成年及发育中小鼠大脑中自趋化素（一种能生成溶血磷脂酸的酶）的细胞表达与亚细胞定位

《Neuroscience Letters》：Cellular expression and subcellular localization of autotaxin, a lysophosphatidic acid-generating enzyme, in the adult and developing mouse brain

　　立川正則（Masanori Tachikawa）| 深谷正宏（Masahiro Fukaya）| 三浦恵里子（Eriko Miura）| 张正宇（Zhengyu Zhang）| 冈平信一（Shinichi Okudaira）| 高崎千尋（Chihiro Takasaki）| 星谷健一（Ken-ichi Hosoya）| 青木純健（Junken Aoki）| 渡边正彦（Masahiko Watanabe）
日本东北大学药学研究生院膜转运与药物靶点研究组，仙台980-8578

**摘要**
Autotaxin（ATX）是一种能够产生溶血磷脂酸的酶。在本研究中，我们描述了ATX在小鼠大脑中的细胞表达和亚细胞定位情况，从而为理解体内的溶血磷脂酸信号传导提供了基础框架。在发育中和成年小鼠的大脑中，我们都观察到了ATX在脉络丛中的高表达水平。ATX主要定位于脉络丛上皮细胞面向脑脊液（CSF）的顶端侧，这表明ATX倾向于向脑脊液分泌。在少突胶质细胞中检测到高水平的ATX表达，而在神经元和星形胶质细胞中则检测到较低至中等的表达水平。ATX优先定位于细胞质中富含囊泡和内质网的区域。在胚胎期和出生后早期，ATX的免疫标记在神经元胞体及其突起中非常明显，而在放射状胶质细胞/星形胶质细胞中的标记则较弱。在活跃的髓鞘形成阶段，少突胶质细胞中的ATX表达显著上调，并持续到成年期。ATX这种高度调控的、依赖于细胞类型的表达方式表明，它在脑发育和功能中是溶血磷脂酸信号传导的关键调节因子。

