在小鼠胫骨骨折引起的慢性疼痛中，依赖于7-脱氢胆固醇还原酶的胆固醇过载通过单核细胞趋化蛋白3调节星形胶质细胞的激活以及mGluR5/ERK信号通路

《Neuroscience Letters》：Spinal 7-dehydrocholesterol reductase dependent cholesterol overload regulates astrocyte activation and mGluR5/ERK cascades via monocyte chemotactic protein 3 in tibial fracture-induced chronic pain in mice

　　曹琦|詹钊|郭东辉|马世强|王恒军|王星月|周浩|霍振辉|李晓明|傅欣|刘军
天津医科大学骨科临床学院，中国天津

**摘要**
骨折患者在骨科手术后常常会经历令人困扰且持续时间较长的疼痛。编码星形胶质细胞的脊髓单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）以及mGluR5介导的兴奋性突触可塑性对中枢痛觉传导至关重要。近期研究强调了7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7）在胆固醇过载和神经炎症中的作用。本研究利用胫骨骨折并植入髓内钉的小鼠模型，探讨了DHCR7、MCP-3和mGluR5之间的潜在关联。研究发现，胫骨骨折和骨科手术会导致持续的机械性及冷刺激性痛觉过敏，同时伴随脊髓中胆固醇的积累和DHCR7表达的增加。使用DHCR7抑制剂AY9944进行的脊髓（鞘内）治疗能够预防并缓解骨折手术后的持续性疼痛。此外，AY9944还能减少骨折小鼠的脊髓胆固醇过载、MCP-3分泌、星形胶质细胞活化以及mGluR5的表达。脊髓内注射mGluR5拮抗剂MPEP可通过降低ERK磷酸化来保护小鼠免受骨折相关痛觉过敏的影响。值得注意的是，当同时给予外源性MCP-3时，AY9944的作用效果会减弱。另外，脊髓内中和MCP-3可缓解骨折后的持续性疼痛行为、星形胶质细胞活化及mGluR5表达的增加。星形胶质细胞抑制剂氟柠檬酸也能减轻慢性骨折疼痛。综上所述，脊髓DHCR7介导的胆固醇过载通过调节MCP-3依赖的星形胶质细胞活化、mGluR5表达及ERK磷酸化，成为骨折相关慢性痛觉过敏的重要发病机制。

**1. 引言**
全球医疗开支的很大一部分用于治疗肌肉骨骼创伤，这类创伤在临床上非常普遍，其发生率随着建筑损伤、工业事故和交通事故的增加而上升（Chen等人，2017年）。骨折患者在接受骨科手术后常常会长期遭受难以缓解的疼痛（McVeigh等人，2020年；Zhao等人，2022年）。此外，骨折引起的长期疼痛还可能导致睡眠障碍、抑郁、认知功能下降和残疾（Tajerian等人，2014年；Zhang等人，2016年）。最新研究表明，中枢痛觉敏化和兴奋性突触可塑性是由胶质细胞介导的神经炎症驱动的，这对包括神经损伤、化疗、组织炎症及骨折在内的多种原因引起的慢性疼痛具有关键作用（McKiver等人，2025年；Shi等人，2025年；Zhang等人，2022a年）。然而，目前尚不清楚骨折相关慢性疼痛的具体分子机制。

胆固醇过载逐渐被认为是中枢神经系统神经炎症、脂质过氧化和神经毒性的关键步骤，这些因素会引发多种神经系统疾病中的神经行为缺陷（Essayan-Perez和Südhof，2023年；Valenza等人，2023年）。7-脱氢胆固醇（7-DHC）是胆固醇生物合成过程中的中间产物，可通过7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7）转化为胆固醇（Li等人，2024年）。最近的研究表明，通过基因敲除或药物阻断DHCR7可以减少7-DHC向胆固醇的转化，从而防止脂质过氧化、线粒体损伤、炎症及由胆固醇代谢失衡引起的细胞毒性（Li等人，2024年；Xiao等人，2020年；Zeng等人，2024年）。然而，脊髓DHCR7级联反应和胆固醇过载在骨折相关慢性疼痛中的作用机制仍不明确。

