哺乳期间母体蛋白质营养不足会降低雄性Wistar后代的体重增加和体脂含量，并延缓性成熟的开始

《Nutrition》：Maternal protein undernutrition during lactation reduces body weight gain and adiposity and delays pubertal onset in male Wistar offspring

　　威廉·多·纳西门托·德·索萨·罗德里格斯 | 雷娜塔·马里诺·罗马诺 | 萨布丽娜·格拉西奥利 | 珍妮·玛丽亚·德·奥利维拉 | 玛丽亚·维里迪安娜·莫塔·莫雷拉·利马 | 玛丽安娜·维尔特曼·庞佩奥·弗劳济尼奥 | 玛丽亚·娜塔莉亚·奇米里·佩雷斯 | 马尔科·奥雷利奥·罗马诺 | 保罗·塞扎尔·德·弗雷塔斯·马蒂亚斯
实验实验室 DOHaD（LexDoHAD）-，生物科学研究生项目，马林加州立大学（UEM），巴西马林加

**摘要**
哺乳期间母体蛋白质的限制通过调节下丘脑-垂体-睾丸（HPT）轴影响后代的代谢和生殖发育。青春期前后 HPT 轴的调控机制仍不甚明了，母体蛋白质限制对这一过程的影响也尚未完全了解。本研究调查了哺乳期间母体蛋白质限制对雄性 Wistar 大鼠从青春期到成年期 HPT 轴功能的影响。从出生后第 0 天（PND 0）到断奶第 21 天（PND 21），母鼠分别被喂食正常蛋白质饮食（NP；20.5% 蛋白质）或低蛋白质饮食（LP；4% 蛋白质）。雄性后代在 PND 35、45 和 55（青春期阶段）以及 PND 90（成年期）时接受评估。评估指标包括体重（BW）、脂肪含量、青春期启动时间、血清睾酮浓度以及下丘脑和睾丸的基因表达（RT-qPCR）。与 NP 后代相比，LP 后代的青春期启动延迟，青春期体重减轻。在 PND 35 时，LP 后代的葡萄糖耐受性改善，睾丸重量减少，下丘脑中的性类固醇受体（Esr1、Esr2、Gper1 和 Ar）表达降低。在睾丸中，LP 后代的雌激素受体 α（Esr1）、黄体生成素受体（Lhcgr）以及支持精子发生的基因（Spermatocity Rhcg 和 Lrrc34）表达降低；相反，它们的芳香化酶（Cyp19a1）和雌激素受体 β 表达高于同龄 NP 后代。到 PND 45 时，下丘脑中的 Kiss1 表达增加，而 LP 后代的睾丸中参与类固醇生成和精子发生的基因（包括 Ar、Gper1、Cyp19a1 和 Rhcg）表达降低，同时血清睾酮水平也下降。到 PND 55 时，下丘脑中的速激肽前体 3（Tac3）表达增加，而雌激素受体基因（Esr1、Esr2 和 Gper1）及雄激素受体（Ar）表达降低。在睾丸中，Lgals1 表达增加，而与精子发生相关的基因 Fshr 和 Kit 表达低于 NP 后代。成年后，LP 组的体重、脂肪含量和血清性激素水平持续较低，且下丘脑或睾丸基因表达无显著变化。