**1. 引言**
溶血磷脂酸（LPA）是一种具有生物活性的脂质介质，能够影响多种细胞过程，包括细胞运动、细胞形态变化和增殖（Yung等人，2015年）。LPA在中枢神经系统中起着关键作用，包括调节神经发生、神经元迁移、轴突生成和髓鞘形成（Yung等人，2015年）。LPA主要通过G蛋白偶联的LPA受体发挥作用，这些受体在从胚胎发育到成年的不同脑细胞类型中表现出差异性表达（Choi等人，2010年；Yung等人，2015年）。目前已鉴定出六种LPA受体，并将其分为内皮分化基因（Edg）家族（LPA1–3）和非Edg家族（LPA4–6）。其中，LPA1（其原始名称为ventricular zone gene-1，Hecht等人，1996年）在神经元功能中起最关键的作用。它在大脑皮层的室管膜区（VZ）有显著表达——该区域是神经干细胞或放射状胶质细胞暂时驻留并生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的场所，从而促进大脑发育（Contos等人，2000年）。LPA2受体在皮质板中表达，此处有分裂后的神经母细胞迁移并分化为大脑皮质（Fukushima等人，2002年；McGiffert等人，2002年）。相比之下，其他LPA受体在神经功能中的作用尚未得到充分研究。因此，研究LPA的产生对于全面理解大脑中的LPA信号传导至关重要。
先前的研究表明，LPA在体内通过多种途径产生，至少涉及两种细胞外酶：磷脂酸特异性磷脂酶A1α通过其磷脂酶A1活性将磷脂酸转化为LPA（Sonoda等人，2002年）；而Autotaxin（ATX）通过其溶血磷脂酶D（lysoPLD）活性将溶血磷脂如溶血磷脂酰胆碱（LPC）转化为LPA（Tokumura等人，2002年；Umezu-Goto等人，2002年）。ATX以前体酶的形式合成，经过N-糖基化和蛋白水解成熟后以活性溶血磷脂酶D的形式分泌（Stefan等人，1999年；Stracke等人，1997年；Stracke等人，1992年）。杂合型ATX缺失小鼠能够正常发育，但其血浆中的LPA水平大约仅为野生型小鼠的一半，这证实了ATX在体内LPA产生中的关键作用（Tanaka等人，2006年）。ATX mRNA在胚胎和成年小鼠的大脑中高度表达（Lee等人，1996年；Ohuchi等人，2010年；Ohuchi等人，2007年）。多项研究还报告，在阿尔茨海默病患者的额叶皮质中ATX mRNA和蛋白质水平升高（Umemura等人，2006年），以及在多发性硬化症患者的脑脊液中ATX水平升高（Hammack等人，2004年），这表明ATX在大脑生理和病理中的重要性。然而，由于ATX缺失小鼠在胚胎第10.5天左右因颅神经管闭合障碍和异常血管形成而表现出胚胎致死性（Tanaka等人，2006年），因此ATX在大脑发育和功能中的生理作用尚未完全明确。
先前的原位杂交研究表明，ATX mRNA在小鼠和鸡胚胎大脑的特定区域有表达（Ohuchi等人，2010年；Ohuchi等人，2007年）。尽管如此，由于ATX是一种分泌酶，明确其在蛋白质水平上的细胞表达和亚细胞定位对于理解体内的ATX介导的LPA信号传导至关重要。在本研究中，我们通过生成针对小鼠ATX的特异性抗体，并将其应用于发育中和成年小鼠大脑的免疫组化分析，来解决这一问题。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物和样本制备
C57BL/6 J小鼠使用戊巴比妥（体重每公斤100毫克，腹腔注射）深度麻醉，并在胚胎第15天（E15）、出生后第1天（P1）、P7天、P14天以及成年期（2个月）采集大脑样本。交配后的第二天定义为E0天。使用雄性和雌性小鼠，并随机分配到实验组。按照先前的方法（Tachikawa等人，2005年），在冷冻切片机（CM1900；Leica，Nussloch，德国）上制备胚胎和成年大脑的冷冻切片（厚度20微米）用于原位杂交。对于免疫组化，胚胎大脑先浸泡在Bouin固定剂中，然后制备冷冻切片（厚度30微米）。出生后大脑的切片（厚度50微米）使用微切片机（VT1000S；Leica）制备，之前先通过4%甲醛和0.1 M磷酸钠缓冲液（pH7.4）进行心灌注（Tachikawa等人，2005年）。对于免疫电子显微镜实验，使用4%甲醛/0.1%戊二醛和0.1 M磷酸钠缓冲液（pH7.4）进行灌注。脑脊液和脉络丛样本分别从雄性成年Wistar大鼠（10周龄）的大脑池和侧脑室中获取，这些大鼠在深度麻醉下使用氯胺酮（125毫克/公斤，腹腔注射）和赛拉嗪（1.2毫克/公斤，腹腔注射）。小鼠和大鼠购自Japan SLC公司（静冈，日本）。小鼠和大鼠在温度控制的环境中保持12小时光照/黑暗周期，并可自由获取食物和水。所有动物实验均遵循北海道大学、东北大学、富山大学和德岛大学动物护理委员会的指导原则进行。
2.2. 原位杂交
为了检测小鼠ATX mRNA，化学合成了两种非重叠的反义寡核苷酸（核苷酸序列346–393和758–804；GenBank登录号EU131009.1）。按照先前的方法（Tachikawa等人，2005年；Yamasaki等人，2001年），对这些探针进行[33P]脱氧腺苷5-三磷酸（[33P]dATP）标记、杂交前处理、杂交以及使用X射线胶片和乳剂进行放射自显影。小鼠蛋白脂质（PLP）mRNA（核苷酸序列1–1359；NM_011123）使用地高辛标记的反义cRNA探针进行检测，方法如先前报道（Tachikawa等人，2004年）。
2.3. 抗体制备和免疫印迹
使用豚鼠制备了针对小鼠ATX（EU131009.1）氨基酸残基58–116的多克隆抗体（RRID: AB_2721116），方法如先前报道（Tachikawa等人，2005年）。免疫印迹使用成年小鼠大脑的微粒体 fraction和正常小鼠及ATX杂合小鼠的全细胞裂解物进行，方法如先前报道（Tachikawa等人，2006年）。
2.4. 免疫组化
对于免疫荧光实验，小鼠大脑切片在25°C下与10%正常驴血清孵育30分钟，然后与豚鼠ATX抗体（2微克/毫升）孵育16小时，单独或与以下抗体组合使用：兔脑型脂质结合蛋白（BLBP，1微克/毫升；Yamada等人，2000年；RRID: AB_2571664）；兔钙结合蛋白抗体（1:5000；Nakagawa等人，1998年；RRID: AB_2571568）；兔钙网蛋白抗体（1微克/毫升；Miura等人，2006年；RRID: AB_2571569）；兔钙网蛋白相关蛋白抗体（1微克/毫升；Santa Cruz，sc-7431）；兔组织蛋白酶D抗体（1微克/毫升；Santa Cruz，sc-6494）；小鼠2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNPase）抗体（1:600；C5922，Sigma，圣路易斯，MO）；兔线粒体型肌酸激酶抗体（1微克/毫升；Tachikawa等人，2004年；RRID: AB_2571681）；兔胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（1微克/毫升；Hisano等人，2009年；RRID: AB_2571707）；兔葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）抗体（0.5微克/毫升；Sakai等人，2003年；RRID: AB_2571769）；兔谷氨酰胺酶（1微克/毫升；Hoshino等人，2005年；RRID: AB_251765）；兔微管相关蛋白-2（MAP2）抗体（1微克/毫升；Miura等人，2006年；RRID: AB_2571793）；兔胸腺素β4抗体（1微克/毫升；Sakai等人，2003年）。切片与结合有吲哚花青素（Cy3）、荧光素异硫氰酸酯（FITC）或吲哚花青素（Cy5）的物种特异性二抗孵育2小时（Jackson ImmunoResearch，西格罗夫，PA，美国）。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV1000；Olympus，东京，日本）捕获图像。银增强免疫金染色按照先前的方法进行（Sakai等人，2003年）。简要来说，切片先在4°C下与豚鼠ATX抗体（2微克/毫升）在封闭液中孵育过夜，然后与结合有1.4纳米金的抗豚鼠IgG（1:200；Nanoprobes，石溪，NY，美国）孵育。电子显微照片使用H-7100电子显微镜（Hitachi，东京，日本）拍摄。
2.5. 脑脊液中ATX的绝对蛋白定量
使用NanoLC-MS/MS和多重平行反应监测（PRM）技术，通过定量胰蛋白酶生成的目标肽来确定正常成年大鼠脑脊液和脉络丛中ATX蛋白的绝对表达水平（补充表S1），方法如先前报道（Miyauchi等人，2016年）。分离出的脉络丛悬浮在低渗缓冲液（10 mM Tris–HCl，10 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，pH 7.4）中并超声处理。超声处理后的脉络丛和脑脊液在蛋白质浓度测量后储存于-80°C。样品的溶解、制备和胰蛋白酶预处理按照先前的方法进行（Dehouck等人，2022年）。