神经炎症的特征是趋化因子的分泌和胶质细胞的活化。过去认为星形胶质细胞主要为中枢神经系统中的神经元提供营养和结构支持，但现在越来越多的证据表明它们在多种神经系统疾病中发挥着重要的炎症调节和神经元连接作用（Lee等人，2023年；Mi等人，2023年）。特别是星形胶质细胞活化在多种原因引起的病理疼痛机制中起着关键作用，包括骨癌、脊髓损伤、周围组织损伤和阿片类药物暴露（Ji等人，2019年；Xu等人，2025年）。单核细胞趋化蛋白3（MCP-3，也称为趋化因子C-C基序配体7）是一种典型的星形胶质细胞活化因子，它参与关节炎引起的炎症性疼痛以及啮齿动物中的坐骨神经损伤引起的神经病理性疼痛（Chen等人，2025年；Chi等人，2025年）。此外，MCP-3的中和可以通过减少大鼠脊髓背角中的突触后离子型谷氨酸受体来抑制阿片类药物引起的痛觉过敏和兴奋性神经可塑性（Qiang和Yu，2019年）。鉴于代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）在脊髓痛觉传导中的关键作用（Jin等人，2023年），进一步研究亟需探讨胆固醇过载、MCP-3依赖的星形胶质细胞活化及mGluR5过表达在慢性骨折疼痛中的相互作用。

本研究探讨了鞘内注射DHCR7抑制剂AY9944对胫骨骨折及骨科手术小鼠慢性疼痛的治疗潜力，同时测量了脊髓中的MCP-3浓度、星形胶质细胞活化及mGluR5表达情况，从而揭示了DHCR7依赖的胆固醇过量通过脊髓MCP-3介导的星形胶质细胞活化及mGluR5过表达在慢性骨折疼痛中的作用机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物
8-10周大的雄性C57BL/6 J小鼠被饲养在塑料笼中，可自由获取食物和水分，处于12小时人工控制的光暗周期环境中。每次实验时，湿度和室温保持恒定。动物实验遵循美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南，并获得了河北省沧州中西医结合医院伦理委员会的批准（CZX2025-DW002-01，河北）。研究人员对实验结果不知情。在开始任何基线测试之前，小鼠需至少适应三天。

2.2. 药物及其给药方式
DHCR7抑制剂AY9944（Abcam，英国）、针对MCP-3的中和抗体（anti-MCP-3，Abcam，AF-456-NA，R&D Systems，美国）、星形胶质细胞抑制剂氟柠檬酸（F9634，Sigma-Aldrich，美国）、重组MCP-3（456-MC，R&D Systems）以及mGluR5选择性拮抗剂2-甲基-6-(苯乙炔基)吡啶（MPEP，M5435，Sigma-Aldrich，美国）均溶解在1%二甲基亚砜（DMSO，D2650，Sigma-Aldrich）中用于给药。使用30号针头在L4和L5水平之间进行鞘内注射，当观察到反射性尾巴摆动时，向脑脊液中注入5微升药物（Cui等人，2021年）。

2.3. 慢性骨折疼痛模型
根据现有文献，建立了胫骨骨折相关的慢性疼痛模型（Cui等人，2021年；Long等人，2023年）。首先使用七氟醚（诱导剂量3.0%；手术剂量1.5%）通过鼻罩对小鼠进行麻醉。在左胫骨进行膝部至骨干的切口后，将0.38毫米的不锈钢钉插入胫骨髓腔内，然后用6-0聚丙烯缝线缝合切口。对照组小鼠则不进行胫骨骨折处理。

2.4. 痛觉行为测试
为了评估机械性痛觉过敏，将小鼠放置在金属网平台上，适应两小时后进行测试。使用von Frey毛发（Stoelting，美国）以0.16、0.4、0.6、1.0、1.4和2.0克的逐渐增强的力量进行刺激，通过上下移动的方法测量小鼠的爪子撤回阈值。每次实验开始时使用0.16克的von Frey毛发刺激左后爪的足底表面。如果出现舔舐或撤回反应，则视为阳性反应；如果没有，则增加力量，之后计算爪子撤回阈值（Cui等人，2021年；Zhang等人，2021年）。

