《NeuroToxicology》：Lysosomal dysfunction contributes to lead (Pb) and High-Fat Diet (HFD)-induced neuronal apoptosis: a link with cathepsin B
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袁永科|刘梦晨|翟梦迪|吴美佳|张文慧|辛永娟|巴月|张宇|韩琳|高丽华|黄辉中国河南省郑州市郑州大学公共卫生学院环境卫生系，邮编450001摘要已知环境中的铅（Pb）暴露和高脂肪饮食（HFD）摄入会引发大规模的神经元凋亡，从而导致神经功能障碍。以往的研究主要集中在孤立的线粒体功
袁永科|刘梦晨|翟梦迪|吴美佳|张文慧|辛永娟|巴月|张宇|韩琳|高丽华|黄辉
中国河南省郑州市郑州大学公共卫生学院环境卫生系，邮编450001
摘要
已知环境中的铅（Pb）暴露和高脂肪饮食（HFD）摄入会引发大规模的神经元凋亡，从而导致神经功能障碍。以往的研究主要集中在孤立的线粒体功能障碍、自噬-溶酶体途径损伤以及由铅或高脂肪饮食引起的神经元凋亡上。然而，溶酶体和蛋白酶体清除过程在促进铅和高脂肪饮食诱导的神经元细胞死亡中的确切作用仍不清楚。本研究使用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠来阐明铅诱导的神经毒性线粒体凋亡的机制，并探讨同时暴露于高脂肪饮食的影响。体外实验中，PC12细胞被铅和棕榈酸（PA）处理，以模拟体内条件。具体而言，这种暴露导致组织蛋白酶B（CTSB）从溶酶体转移到细胞质中，以及溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）、ATP酶H?转运V1亚基A（ATP6V1A）和Bcl-2在大鼠皮层中的表达下调。相反，包括BID、Bax、线粒体细胞色素C（Cyt C）和caspase 3在内的促凋亡因子水平显著升高。我们还观察到溶酶体的荧光强度显著下降，同时溶酶体pH值显著上升。此外，通过CA-074抑制CTSB可以防止铅和/或棕榈酸引发的神经元凋亡过程，这表明CTSB是铅和高脂肪饮食诱导的凋亡过程中的关键介质。
引言
健康指标与评估研究所（IHME）估计，仅2017年，铅暴露就导致了106万人死亡和2440万人患病，低收入和中等收入国家承受了最大的负担（Rubin，2017）。由于其不可生物降解的性质，铅仍然是一个重大的全球公共卫生问题（Levin等人，2021）。体内的铅含量在很大程度上取决于饮食摄入，并与饮食模式密切相关（Kinally等人，2025）。随着经济发展和生活水平的提高，高热量饮食（如高脂肪饮食）在全球范围内日益普遍。目前，由高脂肪饮食引起的超重或肥胖已成为一个主要的公共卫生问题（Hu，2011）。数据显示，每年至少有280万人死于与肥胖相关的并发症，如代谢综合征、高血压、2型糖尿病和高胆固醇（Hancková和Betáková，2021）。研究表明，脂质代谢与中枢神经系统功能障碍密切相关；棕榈酸（PA）是体内最常见的饱和脂肪酸，在高脂肪饮食下其在血液中的含量显著升高，这使其成为中枢神经系统脂毒性的重要研究对象（Dirkx等人，2011；Saipuljumri等人，2025）。一项横断面研究发现，面包、大米、油炸食品和蔬菜与孕妇血液中铅水平升高呈正相关，表明在加工、包装和储存过程中可能发生了铅污染（Naeem等人，2021）。
研究还证实，农业土壤受到人为活动产生的有毒重金属污染的威胁，导致食物作物中砷、镉、铅和汞的过量积累，对人类健康构成风险（Zhao等人，2022）。高脂肪饮食模式的趋势正在增加，研究表明体重指数（BMI）与血液中铅水平显著相关（Hernández-Mendoza等人，2022），这表明超重人群可能会因铅暴露而加重神经损伤。此外，高脂肪饮食引起的神经发育和细胞变化与铅在大脑病理生理学中引起的变化相似（Liu等人，2022；Li等人，2021）。高脂肪饮食会促进大脑组织中的病理过程，如神经炎症、氧化应激、凋亡和线粒体功能障碍，从而破坏神经元功能并降低认知能力（Tan和Norhaizan，2019；Chunchai等人，2019）。然而，目前尚不清楚同时暴露于铅和高脂肪饮食是否会加剧或减轻神经元凋亡。
线粒体作为真核细胞中的关键细胞器，在能量代谢、氧化还原平衡维持和凋亡调节中起着核心作用（Bock和Tait，2020；Evans和Neuman，2016）。研究表明，线粒体控制着凋亡过程的许多关键方面。各种刺激会触发凋亡信号传导，最终传递到线粒体。抗凋亡蛋白Bcl-2位于线粒体膜上，其过表达可以保护神经元细胞免受神经毒素的损伤（Kale等人，2018）。促凋亡蛋白Bax位于细胞质中，在接收到凋亡信号后转移到线粒体表面并在线粒体膜上形成孔洞，导致膜电位降低和膜通透性增加，从而促进细胞色素C（Cyt C）释放到细胞质中（Gómez-Crisóstomo等人，2013），并激活凋亡级联反应（Petit，2025）。最近的研究表明，在暴露于铅的神经元中可以检测到线粒体膜电位（MMP）和Cyt C氧化酶活性的降低，导致线粒体功能障碍和选择性神经元细胞死亡（Bandaru等人，2023）。此外，糖尿病小鼠大脑皮层中的高脂肪饮食诱导的线粒体功能障碍伴随着促凋亡蛋白的显著增加（Liu等人，2020a）。这些证据表明，神经元凋亡可能是铅暴露和高脂肪饮食导致神经损伤的重要原因。