**3. 结果**
3.1. ATX抗体的特异性
使用小鼠大脑微粒体 fraction进行的免疫印迹显示，本研究中制备的ATX抗体识别出一个大约100 kDa的单一蛋白质条带（图1A），这与计算出的小鼠ATXβ的分子质量（98,885；UniProt ID: Q9R1E6）一致。当抗体预先与抗原蛋白（100微克/毫升）孵育时，该条带消失（数据未显示）。免疫组化显示，该抗体广泛标记了成年小鼠大脑，其中脉络丛中的标记水平最高（图1B）。在白质中也观察到强烈的信号，包括胼胝体、纤维束、前连合和小脑髓质，以及各种灰质区域。ATX免疫染色的整体模式与X射线胶片宏观放射自显影显示的ATX mRNA表达模式相似（图1C）。乳剂微放射自显影显示，在假定的神经元和胶质细胞的细胞体中标记程度较低至中等（图1D），而在脉络丛中标记程度较高（图1E）。抗ATX抗体还强烈标记了成年小鼠视网膜中的视网膜色素上皮细胞层，其中GLUT1定位于细胞膜上（补充图S1）。

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**图1. ATX抗体的特异性和免疫组化。**
(A) 使用成年小鼠大脑提取物进行的免疫印迹。左侧显示分子质量标记。
(B) 用ATX抗体免疫反应的矢状切片。
(C–E) 成年小鼠大脑中ATX mRNA的原位杂交。
(C) 暴露于X射线胶片的矢状切片。
(D,E) 通过乳剂微放射自显影放大的大脑皮质（D）和脉络丛（E）的明场图像。在(D)中，箭头和箭头分别指示具有小暗核和较大淡核的ATX mRNA阳性细胞，可能是胶质细胞和神经元。切片用苏木精复染。
缩写：AC，前连合；Cb，小脑；CC，胼胝体；ChP，脉络丛；CPu，尾状核-壳核；Cx，大脑皮质；Fi，纤维束；Hi，海马；Hy，下丘脑；LV，侧脑室；Mb，中脑；MO，延髓；OB，嗅球；Po，桥脑；Th，丘脑。
比例尺：B，C，1毫米；D，10微米；E，200微米。
使用ATX杂合小鼠进行的免疫印迹进一步支持了ATX抗体的特异性（Tanaka等人，2006年）。与野生型小鼠相比，ATX杂合小鼠制备的脑匀浆中的ATX条带强度降低（图2），表明ATX抗体的特异性。