2.5. 西部印迹（Western blot）
小鼠通过吸入七氟醚（3.0%）麻醉后进行安乐死。迅速取出脊髓L4-5段的背角组织，并在含有蛋白酶抑制剂的冰冻裂解缓冲液中匀浆。离心后取上清液作为蛋白质样本。使用含有单克隆小鼠抗β-actin抗体（1:5000；Sigma-Aldrich）的膜进行蛋白质检测和转移。蛋白质样本在10% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。膜在4°C下与多克隆兔抗DHCR7（1:2000；PA5-48204，Invitrogen，美国）、mGluR5（1:5000；AB5675，Sigma-Aldrich）、p-ERK（磷酸化细胞外信号调节激酶，1:1000；Cat.4370，Cell Signalling Technology）抗体一起孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（1:2000；Jackson Immuno Research，美国）显色一小时。

2.6. 胆固醇含量测定
根据制造商说明，使用Amplex Red胆固醇测定试剂盒（#A12216，Thermo Scientific）测定脊髓背角样本中的胆固醇含量。荧光信号通过荧光微孔板读取器（Thermo Scientific）在560 nm激发光和590 nm发射光下检测。根据胆固醇标准曲线计算每个样本的胆固醇浓度，并将其相对于总蛋白量表示为胆固醇含量/蛋白（μg/mg）。

2.7. 胆固醇可视化评估
使用荧光抗生素BODIPY（BODIPY，HY-W090090，MedChemExpress）可视化未酯化和酯化胆固醇。将切片从冷冻箱中取出，在空气中干燥1小时，然后用PBS重新水化15分钟，再进行染色。每个切片在避光盒中染色1小时。处理过程中尽量减少光照。冷冻脊髓切片的胆固醇染色使用BODIPY 493/503（BODIPY，HY-W090090，MedChemExpress）进行，该试剂剂溶于100%乙醇中并稀释至20 μg/ml。调整阈值以区分脂滴信号和背景信号。

2.8. ELISA分析
使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测脊髓L4-5段中的MCP-3（ab205571，Abcam）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP，ab233621，Abcam）浓度。脊髓组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中匀浆。使用BCA蛋白测定试剂（Pierce）测定蛋白质浓度。每个96孔板中的反应使用100 μg样本蛋白。所有ELISA实验均遵循制造商提供的方案，MCP-3和GFAP的水平根据标准曲线计算并归一化至总蛋白水平。

2.9. 免疫荧光
在吸入七氟醚（3.0%）的深度麻醉下，小鼠通过心脏灌注预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）和4%戊二醛处理。随后解剖L4-L5段的脊髓，并在30%蔗糖中脱水2天。组织用O.C.T.固定，然后用冷冻切片机切成8-μm厚的切片。切片先用0.3% Triton X-100封闭10分钟，再用5%山羊血清封闭1小时。接着与一级抗体（anti-MCP-3，1:200；MA5-29089，Invitrogen；anti-GFAP，1:200；ab68428，Abcam；anti-NeuN，1:200；ab177487，Abcam）在4°C下孵育过夜。冲洗三次PBS后，与荧光标记的二级抗体孵育1小时。使用荧光显微镜（Olympus，日本）收集图像。

2.10. 统计分析
样本量根据类似行为和生化分析的先前研究确定（Cui等人，2021年；Long等人，2023年；Zhang等人，2021年；Zhang等人，2022a年）。动物随机分配到不同的实验组。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。对于呈正态分布的数据（以平均值（标准误差SEM）表示），采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验比较组间差异。所有统计分析（正态分布数据）均使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，美国）进行。