**引言**
营养紊乱，如围产期母体营养不良，会通过干扰关键的神经发育过程对新生儿健康产生负面影响，特别是对调节生殖和青春期启动的下丘脑-垂体-睾丸（HPT）轴造成显著影响 [1,2]。在这种背景下，营养不良母鼠所生的雄性后代会出现 HPT 轴的多种异常。妊娠和哺乳期间将食物摄入量减少 50% 可以延迟雄性大鼠的体格和生殖器官生长，导致激素和生物指标失衡，瘦素水平降低，最终引起青春期启动延迟 [3]。同样，妊娠和哺乳期间蛋白质摄入量减少也会导致雄性后代的激素失衡，改变睾丸、附睾和前列腺的发育轨迹，并以年龄依赖的方式影响精子活力和生育能力 [4, [5], [6]。
在雄性大鼠中，包皮分离是青春期成熟的睾酮依赖性标志，发生在出生后第 35 至 55 天，这是由于 HPT 轴激活的结果，表现为促性腺激素释放激素（GnRH）的合成和脉冲分泌增加 [7, [8], [9]。激活共表达 kisspeptin/neurokinin B/dynorphin A（KNDy）的神经元的代谢信号会影响 GnRH 的脉冲分泌 [10, [11], [12]。另一方面，makorin 环指蛋白 3（MKRN3）基因会抑制 GnRH 的释放 [13,14]。青春期前后，类固醇生成和精子发生过程加剧并变得更加规律 [15]。在睾丸中，睾酮通过芳香化酶局部转化为雌二醇，这是睾丸类固醇生成的一部分 [16]。睾酮作为雄激素受体的配体，而雌二醇与雌激素受体结合 [17, [18], [19]。此外，雌激素信号通路涉及雌激素受体 α（ERα/ESR1）、雌激素受体 β（ERβ/ESR2）和 G 蛋白偶联雌激素受体 1（GPER），这些受体传统上与女性生殖系统相关，但对精子发生和生殖细胞的存活也至关重要 [20,21]。母体营养不良会损害睾丸形成，降低参与精子发生的基因表达，影响生殖参数（包括睾丸大小、精子产生和激素水平），从而导致后代生育能力下降 [22], [23], [24], [25]。
母体营养不良在发育关键阶段对生殖系统的调节作用决定了成年后的生殖健康，这体现了健康和疾病的发育起源（DoHaD）。因此，我们假设哺乳期间母体摄入低蛋白质（LP）饮食会通过调节 HPT 轴对生殖和代谢状态的影响，从而改变雄性后代的青春期启动时间。关于 LP 饮食如何调节后代 HPT 轴的现有证据仍然有限，尤其是在时间分析方面。本研究的目的是评估哺乳期间蛋白质营养不良对雄性后代从青春期到成年期睾酮浓度和 HPT 轴的影响。

**材料与方法**
**伦理方面**
所有动物均得到妥善处理，所有实验程序均遵循《ARRIVE Guidelines 2.0》（涉及动物的研究）和巴西动物实验协会（COBEA）的标准。该研究获得了马林加州立大学动物使用伦理委员会的批准（协议编号 8620070222/2022）。动物由马林加州立大学中央动物设施提供，并饲养在 DOHaD 实验实验室（Lex DOHaD）的动物设施中。

**母体哺乳期营养不良模型**
本研究使用 80 日龄的雄性 Wistar 大鼠和 70 日龄的雌性 Wistar 大鼠。配种时雌雄比例为 1:2，共 16 只雄性和 32 只雌性。所有动物均喂食商业饲料（蛋白质含量 20.5%；Nuvital?），并饲养在聚丙烯笼子中（尺寸：高 15 cm × 长 45 cm × 宽 30 cm）。实验期间，动物的温度（23 ± 2°C）、光照周期（上午 7:00 至晚上 7:00）和湿度（60 ± 5%）均处于受控状态。水和其他商业饲料（Nuvital，库里蒂巴，巴西）可自由获取。雌性大鼠与经过验证的雄性繁殖大鼠配种；随后通过生理盐水（0.9% w/v）清洗阴道拭子以检测精子存在情况。阴道拭子中检测到精子表示配种成功，并据此确定怀孕大鼠，妊娠阶段通过观察此期间的体重增长进一步确认。出生时（PND 0），每只母鼠产下 8 只幼崽（4 只雄性和 4 只雌性）。产后，哺乳期母鼠（每组 16 只）分别被喂食含 20.5% 蛋白质的正常蛋白质饮食（NP 组）或等热量的低蛋白质饮食（LP 组，蛋白质含量 4%）。LP 饮食从分娩（PND 0）持续到哺乳第 14 天，之后恢复为正常蛋白质饮食直至断奶（PND 21）[29]。由于营养压力导致的母体同类相食增加，LP 饮食并未在整个哺乳期间维持。本研究共有 32 只母鼠产下 128 只幼崽。幼崽在 PND 21 日断奶，每组笼子里饲养 4 只雄性幼崽直至青春期或成年期。共有 64 只 NP 后代和 64 只 LP 后代。每组包含 4 窝幼崽，总计 16 只动物。本研究仅分析雄性后代；雌性后代由我们的研究小组在另一项研究中进行分析 [30]。雄性后代在不同生殖阶段接受评估，具体时间线见图 1。每次实验中每组使用最少 7 只最多 16 只动物，RT-qPCR 分析使用每窝 2 只动物，OGTT 分析最多使用每窝 4 只动物。各分析中使用的动物具体数量见相应图表和图例。