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**图2. 野生型小鼠（+/+）和ATX杂合小鼠（+/-）大脑中的ATX免疫印迹。** 杂合小鼠中的ATX条带强度低于野生型小鼠。使用微管蛋白作为蛋白质加载对照。
3.2. 成年大脑中ATX的表达和定位
通过免疫荧光（图3、图4、图5）和银增强预包埋免疫金电子显微镜（图6）检查了成年小鼠大脑多个区域的ATX细胞表达和亚细胞定位。结果表明，ATX在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中均有表达，尤其是在脉络丛和Bergmann胶质细胞中的表达尤为显著。下载：下载高分辨率图像（714KB）下载：下载全尺寸图像图3. 使用豚鼠ATX抗体的免疫荧光。(A) 大脑皮层、胼胝体和海马体中的ATX免疫荧光。(B–G) 大脑皮层(B)、海马CA1区(C)、齿状回(D)、胼胝体(E)和小脑(F)以及脉络丛(G)的放大视图。缩写：CA1，阿蒙角(CA1)区域；CA3，阿蒙角(CA3)区域；CM，小脑髓质；DG，齿状回；Gr，颗粒层；LM，空泡-分子层；Mo，分子层；Or，起源层；PL，浦肯野细胞层；Py，锥体细胞层；Ra，放射层；I-VI，大脑皮层的第I-VI层。其他缩写请参见图1的图例。刻度尺：A，50 μm；B–G 10 μm。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图4. 成年大脑皮层(A–D)、齿状回(E, F)、胼胝体(G, H)和小脑皮层(I, J)中的ATX双重免疫荧光。每个面板的左下角标有红色和绿色荧光通道。(A) MAP2阳性神经元胞浆中的ATX表达。(B) GFAP阳性星形胶质细胞(箭头)和神经元胞浆中的ATX表达。(C) 胸腺素β4阳性小胶质细胞(双箭头)中的ATX表达。箭头表示分散的ATX阳性细胞。(D) GLUT1阳性毛细血管中无ATX表达。(E) 齿状回MAP2阳性颗粒细胞胞浆中的ATX表达。(F) 齿状回BLBP阳性星形胶质细胞(箭头)中的ATX表达。(G) 胼胝体GFAP阳性星形胶质细胞(箭头)中的中等ATX表达。(H) 胼胝体PLP mRNA阳性少突胶质细胞(箭头)中的高ATX表达。(I) P15中的ATX表达。注意，在calbindin阳性树突中的ATX荧光信号较稀疏。其他缩写请参见图1的图例。刻度尺：10 μm。下载：下载高分辨率图像（459KB）下载：下载全尺寸图像图5. 成年大脑皮层(A-C)和脉络丛(D-E)中ATX(红色)和细胞器标记物(绿色)的双重免疫荧光。(A, D) 内质网：calreticulin；(B, E) 溶酶体：cathepsin D；(C) 线粒体：普遍存在的肌酸激酶uCK-Mi。缩写请参见图1的图例。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图6. 银增强免疫金染色显示ATX。(A–C) 大脑皮层。ATX的金属颗粒聚集在某些内质网和核膜上，但在高尔基体、线粒体或溶酶体中未见聚集。突触的质膜偶尔被标记（C，箭头）。Nu，细胞核；Int，神经元末端。(D–E) 小脑。ATX的金属颗粒在Bergmann胶质细胞的囊泡或内质网积聚部分大量聚集，一些颗粒也在围绕浦肯野细胞突触的层状突起中被检测到（箭头）。(F–I) 脉络丛上皮细胞。ATX的金属颗粒呈顶端-基底梯度分布，在面向脑室腔的上皮细胞侧标记更强（F）。一些囊泡和内质网的腔内充满电子密度高的沉淀物（G–I，箭头）。在上皮细胞面向脑室的刷状边缘也发现了弱标记（G和H，箭头）。刻度尺，0.5 μm。大脑皮层中，ATX在II/III层中表达强烈（图3A, 3B），表现为在MAP2标记的神经元胞浆内的微小点状染色（图4A）。这些点状染色部分与主要位于内质网中的Ca2+结合伴侣蛋白calreticulin重叠；然而，一些calreticulin免疫反应结构缺乏ATX免疫标记（图5A），表明ATX定位于内质网的亚区室中。ATX与溶酶体标记物cathepsin D（图5B）和普遍存在的线粒体肌酸激酶uCK-Mi（图5C）互斥。电子显微镜显示，ATX的金属颗粒聚集在内质网和核膜上，但在高尔基体、线粒体或神经元胞浆的溶酶体中未见聚集（图6A–C）。突触的质膜偶尔被标记（图6C，箭头）。非神经元细胞也对ATX具有免疫反应性（图3B, 4A，箭头），并分散在所有皮质层中（图3A）。使用星形胶质细胞标记物GFAP的双重免疫荧光显示GFAP阳性星形胶质细胞胞浆中ATX有中等积累（图4B）。在胸腺素β4阳性小胶质细胞中检测到ATX（图4C，双箭头），尽管其标记强度低于神经元或星形胶质细胞（图4A, 4B）。使用毛细血管标记物GLUT1检测显示GLUT1阳性毛细血管中无ATX标记（图4D）。海马体中，在阿蒙角的MAP2阳性锥体细胞胞浆和齿状回的颗粒细胞中检测到中等水平的ATX（图3A, 3C, 3D, 4E），以及在BLBP标记的星形胶质细胞胞浆中（图3C, 3D, 4F, 箭头）。胼胝体中，在许多细胞中检测到ATX免疫荧光信号（图3A）。ATX在GFAP阳性星形胶质细胞中表达较弱（图4G，箭头），而在GFAP阴性细胞（图4G）的胞浆中则表达强烈，这些细胞被鉴定为表达PLP mRNA的少突胶质细胞（图4H，箭头）。小脑中，ATX主要分布在小脑髓质和浦肯野细胞层（图3F）。在浦肯野细胞层中，calbindin阳性浦肯野细胞的胞浆中观察到中等ATX标记（图4I）。在Bergmann胶质细胞的胞浆和放射纤维中也观察到强ATX标记（图4J，箭头），这是一种特殊的星形胶质细胞类型，其GFAP阳性纤维包裹浦肯野细胞的胞体树突（Yamada和Watanabe，2002）。免疫金电子显微镜显示Bergmann胶质细胞胞浆和轴突纤维的囊泡和内质网富集区域以及围绕浦肯野细胞突触的层状突起中有密集的ATX标记（图6D, E）。脉络丛上皮细胞中观察到强烈的ATX标记（图3G）。ATX的点状标记部分与calreticulin重叠（图5D），但与cathepsin D不重叠（图5E）。免疫金电子显微镜显示ATX标记呈顶端-基底梯度分布，在面向脑室的上皮细胞侧标记更强（图6F）。富含囊泡和内质网的顶端细胞质中含有丰富的ATX标记（图6G-I）。