冷刺激评分（0-3）被视为序数数据，以中位数（四分位数范围，IQR）表示。对于重复测量的行为数据（冷刺激反应），应用了具有可交换相关结构的序数广义估计方程（OrdinalGEE）模型来解释不同时间点内的受试者间相关性，其中组别、时间及其交互作用作为固定效应。使用Mann-Whitney U检验进行了特定时间点的组间比较。所有统计分析（冷刺激反应数据）均在Python（statsmodels 0.14.6）中完成。P < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果
3.1. 胫骨骨折会导致持续性的疼痛行为，并在骨科手术后脊柱中DHCR7表达增加和胆固醇过载
最初，两组在基线机械敏感性和冷刺激敏感性上没有明显差异（P > 0.05，n = 6，图1A和B）。von Frey实验显示，胫骨骨折并插入针后，同侧后爪的机械性痛觉过敏从第7天开始，第14天达到峰值，并持续至少21天（最后一次检查日）。这与与假手术组相比，机械性爪缩回阈值显著降低相一致（F (1, 50) = 206.0，P < 0.0001，n = 6，图1A）。在丙酮测试中，骨科手术后的骨折导致了长期的（>21天）冷刺激痛觉过敏，表现为对丙酮的持续过度反应，而假手术组则没有这种反应（图1B）。这些行为结果表明，胫骨骨折和骨科手术后会产生并维持慢性疼痛（机械性痛觉过敏和冷刺激痛觉过敏）。

3.2. 脊髓内注射AY9944可预防和缓解骨科手术后的胫骨骨折相关慢性疼痛
为了探讨DHCR7在持续性骨折疼痛中的作用，我们在骨科手术后的第4、5和6天连续三天每天注射DHCR7抑制剂AY9944（50 μg）。首先，AY9944未影响假手术组的正常机械敏感性和冷刺激敏感性（图2A和B）。然而，重复注射AY9944显著减少了骨折引起的机械性痛觉过敏和冷刺激痛觉过敏，表现为机械性爪缩回阈值的突然升高（F (3, 100) = 120.3，P < 0.0001，n = 6，图2A）以及冷刺激反应评分的显著下降（图2B）。AY9944对骨折疼痛的预防效果在三次注射后至少持续了四天。

3.3. DHCR7抑制可减少胫骨骨折后脊柱胆固醇过载、MCP-3分泌、星形胶质细胞激活和mGluR5表达
正如预期的那样，我们观察到AY9944预处理限制了骨折引起的脊柱胆固醇含量增加（F (2, 12) = 41.13，P < 0.0001，n = 5，图3A），进一步表明DHCR7依赖的胆固醇过载是胫骨骨折后慢性痛觉过敏神经病理发生的关键步骤。

3.4. 脊髓内抑制MCP-3通路可减轻胫骨骨折和骨科手术后的慢性疼痛、星形胶质细胞激活和mGluR5表达
为了确认MCP-3的细胞定位，我们使用免疫组化技术检查了MCP-3与星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物IBA-1和神经元标记物NeuN的共定位。双重染色证实MCP-3主要与GFAP共定位，而不与IBA-1和NeuN共定位，这表明MCP-3主要在脊柱背角星形胶质细胞中表达。此外，从胫骨骨折后的第4天到第6天，每天通过脊髓内注射0.3 μg的anti-MCP-3来评估脊髓MCP-3炎症级联反应在慢性骨折疼痛中的作用。值得注意的是，注射anti-MCP-3的动物表现出机械性爪缩回阈值的升高（F (1, 50) = 36.59，P < 0.0001；n = 6，图4B）和冷刺激评分的下降（图4C），这预防了1-4天的机械性和冷刺激痛觉过敏。此外，Elisa检测和免疫荧光染色显示，anti-MCP-3药物降低了骨折动物的脊柱GFAP表达（图4D和E）。Western blot检测发现，anti-MCP-3减少了骨折暴露小鼠的脊柱mGluR5表达（F (2, 12) = 68.72，P < 0.0001，图4F）。这些数据共同表明，anti-MCP-3通过抑制脊髓MCP-3来减轻慢性骨折疼痛。

