《New Biotechnology》：Vitrification-based tissue-to-organoid cryopreservation workflow for colorectal cancer
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患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）已成为捕获人类肿瘤生物学和治疗复杂性的有力临床前模型。然而，从每个手术标本常规建立PDOs耗时、昂贵且往往不必要，因为可操作病例仅在组织病理学或基因组分析后才被确定。在本研究中，研
患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）已成为捕获人类肿瘤生物学和治疗复杂性的有力临床前模型。然而，从每个手术标本常规建立PDOs耗时、昂贵且往往不必要，因为可操作病例仅在组织病理学或基因组分析后才被确定。在本研究中，研究人员开发并评估了一种基于玻璃化冷冻（vitrification-based）的组织冷冻保存方法，该方法能够从结直肠癌（colorectal cancer, CRC）标本中实现按需PDO生成，解决了传统流程的实际限制，包括劳动密集型处理和有限的按需PDO生成灵活性。使用多种玻璃化冷冻配方（包括含III型抗冻蛋白（antifreeze protein, AFP）的条件）对肿瘤组织进行冷冻保存，并评估解冻后的类器官恢复情况。在测试的Condition中，一种由乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖和III型AFP组成的配方（CS#2）显示出最一致的类器官恢复，并支持解冻后生长、上皮形态和早期扩增行为的保留，与匹配的新鲜PDOs相似。在匹配的PDO模型中，来自冷冻保存组织的类器官显示的药物反应模式与新鲜PDOs广泛可比，提供证据表明功能性反应可能在组织冷冻保存后得以保留。总之，这些发现支持了一种实用的CRC组织到类器官生物样本库流程的可行性，该流程能够实现灵活的、时间独立的PDO生成，并促进PDO-based功能研究在转化研究流程中的更广泛实施。
论文解读
研究背景与意义
患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）作为能忠实反映人类肿瘤遗传、表型和功能复杂性的临床前模型，在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）研究中具有重要价值，但传统PDO建立需立即处理新鲜组织，存在资源密集、依赖技术专长、难以规模化等问题。冷冻保存技术虽常用于生殖材料，但实体瘤因多细胞结构和致密细胞外基质导致冷冻保护剂渗透受限，现有组织到类器官（tissue-to-organoid）流程仍面临挑战。因此，开发实用的组织冷冻保存方法以实现按需PDO生成，成为推动PDO在转化研究中广泛应用的关键。该研究发表于《New Biotechnology》，旨在建立标准化、可重复的组织到类器官流程，为临床生物样本库和PDO规模化应用提供解决方案。
关键技术方法
研究纳入经病理确诊的CRC腺癌标本，分为新鲜PDO（fPDO）、组织冷冻PDO（ctPDO）和细胞冷冻PDO（ccPDO）三组。采用玻璃化冷冻技术，测试含III型抗冻蛋白（AFP type III）的多种冷冻保存溶液（CSs），包括Control（10% DMSO）及CS#1-CS#4。通过苏木精-伊红（H&E）染色和EpCAM免疫组化评估组织形态学，采用CellTiter-Glo? 3D细胞活力 assay检测药物反应，利用液滴数字PCR（droplet digital PCR）分析KRAS突变，通过混合效应模型等统计方法比较组间差异。
研究结果
筛选确定CS#2和CS#4为最有效冷冻保存溶液
研究人员首先通过5例CRC标本（001T-005T）筛选5种CSs，结果显示CS#2和CS#4在ctPDO恢复率上显著优于Control（DMSO基），其中CS#2在所有测试标本中均成功生成类器官，且解冻后生长特性接近fPDO。
ctPDOs保留形态学特征及解冻后生长恢复
对7例标本的比较显示，CS#2和CS#4来源的ctPDOs在连续传代中保持了CRC类器官的特征性腺体和囊状结构，与fPDOs形态一致；虽首次传代时间略长于fPDOs（16.8±6.3天 vs 10.6±5.1天），但后续扩增能力与fPDOs相当。组织与细胞冷冻方式对比表明，组织冷冻（ctPDO）比细胞冷冻（ccPDO）更能稳定支持类器官生成，ccPDO仅短暂形成类器官样结构后退化。
进一步验证确认CS#2为最一致冷冻保存溶液
扩大至9例CRC标本的验证显示，CS#2组ctPDO初始生成率达100%，其中5例标本的ctPDOs在后续传代中保持稳健扩增，即使对应fPDOs生长不佳的标本（如008T），CS#2仍能支持其ctPDOs持续生长。病理学家盲法评估证实，ctPDOs保留了原发肿瘤的腺体结构和EpCAM阳性上皮特征。
fPDOs与ctPDOs化疗敏感性可比
在011T模型中对奥沙利铂、伊立替康、5-氟尿嘧啶（5-FU）的药物反应测试显示，ctPDOs（CS#2、CS#4）与fPDOs的剂量反应曲线趋势一致，伊立替康对三组的IC??值分别为24.97μM（fPDO）、37.16μM（ctPDO#2）、34.96μM（ctPDO#4），表明冷冻保存未显著改变类器官的药物敏感性。
讨论与结论
研究建立了基于玻璃化冷冻的CRC组织到类器官流程，CS#2配方（乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖、III型AFP）表现最优，支持解冻后类器官恢复、传代及形态学保留。组织冷冻方式优于细胞冷冻，可能与保留组织架构有关。虽然ctPDOs首次传代时间略长，但不影响后续扩增；药物反应测试显示ctPDOs与fPDOs敏感性可比，验证了流程的功能性。临床病理特征分析未发现与类器官恢复的显著关联，需更大样本验证。该研究为临床生物样本库提供了灵活的时间独立PDO生成方案，有助于推动PDO在精准医疗中的应用，但未证明优于所有替代策略，未来需在更广泛CRC队列中评估性能。