偶尔，一些囊泡和内质网的腔内充满电子密度高的沉淀物（图6G，箭头）。3.3. 脉络丛和脑脊液中ATX的蛋白质定量接下来，我们使用nanoLC-MS/MS方法对脉络丛和脑脊液中的ATX进行了绝对蛋白质定量。从四只大鼠中提取的脉络丛样本的平均ATX蛋白质水平为9.45±0.33 fmol/μg蛋白质（平均值±标准误差，基于每次分析的四个MS/MS转化）。如表1所示，脑脊液中的ATX蛋白质水平范围为78.5至99.2 fmol/μg脑脊液蛋白质，相当于脑脊液中ATX浓度为15.7至21.7 fmol/μL。表1. 大鼠脑脊液中ATX的蛋白质表达水平和浓度。空细胞ATX蛋白质水平(fmol/μg脑脊液蛋白质)总蛋白质浓度(μg/μL脑脊液)ATX蛋白质浓度(fmol/μL脑脊液)大鼠#1大鼠#2大鼠#3大鼠#493.3±4.778.5±3.499.2±1.878.6±4.10.2070.2460.2130.19919.319.321.115.7脑脊液中每个ATX蛋白质水平的定量值代表一次分析中四个MS/MS转化确定的定量值的平均值±标准误差。脑脊液中的每个ATX蛋白质浓度是根据脑脊液中的ATX蛋白质水平和总蛋白质浓度计算得出的。3.4. ATX的发育表达通过原位杂交技术检测了从E13到P21发育中小鼠大脑中ATX mRNA的时空表达（图7）。杂交信号的特异性通过两个不重叠探针的一致模式以及在过量未标记探针存在下无杂交信号得到确认（数据未显示）。下载：下载高分辨率图像（178KB）下载：下载全尺寸图像图7. 发育中和成年小鼠大脑中ATX mRNA的原位杂交。E13（A）、E18（B）、P7（C）、P14（D）和P21（E）的矢状脑切片用特异性针对小鼠ATX mRNA的寡核苷酸探针进行杂交。所有照片都是从X射线胶片自显影得到的阳性图像。刻度尺：1 mm。Aq；导水管，Cb；小脑，CC；胼胝体，ChP；脉络丛，CP；皮质板，CPu；尾状核-壳核，Cx；大脑皮层，GE；神经节隆起，Hi；海马体，LV；侧脑室，Mb；中脑，MO；延髓，OB；嗅球，Po；桥脑，Th；丘脑，V4；第四脑室。在E13时，ATX mRNA在胚胎脑壁中广泛存在，在脑室区的水平高于 mantle 区（图7A）。在E18时，包括大脑皮层的皮质板和嗅球在内的整个 mantle 区显著增强（图7B）。从出生到成年，ATX mRNA在各种灰质区域保持中等表达，除了深层皮质层、海马体、尾状核-壳核和小脑皮质（图1C, 7C-E）。在P14和P21时，白质区域（如胼胝体和小脑髓质）也观察到显著的上调（图7D, 7E）。在整个发育过程中，脉络丛中也观察到强烈的信号（图1C, 1E, 7A–E）。3.5. 发育中大脑中ATX的细胞表达最后，我们通过免疫荧光技术检测了发育中小鼠大脑中ATX的细胞表达（图8）。在E15的大脑皮层中，ATX在皮质板中强烈标记，在脑室区中标记较弱（图8A）。在皮质板中，点状免疫标记密集分布在MAP2阳性神经元胞浆和突起中（图8B）。随着皮质层的发展，P1时神经元胞浆和树突突起中的强烈ATX标记持续存在（图8C, 8D）和P7时（图8E, 8G）。在P14时，IV–VI层的神经元表达显著下调（图8H）以及II/III层神经元的树突突起中（图8I），形成了成年的皮质标记模式。相比之下，从E15到P1，BLBP阳性放射胶质细胞/星形胶质细胞谱系中的ATX免疫标记非常微弱（图8B, 8D）。在P7时（图8F）和P14时（图8I），星形胶质细胞的表达强度增加。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图8. E15（A和B）、P1（C和D）、P7（E–G）和P14（H和I）的大脑皮层中ATX免疫荧光的发育变化，P7（J）和P14（K）的胼胝体，以及P7（L和M）和P14（N和O）的小脑。所有面板中，ATX均以红色显示。绿色和蓝色荧光在每个面板的左下角标明。(B, D, I–K) ATX、MAP2和BLBP的三重免疫荧光。(F) ATX和BLBP的双重免疫荧光。(G) ATX、谷氨酰胺酶和BLBP的三重免疫荧光。(L–O) ATX、calbindin和BLBP的三重免疫荧光。(B2和D2) E15和P1时皮质板中MAP2阳性神经元胞浆和树突中的ATX表达。(B3和D3) E15和P1时BLBP阳性放射胶质细胞（D3中的箭头）中ATX的缺乏。(F) P7时BLBP阳性星形胶质细胞（箭头）中的中等ATX表达。(G) P7时谷氨酰胺酶阳性神经元胞浆（n）和干细胞突起以及BLBP阳性星形胶质细胞（箭头）中的ATX表达。(I) P14时MAP2阳性神经元胞浆（n）和BLBP阳性星形胶质细胞（箭头）中的ATX表达。注意，P14时ATX免疫荧光的强度在缺乏GFAP的细胞中显著增加（箭头）。(L和M) P7时calbindin阳性浦肯野细胞（PC）细胞体和树突以及BLBP阳性星形胶质细胞和Bergmann胶质细胞（箭头）中的ATX表达。注意，在小脑髓质中出现了强烈标记为ATX的BLBP阴性细胞（箭头）。EGL，外部颗粒层；IGL，内部颗粒层；MZ，边缘区；CP，皮质板；IZ，中间区；SP，亚板；VZ，脑室区。其他缩写请参见图1和图3的图例。比例尺：A、C、E、H，50微米；B、D、F、G、I-O，10微米。在P7期的胼胝体中，ATX免疫标记在BLBP阳性的星形胶质细胞中检测到中等强度（图8J，箭头所示），而在BLBP阴性的立方形细胞中检测到较弱强度（图8J，箭头所示）。星形胶质细胞中的ATX表达在P14期仍然存在（图8K，箭头所示）。此时，BLBP阴性细胞中的标记显著增强（图8K，箭头所示）。这些细胞被鉴定为少突胶质细胞，因为它们的强信号被CNPase阳性的少突胶质细胞纤维所包围（补充图S2）。在P7期的小脑中，在calbindin阳性的浦肯野细胞胞体和树突中检测到强烈的ATX标记（图8L、8M）。在P14期，浦肯野细胞中的ATX表达下调，尤其是在其树突中，导致ATX表达仅限于浦肯野细胞胞体（图8N、8O）。在P7期和P14期，也在BLBP阳性的星形胶质细胞和Bergmann胶质细胞中检测到强烈的ATX标记（图8M、8O，箭头所示）。在小脑髓质中，P14期出现强烈ATX标记的细胞（图8N，箭头所示）；它们的信号被CNPase阳性的少突胶质细胞纤维所包围（补充图S2）。这些强烈ATX标记的细胞被判断为少突胶质细胞。