3.5. 脊髓mGluR5拮抗通过降低ERK磷酸化具有保护作用
随后研究了mGluR5在持续性骨折疼痛中的作用。最初，我们在骨科修复后的第4至6天每天给胫骨骨折小鼠注射三次mGluR5拮抗剂MPEP（10 nmol）。von Frey测试显示，MPEP显著减少了骨折小鼠的机械性痛觉过敏，持续超过4天（F (1, 50) = 25.46，P < 0.0001；n = 6，图5A）。同样，丙酮测试显示，MPEP预处理预防了冷刺激痛觉过敏，表现为冷刺激评分的下降（图5B）。ERK的磷酸化是mGluR5激活后中枢痛觉敏化的重要表现。我们的生化数据发现，骨折后第7天脊柱ERK显著磷酸化（图5C）。正如预期的那样，MPEP预处理降低了胫骨骨折和骨科手术后ERK的磷酸化增加（F (2, 12) = 51.39，P < 0.0001，图5C）。此外，单次注射MPEP（10 nmol）在胫骨骨折两周后也减轻了现有的机械性痛觉过敏（F (1, 50) = 99.08，P < 0.0001，图5D）和冷刺激痛觉过敏（图5E）。综合来看，我们的研究结果表明，脊髓mGluR5/ERK级联反应是胫骨骨折后慢性痛觉过敏发生和维持的关键调节因素。下载：下载高分辨率图片（546KB）下载：下载全尺寸图片

图5. mGluR5的药理学拮抗作用可以防止骨折相关术后疼痛的起始和持续。选择性mGluR5拮抗剂MPEP（10 nmol）在胫骨骨折后的第4、5和6天通过鞘内注射途径每日给药，连续三天。(A) 和 (B) MPEP预处理可以预防骨折相关的机械性痛觉过敏和冷痛觉过敏（n = 6）。(C) 脊髓背角中p-ERK蛋白水平的Western blot代表性条带（n = 5）。(D) 和 (E) 在骨科手术后第14天使用MPEP治疗可以减轻已建立的机械性痛觉过敏和冷痛觉过敏（n = 6）。

3.6. 重组MCP-3消除了AY9944引起的行为性痛觉过敏和脊髓星形胶质细胞激活的减少。接下来，我们评估了脊髓MCP-3通路是否对DHCR7抑制的镇痛效果是必需的。令人惊讶的是，外源性MCP-3（鞘内注射，1 pmol）的共同应用消除了AY9944疗法（鞘内注射，50 μg）引起的骨折相关机械性痛觉过敏（F (2, 75) = 51.57, P < 0.0001, n = 6, 图6A）和冷痛觉过敏（图6B）。同时，脊髓暴露于重组MCP-3逆转了骨折处理小鼠脊髓背角中GFAP表达的下调（F (3, 16) = 99.56, P < 0.0001, n = 5, 图6C）。这些结果有力地证明了MCP-3依赖的星形胶质细胞激活是DHCR7抑制在疼痛缓解中的治疗靶点。

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图6. 脊髓暴露于外源性MCP-3消除了DHCR7抑制对骨折疼痛的镇痛效果。DHCR7抑制剂AY9944（50 μg）和重组MCP-3（1 pmol）在胫骨骨折后的第14天通过鞘内注射途径给药。(A) 和 (B) AY9944可以缓解现有的机械性和冷痛觉过敏，而重组MCP-3的共同应用则削弱了这种效果（n = 6）。(C) ELISA实验显示了骨折、AY9944和重组MCP-3干预后脊髓GFAP蛋白的变化（n = 5）。

3.7. 药理学抑制星形胶质细胞可以减少胫骨骨折相关的慢性疼痛行为。接下来，我们评估了脊髓星形胶质细胞激活是否对慢性骨折疼痛的发展是必要的。因此，胫骨骨折的小鼠在骨科修复后的第4至6天每天接受三次星形胶质细胞抑制剂氟胞嘧啶酸（鞘内注射，10 nmol）的注射。von Frey测试显示，氟胞嘧啶酸显著减少了骨折小鼠超过4天的机械性痛觉过敏（F (1, 50) = 18.55, P < 0.0001; n = 6, 图7A）。同时，丙酮测试显示，氟胞嘧啶酸的预先给药预防了冷痛觉过敏，这体现在骨折处理动物的冷痛评分降低（图7B）。这些结果表明，脊髓星形胶质细胞激活是胫骨骨折后慢性痛觉过敏的重要步骤。