先前关于细胞凋亡机制的研究表明，位于溶酶体中的组织蛋白酶也参与凋亡过程（Voronina等人，2024）。值得注意的是，组织蛋白酶B（CTSB）是凋亡途径的关键介质，在细胞凋亡中起调节作用（Xue等人，2026）。此外，CTSB在神经元中含量丰富，显著减轻神经炎症并减少神经元细胞死亡（Chen等人，2021；Jia等人，2025a）。此外，ATP酶H?转运V1亚基A（ATP6V1A）被证实可以维持溶酶体内的酸性环境，而溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）对于维持溶酶体膜稳定性和防止溶酶体膜通透性增加至关重要（Tanaka等人，2022）。Terman等人首次提出的溶酶体-线粒体轴强调了溶酶体和线粒体之间的相互作用。在这个途径中，LMP导致多种蛋白酶（如CTSB）泄漏到细胞质中。这些蛋白酶切割并激活Bid，后者随后转移到线粒体。随后线粒体外膜的通透性增加，促进Cyt C释放到细胞质中，从而激活caspase家族蛋白并触发凋亡（Terman等人，2006；Aufy等人，2023）。研究表明，铅暴露会通过降低LAMP1水平显著减少溶酶体的数量和大小，从而抑制溶酶体的生物发生和活性，并导致神经元细胞中的自噬损伤（Gu等人，2019）。同样，高脂肪饮食也会通过诱导线粒体功能障碍和自噬-溶酶体途径的异常来激活神经胶质细胞（Preeti等人，2023）。上述研究促使我们探讨溶酶体-线粒体轴在铅和高脂肪饮食共同暴露诱导神经元凋亡中的作用。
总之，铅暴露或高脂肪饮食引起的神经元存活受损和认知缺陷表现出相似性。基于这些相似性，建立了Sprague-Dawley（SD）大鼠模型来研究铅暴露和高脂肪饮食摄入的影响。通过观察这些大鼠皮层神经元在铅和高脂肪饮食作用下的凋亡情况，本研究旨在探讨CTSB是否激活线粒体凋亡途径。通过检测溶酶体功能相关分子（LAMP1、ATP6V1A、CTSB）和线粒体凋亡相关分子（BID、Bcl-2、Bax、Cyt C、切割的caspase-3）的表达，以及CTSB在大脑皮层中的定位，本研究探讨了铅暴露和高脂肪饮食摄入通过溶酶体-线粒体轴诱导神经元凋亡的机制。此外，还建立了使用PC12细胞的体外暴露模型，以进一步验证CTSB在线粒体凋亡途径中的作用。在本研究中，我们提供了证据，证明铅暴露和高脂肪饮食的摄入可能通过CTSB的泄漏触发神经毒性，进而激活线粒体凋亡途径。此外，利用我们的体外铅和棕榈酸毒性模型，我们证明了CTSB水平可以通过溶酶体-线粒体轴调节神经元凋亡。
章节片段
材料
Trizol试剂（Cat# 9108）、One Step Prime Script? RNA cDNA合成试剂盒（RR055A）和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（RR390A）均购自Takara Bio Inc.（位于日本滋贺县大津）。Anti-CTSB抗体（#31718）来自Cell Signaling Technology（位于美国马萨诸塞州丹弗斯）。Anti-Bax抗体（ab32503）购自Abcam（位于美国马萨诸塞州剑桥）。LAMP1（BA2787-2）和ATP6V1A（A10401-2）抗体购自BOSTER（位于中国武汉）。
铅和高脂肪饮食暴露对大鼠体重和血液中铅水平的影响
为了确认成功建立了同时暴露于铅和高脂肪饮食的动物模型，我们首先测量了大鼠的体重和血液中铅水平。双向ANOVA显示，铅暴露和高脂肪饮食对大鼠的体重和血液中铅水平都有协同作用。随后的事后分析表明，铅暴露组和大鼠与高脂肪饮食共同暴露组的体重显著下降，而它们的血液中铅水平显著升高。
讨论
近年来，新兴研究强调了环境重金属暴露（尤其是铅）和饮食不平衡（如高脂肪饮食）对神经系统结构和功能的不良影响（Spencer等人，2017；Karri等人，2016）。本研究清楚地表明，铅和高脂肪饮食的暴露导致大鼠皮层中的溶酶体膜通透性增加。这种膜通透性增加使得CTSB得以释放
伦理批准
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。得到了郑州大学伦理委员会的批准（批准编号：ZZU20190310）。
数据可用性
用于支持本研究结论的所有数据和方法均可用。
资助
本研究得到了河南省关键技术研发与推广技术项目基金（232102311065）的支持。
CRediT作者贡献声明
巴月：撰写 – 审稿与编辑。张宇：数据管理。张文慧：研究。辛永娟：数据管理。翟梦迪：数据管理。吴美佳：数据管理。袁永科：撰写 – 初稿，研究。刘梦晨：方法学，研究，概念化。高丽华：研究。黄辉：监督，资源，项目管理，资金获取。韩琳：研究。
利益冲突声明
作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。