4. 讨论
在本研究中，我们通过开发一种适用于免疫印迹、免疫荧光和免疫电子显微镜的特异性抗体来研究ATX蛋白的表达。我们描述了ATX在成年和发育中的小鼠大脑中的细胞表达和亚细胞定位。我们在脉络丛、少突胶质细胞和视网膜色素上皮细胞中观察到的高ATX表达水平与先前的研究结果一致（Fox等人，2003年；Fuss等人，1997年；Liu等人，2022年；Narita等人，1994年；Savaskan等人，2007年）。此外，我们的研究还定义了神经元和星形胶质细胞中ATX的低至中等表达，并提供了ATX的详细电子显微镜定位。

矩阵辅助激光解吸电离-质谱成像结合组织上的Phos-tag衍生化技术显示，18:1 LPA、18:2 LPA和20:4 LPA的强烈信号分布在成年小鼠大脑的白质中，包括胼胝体、小脑髓质和延髓（Iwama等人，2021年）。此外，在特定的皮层层中也检测到强烈的20:4 LPA信号（Iwama等人，2021年）。18:1 LPA、18:2 LPA和20:4 LPA的这些分布模式与成年小鼠大脑中ATX mRNA和蛋白质的空间分布高度一致。ATX的底物LPC可以通过磷脂酶A2介导的膜磷脂酰胆碱水解在脑实质中局部生成（Farooqui和Horrocks，2006年）。LPC还可以通过血脑屏障从循环血液转运到大脑（Alberghina等人，1994年；Nguyen等人，2014年）。这些发现支持LPC可能存在于脑间质液中，这可能足以作为ATX介导的LPA产生的底物的观点。因此，ATX可能作为负责大脑局部LPA产生的关键酶。

在本研究中，使用了两种性别的小鼠，并随机分配到实验组。越来越多的证据表明大脑发育和功能存在性别差异（Cosgrove等人，2007年；Manoli和Tollkuhn，2018年）。先前的研究报告称，青少年（男性中位年龄：13岁，女性：14岁）的循环ATX水平没有显著差异（Meaux等人，2023年），这与成年群体中观察到的性别差异相反（Nakamura等人，2008年）。在健康成年人中，女性的血清ATX水平大约是男性的1.4倍（Nakamura等人，2008年）。这些发现表明，在未来研究中探讨发育中和成年大脑中ATX表达的性别差异将非常有趣。

4.1. 脉络丛中的ATX
原位杂交和免疫荧光分析表明，脉络丛是ATX在mRNA和蛋白质水平上主要表达的部位。银强化免疫金显微镜显示，ATX的金属颗粒在脉络丛上皮细胞中丰富，特别是在朝向脑室的顶端侧。此外，比较脉络丛和脑脊液（CSF）中每微克蛋白质的摩尔浓度时，ATX蛋白在脑脊液中明显富集。这些发现强烈表明脉络丛衍生的ATX被主动分泌到脑脊液中。