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图7. 药理学抑制星形胶质细胞对骨折相关术后疼痛有效。星形胶质细胞抑制剂氟胞嘧啶酸（10 nmol）在胫骨骨折后的第4、5和6天通过鞘内注射途径每日给药。（A）和（B）氟胞嘧啶酸预处理可以预防骨折相关的机械性痛觉过敏和冷痛觉过敏（n = 6）。

3.8. 重组MCP-3引起的急性疼痛可以通过mGluR5拮抗作用得到补偿。最后，我们测试了mGluR5是否参与了MCP-3介导的脊髓疼痛感知。mGluR5拮抗剂MPEP（鞘内注射，10 nmol）在外源性MCP-3（鞘内注射，1 pmol）给药前一小时给予。有趣的是，MPEP预处理减少了MCP-3引起的急性机械性痛觉过敏，表现为爪子撤回阈值的显著上升（F (2, 60) = 81.68, P < 0.0001, n = 6, 图8A）。同样，通过鞘内注射途径给予重组MCP-3提高了对丙酮的冷反应评分，而MPEP干预则抑制了这一反应（图8B）。这些结果揭示了MCP-3和mGluR5级联反应在脊髓疼痛传导中的先前未被认识的关系。

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图8. 外源性MCP-3诱导的急性痛觉过敏以及mGluR5拮抗作用对痛觉过敏的减少。选择性mGluR5拮抗剂MPEP（10 nmol）在外源性MCP-3（1 pmol）给药前一小时通过鞘内注射途径给予。（A）通过von Frey测试中的爪子撤回阈值评估了机械性痛觉过敏的发展（n = 6）。

4. 讨论

本研究的主要发现如下：首先，鞘内预先给予DHCR7抑制剂AY9944可以预防胫骨骨折和骨科修复后的持续性机械性痛觉过敏和冷痛觉过敏。其次，通过鞘内途径给予AY9944后可以缓解已建立的慢性骨折疼痛。第三，在骨折疼痛情况下，药理学抑制DHCR7可以限制胆固醇含量的上调、MCP-3分泌、星形胶质细胞激活和脊髓背角中mGluR5表达的增加。第四，脊髓MCP-3的中和通过减少星形胶质细胞激活和mGluR5表达有效提供对骨折相关持续性疼痛的神经保护。第五，重组MCP-3引起的急性疼痛和骨折引起的慢性疼痛都受到mGluR5拮抗作用的抑制。第六，外源性MCP-3足以消除AY9944对骨折疼痛的镇痛效果。因此，这些结果总结了DHCR7抑制剂作为一种慢性疼痛缓解剂的先前未知特性，即通过脊髓抑制MCP-3依赖的星形胶质细胞激活和mGluR5表达。

大量证据表明，星形胶质细胞是多种神经和神经精神疾病的主要调节因子，可能是通过促进和维持神经炎症（Lee等人，2023年）。关键的是，机械性痛觉过敏的行为减弱是由于神经损伤后星形胶质细胞增殖和GFAP表达的减少（Ji等人，2019年）。根据最近的研究，伤害性突触传递和疼痛感知与脊髓背角中星形胶质细胞产生的促炎趋化因子密切相关（Chi等人，2025年；Ji等人，2019年；Xu等人，2025年）。由于星形胶质细胞表达的MCP-3通过与脊髓离子型谷氨酸受体的相互作用在病理疼痛综合征中起重要作用（Qiang和Yu，2019年），我们检查了MCP-3和mGluR5在疼痛行为中的可能联系。在这里，我们首次描述了胫骨骨折小鼠中脊髓MCP-3分泌、GFAP表达和mGluR5水平的升高。此外，这是第一项研究表明，脊髓MCP-3的中和通过控制星形胶质细胞激活和升高的mGluR5表达来减少骨折相关的慢性疼痛。此外，mGluR5拮抗作用可以补偿外源性MCP-3鞘内注射在健康动物中引起的短暂疼痛症状。这些行为和生化发现表明，减轻星形胶质细胞介导的神经炎症可能是慢性疼痛状态的有效治疗策略。然而，骨折如何导致MCP-3释放和星形胶质细胞增生仍需进一步研究。

