹，提供神经发生的时空理解。例如，结合单细胞和空间转录组学分析人类胚胎皮层22个脑区的超过4,000个细胞，绘制了受孕后22-23周的区域基因表达和神经元成熟模式；类似的方法还生成了小鼠脑发育的空间图谱，捕捉了约120,000个细胞核的空间位置以及前脑和中脑的早期分化区域。
7. 利用空间转录组学探索脑部疾病机制
空间转录组学通过整合基因表达数据与精确的空间信息，为神经系统疾病的分子和细胞基础提供了新见解。在阿尔茨海默病（AD）研究中，该技术帮助识别了易受攻击和具有弹性的神经元群体的分子特征，例如发现AD患者内嗅皮层第二层中RORB阳性的兴奋性神经元选择性变性，以及层特异性差异表达基因（DEGs）如KIF5A、PAQR6和SLC1A3.1。空间分析还揭示了斑块周围的炎症梯度，即小胶质细胞和星形胶质细胞根据其距淀粉样蛋白斑块的距离表现出不同的激活状态，靠近斑块核心的细胞显示出强烈的炎症和吞噬途径上调，而外围区域则表现出更具稳态或过渡性的状态。此外，研究还发现了层特异性的神经元脆弱性以及受损的神经元-胶质细胞相互作用。在帕金森病（PD）研究中，空间转录组学和snRNA-seq分析确定了10种转录不同的多巴胺能神经元亚型，其中SOX6+AGTR1+亚型被发现特别容易发生神经变性，并且证实了特定兴奋性神经元亚型更容易发生路易体病理，伴随突触和线粒体基因的下调以及DNA修复和细胞因子基因的上调。对于脑卒中和脑室内出血，空间转录组学被用于研究出血后皮质区域的快速转录反应及其对海马的继发性影响，并通过结合免疫组织化学分析了海绵状畸形中内皮细胞的异质性。在多形性胶质母细胞瘤（GBM）研究中，空间转录组学揭示了由缺氧核心、增殖边缘和免疫富集边界组成的高度组织化的肿瘤生态系统。研究发现肿瘤-免疫相互作用区位于肿瘤边缘，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和T细胞在此进行动态串扰影响免疫逃逸和治疗反应；同时还发现了胶质瘤干细胞样细胞生态位，通常定位于血管周或神经元丰富的区域，特定的信号通路支持肿瘤生长和侵袭。这些发现表明GBM的进展和治疗抵抗是由空间结构化的肿瘤微环境所驱动的。