先前通过向分化的PC12细胞添加脑脊液或重组ATX后进行神经突起收缩生物测定，证明了脑脊液中存在ATX介导的lysoPLD活性（Sato等人，2005年）。在那项研究中，还提出软脑膜是脑脊液中ATX的另一个来源，这是基于对培养的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和软脑膜细胞的条件培养基中lysoPLD活性和ATX蛋白水平的比较测量。软脑膜——包括蛛网膜和软脑膜——覆盖大脑实质的外表面，脑脊液填充在它们之间的蛛网膜下腔。因此，当前和先前的研究共同表明，脉络丛上皮细胞和软脑膜细胞是脑脊液中ATX的两个主要来源。此外，脑脊液中的ATX蛋白水平可能反映了这些组织的功能状态。值得注意的是，通过酶法比色法在正常人脑脊液中检测不到LPC，即使在37°C下单独孵育脑脊液6小时后也检测不到LPA（Yatomi等人，2018年），这表明在正常条件下，脑脊液中分泌的ATX可能会扩散到脑实质中，尽管ATX在脉络丛和软脑膜中占主导表达的原因尚不清楚。在腰椎管狭窄的患者中，报告了脑脊液中LPC和LPA水平升高，这可能导致神经病理性疼痛（Uranbileg等人，2021年）。可以推测，脑脊液中LPC水平的升高会导致通过ATX产生的病理性LPA过量。

最近的研究进一步表明，在多发性硬化症（Zahednasab等人，2014年）、重度抑郁症（Itagaki等人，2019年）、轻度认知障碍和阿尔茨海默病（McLimans等人，2017年）患者的脑脊液中ATX活性或蛋白水平升高。在本研究中，基于nanoLC-MS/MS的定量靶向蛋白质组学确定大鼠脑脊液中的ATX蛋白绝对量为15.7–21.7 fmol/μL。Nakamura等人（2009年）通过酶免疫测定报告正常人脑脊液中的ATX平均浓度为1.32 mg/L（约13.3 fmol/μL），假设人类ATXβ的分子量为98,994 Da（UniProt ID；Q13822），这与我们的定量数据一致（Nakamura等人，2009年）。因此，绝对ATX蛋白水平可能作为神经系统疾病的潜在生物标志物（Yaginuma等人，2023年）。由于从小鼠中获得无血液污染的足够体积的脑脊液在技术上具有挑战性，因此使用大鼠来量化脉络丛和脑脊液中的ATX蛋白。重要的是，由于ATX在血液循环中含量丰富（Nakamura等人，2008年），即使是最微量的污染也可能导致脑脊液中ATX水平的显著高估。鉴于大鼠（预设研究）和人类（Nakamura等人，2009年）的脑脊液中ATX蛋白水平相当，使用大鼠是合适的，这些发现可能广泛适用于包括小鼠在内的多种物种。

4.2. 神经元中的ATX
我们证明了神经元中的ATX表达：在成年大脑皮层中，ATX主要定位于II/III层神经元的胞体中；在胚胎和早期产后皮层中，皮层板中的各种神经元比脑室区的神经干细胞或神经母细胞更显著地表达ATX。在皮层板内，ATX不仅分布在胞体中，还分布在年轻皮层神经元的突起过程中。这些表达谱突显了ATX在细胞分化过程中的上调。这与先前的研究一致，即与脑室区的神经母细胞相比，后有丝分裂神经元更倾向于产生细胞外LPA（Fukushima等人，2000年）。LPA通过激活LPA1受体促进皮层神经母细胞向神经元谱系分化（Fukushima等人，2007年；Kingsbury等人，2003年），并调节年轻神经元的形态、运动能力和存活（Fukushima等人，2002年）。此外，LPA作为一种短暂的、可逆的排斥剂，可诱导肌动蛋白细胞骨架的重排（Fukushima，2004年）。响应LPA，年轻神经元表现出神经突起收缩和圆形化，而成熟神经元则表现出生长锥体塌陷或转向。因此，表达高水平ATX的年轻皮层神经元，连同脉络丛上皮细胞和软脑膜细胞，可能在活跃的皮层发生过程中调节LPA浓度方面起核心作用。

4.3. 少突胶质细胞中的ATX
在P14期观察到少突胶质细胞中ATX显著上调，这种表达水平持续到成年期。这种时间轮廓与LPA1受体的表达和活跃髓鞘形成的开始相平行（Birgbauer和Chun，2006年；Weiner等人，1998年）。鞘内注射LPA会在野生型小鼠的背根中诱导脱髓鞘，但在LPA1受体敲除小鼠中不会（Inoue等人，2004年）。相反，比较蛋白质组学确定ATX是多发性硬化症样本中四种独特蛋白质之一（Hammack等人，2004年）。这些发现共同表明，ATX介导的LPA信号在生理条件下参与髓鞘的形成和维持，在病理条件下参与脱髓鞘。

除了LPA合成外，ATX还作为少突胶质细胞重塑和局部粘附组织的调节因子（Yuelling和Fuss，2008年）。通过这种功能，ATX拮抗少突胶质细胞对细胞外基质蛋白的粘附并改变局部粘附激酶的组装（Fox等人，2004年；Fox等人，2003年）。因此，少突胶质细胞中丰富的ATX表达可能同时具有酶学和结构调节作用。