由于星形胶质细胞在神经炎症中的作用日益重要，胆固醇代谢的异常引起了广泛关注（Ju等人，2025年；Wei等人，2024年；Zhao等人，2025年）。Huang及其同事的一项研究表明，抑制胆固醇过载足以恢复血脑屏障功能，减少星形胶质细胞介导的神经炎症，并改善神经退行性疾病中的认知衰退（Huang等人，2025年）。Du及其同事的另一项研究表明，调节胆固醇代谢可以减轻星形胶质细胞增生和神经炎症，并促进缺血性中风急性期的神经恢复（Du等人，2025年）。然而，胆固醇过载是否以及如何参与慢性疼痛仍不清楚。鉴于DHCR7的上调是胆固醇过载的关键标志（Freitas等人，2024年），我们研究了DHCR7级联反应和胆固醇过载是否介导慢性痛觉过敏。在这里，我们发现胫骨骨折小鼠的脊髓背角中DHCR7水平的持续增加和胆固醇的过度积累，这与慢性冷痛和机械性痛觉过敏的行为表型一致。首次发现，脊髓抑制DHCR7信号传导可以预防和缓解骨折引起的痛觉过敏，在骨科修复的早期和后期阶段。我们还提供了首个证据，证明DHCR7抑制疗法可以限制骨折小鼠中的脊髓胆固醇过载、MCP-3分泌、星形胶质细胞激活和mGluR5表达。值得注意的是，DHCR7抑制后骨折疼痛行为和星形胶质细胞增生的减少在外源性MCP-3暴露后得到了成功消除，这表明MCP-3参与了胆固醇积累介导的星形胶质细胞激活在慢性骨折疼痛中的作用。尽管一些研究报道了脂质积累直接激活星形胶质细胞，但这些研究并未探讨MCP-3是否参与脂质介导的星形胶质细胞激活。与我们的发现一致，最近的文献表明，胆固醇过载会促进NF-κB核转位并触发补体C3的转录激活和炎症介质的释放，间接导致糖尿病相关认知障碍中的星形胶质细胞激活（Niu等人，2025年）。星形胶质细胞向病理变化的激活是复杂的，可能在不同的神经疾病中机制不同。这些关于脂质积累引起的星形胶质细胞激活机制的差异可能归因于不同模型和疾病之间的差异。此外，DHCR7抑制可能会增加7-DHC的水平，7-DHC已被报道为一种氧化还原调节生物分子（Li等人，2024年）。因此，研究7-DHC补充剂是否对慢性骨折疼痛有效将非常有趣。尽管如此，我们的详细实验发现表明，DHCR7抑制通过减少胆固醇过载、MCP-3依赖的星形胶质细胞激活和脊髓背角中的mGluR5表达来预防和缓解骨折引起的持续性痛觉过敏。然而，需要更多的研究来确定骨折如何导致神经元胆固醇代谢异常，从而促进脊髓伤害性神经兴奋。

mGluR5对于病理疼痛条件下兴奋性谷氨酸能突触的传递至关重要，例如长春新碱引起的神经性疼痛（Li等人，2025年）、紫杉醇引起的神经性疼痛（Li等人，2022年）、完全弗氏佐剂（CFA）引起的炎症疼痛（Zhuang等人，2025年）以及阿片类物质引起的痛觉过敏（Zhang等人，2022b）。支持这一观点的是，我们目前的工作还表明，脊髓mGluR5拮抗作用通过减少ERK磷酸化来预防和减轻慢性骨折疼痛行为。然而，脊髓mGluR5/ERK级联反应上调如何促进骨折疼痛中的伤害性突触功能可塑性仍不清楚。最近的文献还强调了树突棘形态发生对于骨折疼痛发展中突触可塑性的必要性（Long等人，2023年；Zhang等人，2021b）。因此，探索mGluR5级联反应与骨折手术后脊柱结构改变之间的潜在相关性将非常有趣。此外，remifentanil引起的痛觉过敏、周围神经性疼痛和骨癌疼痛中的突触可塑性可能因神经元氧化应激而加剧（Ding等人，2023年；Mohsin等人，2025年；Shu等人，2015年）。鉴于活性氧（ROS）生成与胆固醇过载之间的紧密联系（Maniscalchi等人，2024年；Yamada等人，2024年），进一步研究有必要确定氧化损伤是否是DHCR7抑制镇痛机制中的重要下游靶点。