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**图 1.** 研究设计示意图。分娩后，母鼠在哺乳前两周（PND 0–14）喂食低蛋白质饮食（LP 组），第三周至断奶（PND 15–21）喂食正常蛋白质饮食，或在整个哺乳期间喂食正常蛋白质饮食（NP 组）。断奶后，每窝选取 4 只幼崽，在青春期（PND 35–55）和成年期（PND 90）进行评估。在 PND 35、45、55 和 90 时，每组分析 16 只雄性幼崽。所有动物均称重后通过快速斩首处死。RT-qPCR 分析仅使用部分动物。

**口服葡萄糖耐量试验（oGTT）期间的葡萄糖代谢**
在 PND 33、43、53 和 88 日，对两组雄性后代的葡萄糖耐量进行评估（每组/每龄段 16 只）。动物禁食 12 小时（20:00–08:00），期间可自由饮水。禁食后记录体重，并通过校准的手持血糖仪（Freestyle Optium Neo，Abbott Laboratories，芝加哥，IL，美国）测量基线血糖（t = 0 分钟）。通过口服灌胃给予葡萄糖溶液（D-葡萄糖，2 g/kg 体重，溶于 0.9% 生理盐水中）。在葡萄糖给药后 15、30、45、60 和 120 分钟分别测量血糖浓度。通过计算曲线下面积（AUC）来量化葡萄糖耐量 [30]。

**青春期启动时间**
PND 21 后，NP 和 LP 组雄性后代每天接受监测，包括根据包皮膜分离和阴茎头外露情况评估青春期启动 [7,31]。该方法从 PN30 青少年期结束开始，持续到包皮开口前的整个时期，通过轻柔操作生殖器官进行。

**体重记录和脂肪含量评估**
在 PND 1、7、14 和 21 日临时记录母鼠和雄性后代的体重。通过计算曲线下面积（AUC）量化哺乳期间的总体体重变化。断奶后（PND 21），每天监测并记录雄性后代的体重，直至成年期。每只动物的体重增长通过减去 PND 25 的初始体重与实验结束时的最终体重来确定。此外，还计算整个观察期间的体重增长 AUC。在特定发育阶段（PND 25-35 [早期断奶后]、PND 35-45 [青春期]、PND 45-55 [青春期] 和 PND 55-90 [成年期]）分析体重变化。研究结束时，每组（每龄段 4 窝，共 16 只动物）的雄性后代禁食 12 小时（20:00–08:00），然后进行安乐死。在 PND 35、45、55 和 90 日，使用硫喷妥钠（45 mg/kg 体重）麻醉大鼠并斩首取血。随后进行剖腹手术以获取组织。仔细解剖附睾周围（p）和腹膜后（r）白色脂肪组织（WAT）并称重。脂肪垫重量以每 100 克体重中的脂肪克数（g/100 g BW）表示。收集躯干血液用于后续激素和生物指标分析。