4.4. 星形胶质细胞中的ATX
神经发生之后，脑室区的神经干细胞或放射状胶质细胞迁移并产生星形胶质细胞（Gressens等人，1992年；Misson等人，1991年；Yamasaki等人，2001年）。在皮层板中，E15期和P1期BLBP阳性星形胶质细胞中的ATX表达非常低，但在P7期及以后增加到中等水平。小脑皮层是一个例外，即使在成年期，Bergmann胶质细胞也表现出强烈的ATX表达。使用培养的星形胶质细胞进行的体外研究表明，LPA可以刺激增殖并抑制葡萄糖和谷氨酸的摄取（Fukushima，2004年）。将LPA注射到纹状体中会诱导星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成（Sorensen等人，2003年）。尽管有一项先前的研究报道正常成年大脑的星形胶质细胞中未检测到ATX表达（Savaskan等人，2007年），但它显示在损伤和去神经化区域GFAP阳性星形胶质细胞中ATX在损伤后显著上调。因此，在生理条件下表达中等水平ATX的星形胶质细胞在病理条件下可能会显著上调ATX。反应性星形胶质细胞中升高的ATX可能增加细胞外LPA的产生，从而促进受损区域的胶质增生和瘢痕形成。

4.5. 内质网（ER）和囊泡中的ATX
在所有表达ATX的细胞类型中，该蛋白表现为微小的细胞质点，部分与calreticulin阳性结构重叠。免疫金电子显微镜显示，ATX优先定位于富含囊泡和内质网的细胞质区域。在某些情况下，扩散的银沉淀物——可能是由于银颗粒的熔化或氧化——填充了囊泡和内质网的腔体。这种亚细胞定位与先前的研究一致（Savaskan等人，2007年），该研究表明GFP标记的人类ATX定位于COS和HEK293细胞中的囊泡样细胞质结构中，而内源性ATX则存在于软脑膜细胞、少突胶质细胞和反应性星形胶质细胞中的囊泡样结构中。他们还显示ATX与EEA1（早期内体标记物）重叠，但不与clathrin（内吞囊泡标记物）重叠。ATX在其N端具有proprotein转化酶切割位点，随后是几个功能域，包括催化性磷酸二酯酶域和C端核酸酶样域（Perrakis和Moolenaar，2014年）。转化酶将ATX切割成N端信号肽和活性分泌形式（Jansen等人，2005年；Koike等人，2006年；van der Giet等人，2008年）。据提出，ATX通过内质网-高尔基体分泌途径处理，并持续释放到细胞外空间（Lyu等人，2017年；Pradere等人，2007年；Zhang等人，2021年）。ATX在内质网、囊泡和早期内体中的定位与其通过分泌途径分泌一致。偶尔在突触和微绒毛质膜上出现的低水平标记可能表明分泌的ATX用于细胞外LPA的合成，尽管ATX是否储存在储存囊泡中以进行快速和刺激依赖性释放尚不清楚。研究还表明，细胞外的LPA可以直接抑制ATX的催化活性（van Meeteren等人，2005年），并且LPA作为ATX mRNA表达的反馈抑制剂（Benesch等人，2015年）。进一步探讨LPA介导的ATX分泌调控的潜在机制将具有重要的研究价值。McIntyre等人发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）——一种调控能量代谢基因的核因子（Auwerx，1999年）——是LPA的细胞内受体（McIntyre等人，2003年）。阐明与囊泡相关的ATX是否以及如何参与细胞内LPA的生成从而激活PPARγ仍然是一个重要的问题。

5. 结论
对成年和发育中小鼠大脑中ATX的细胞表达和亚细胞定位的研究表明，ATX在脉络丛中无论是发育阶段还是成年期都高度表达，主要位于面对脑脊液（CSF）的顶端区域。此外，ATX在神经元细胞体及其突起中的表达在胚胎期和出生后早期最为显著；而在活跃的髓鞘形成过程中，少突胶质细胞中的ATX表达显著增加。ATX的高度调控性和细胞类型依赖性表达表明，它在大脑发育和功能中作为LPA信号传导的关键调节因子发挥作用。

**资助**
本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI项目（项目编号JP22689005、JP25670067、JP16K08364、JP23K24231）以及德岛大学研究集群计划的支持。

**作者贡献声明**
- Takasaki Chihiro：撰写、审稿与编辑、方法学、实验设计。
- Hosoya Ken-ichi：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供、概念构思。
- Aoki Junken：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、资源提供、方法学、实验设计、概念构思。
- Watanabe Masahiko：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学、实验设计、资金筹集、概念构思。
- Tachikawa Masanori：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学、实验设计、资金筹集、概念构思。
- Fukaya Masahiro：撰写、审稿与编辑、方法学、实验设计。
- Miura Eriko：撰写、审稿与编辑、方法学、实验设计。
- Zhang Zhengyu：撰写、审稿与编辑、方法学、实验设计。
- Okudaira Shinichi：方法学、实验设计。