这项研究有几个局限性。首先，鞘内给予的药物或抗体可能会影响脊髓和背根神经节，因此不清楚DHCR7和MCP-3级联反应在背根神经节（DRG）中是否与骨折疼痛有关。其次，尽管使用了重组MCP-3和针对MCP-3的中和抗体来解释DHCR7抑制的镇痛机制，但未来的研究应更多地集中在如何使用遗传工具敲低和过度表达MCP-3基因和蛋白质上。第三，目前尚不清楚MCP-3如何增加mGluR5表达并在慢性骨折疼痛的发展中激活mGluR5功能，这需要进一步研究。第四，我们没有探讨这些有利结果是否适用于其他具有持续性疼痛的群体，如神经性疼痛、内脏疼痛或炎症疼痛患者。除了星形胶质细胞激活外，脊髓小胶质细胞增生还支持神经炎症、突触发生和突触可塑性（Kohno等人，2022年；Malcangio和Sideris-Lampretsas，2025年；Zhang等人，2022a），因此未能识别小胶质细胞依赖的信号传导在神经元胆固醇过载中的可能作用是一个缺点。

5. 结论

总之，本研究首次揭示了DHCR7介导的胆固醇积累促进了脊髓背角中MCP-3依赖的星形胶质细胞激活、mGluR5表达和ERK磷酸化，这与骨折相关的机械性痛觉过敏和冷痛觉过敏行为有关。这些研究结果明确表明，抑制DHCR7、中和MCP-3以及拮抗mGluR5是治疗慢性疼痛的可行策略，具有临床转化开发的潜力。

**缩写说明：**
ANOVA：方差分析（Analysis of Variance）
CFA：完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant）
DHCR7：7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterol reductase）
7-DHC：7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol）
DMSO：二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide）
DRG：背根神经节（Dorsal Root Ganglion）
ELISA：酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）
ERK：细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase）
GFAP：胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibillary Acidic Protein）
IQR：四分位数范围（Interquartile Range）
i.t.：鞘内注射（Intrathecal）
MCP-3：单核细胞趋化蛋白3（Monocyte Chemotactic Protein 3）
mGluR5：代谢型谷氨酸受体5（Metabotropic Glutamate Receptor 5）
MPEP：2-甲基-6-（苯乙炔基）吡啶（2-Methyl-6-(phenylethynyl)pyridine）
OIH：阿片类药物诱发的痛觉过敏（Opioid-Induced Hyperalgesia）
PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-Buffered Saline）
ROS：活性氧（Reactive Oxygen Species）
SEM：均值的标准误差（Standard Error of Mean）

**作者贡献声明：**
马世强（Shiqiang Ma）：项目管理和方法学设计、数据整理。
王恒军（Hengjun Wang）：数据验证、项目管理和方法学设计、实验研究。
王星月（Xingyue Wang）：数据可视化处理、结果验证、项目管理和方法学设计、实验研究。
周浩（Hao Zhou）：研究监督、软件开发与数据分析。
霍振辉（Zhenhui Huo）：数据验证、研究监督、软件开发与数据分析。
李晓明（Xiaoming Li）：数据验证、研究监督、软件开发与数据分析。
傅鑫（Xin Fu）：研究监督、软件开发与数据分析。
刘军（Jun Liu）：论文撰写与修订、初稿撰写、研究监督、数据分析、概念构思。
齐超（Chao Qi）：论文撰写与修订、初稿撰写、项目管理和研究协调、资金申请、数据整理、概念构思。
赵健（Jian Zhao）：论文撰写与修订、初稿撰写、项目管理和方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
郭东辉（Donghui Guo）：论文撰写与修订、初稿撰写、项目管理和方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。