**睾酮测量**
斩首后立即用肝素化微管收集躯干血液，离心（2400 × g，20 分钟）后分离血浆。血浆样本在-20°C下储存，直到进行检测。睾酮水平是通过竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Elabscience?，德克萨斯州休斯顿，美国）来测定的，严格遵循试剂盒制造商提供的说明。根据制造商的规格，测定的内变异系数（intraassay）和间变异系数（interassay）分别为5.36%和4.74%。

**总RNA纯化及通过逆转录结合实时定量PCR（RT-qPCR）的相对基因表达**
断头后立即根据既定协议[32]定位并移除下丘脑。同样，按照之前的描述[33]分离并称量右侧和左侧的睾丸。接下来，使用研磨器和研杵在液氮中将下丘脑和睾丸组织彻底匀浆。标准化的样本随后转移到1.5毫升的微量离心管中，并在-80°C下保存。总RNA通过胍-酚-氯仿法[34]提取，使用Trijol试剂（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德），严格遵循制造商设定的指南。总RNA的浓度通过纳米分光光度计（KASVI模型k23-002）测量溶液的光密度（OD）来评估。RNA的纯度通过计算A260/280 nm比率来评估，其中260 nm处的吸光系数作为主要指标。RNA的完整性通过电泳来评估，电泳在1.2%的琼脂糖凝胶和TBE缓冲液中进行。总共2微克的总RNA使用GoScript逆转录系统试剂盒（Promega，威斯康星州麦迪逊）进行逆转录。逆转录产物的实时PCR（RT-qPCR）使用PowerUp SYBR Green Master Mix试剂盒（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行。基因的扩增条件根据Applied Biosystems StepOnePlusTM实时PCR系统（Applied Biosystems，新加坡）的制造商规格来执行。热循环的顺序如下：温度最初设定为50°C持续2分钟，然后升高到95°C持续2分钟，接着是40个循环，每个循环中95°C持续15秒和60°C持续30秒。反应完成后，生成解离曲线以验证扩增的特异性。循环阈值（Ct）的平均值通过StepOneTM软件v2.3（Applied Biosystems）自动计算。定量分析采用之前描述的2^-ΔΔCt方法[35]。核糖体蛋白L19（Rpl19）基因作为参考基因。表1列出了用于RT-qPCR分析的引物序列以及与每种组织相关的目标基因的GenBank登录号。

**表1. RT-qPCR分析所用的引物序列及目标基因的GenBank登录号**

**下丘脑和睾丸组织中的基因**
| NCBI参考序列 | 引物序列（5’ – 3’） |
| --- | --- |
| Gnrh1（促性腺激素释放激素） | NM_012767.2 | F: AGGAGCTCTGGAACGTCTGAT | R: AGCGTCAATGTCACACTCGG |
| Kiss1（KiSS-1转移抑制因子） | NM_181692.1 | F: GGAGCCACTGGCAAAAATG | G: GCCAGGCATTAACGAGTTCCT |
| Tac3（速激肽前体3） | NM_019162.2 | F: TTGAAGAGAACACCCCCAG | C: GGTCTGAGAGTGGAGTGCTTT |
| Mkrn3（环指蛋白3） | NM_00139995 | 1.1 | F: GACAGTGTTAGAGGCACGCT | R: AGCCATAAGAAACGGTGCCAC |
| Cyp19a1（芳香化酶） | NM_017085.2 | F: CGTCATGTTGCTTCTCATC | G: TACCGCAGGCTCTCGTTA |
| Ar（雄激素受体） | NM_012502.1 | F: GCCATGGGTTGGCGGTCCT | R: AGGTGCCTCATCCTCACGCACTG |
| per1（G蛋白偶联雌激素受体1） | NM_133573.1 | F: CCCTTGACAGGCCACATAG | R: CTCCGTGCTGTCTGGTATG |
| Esr1（雌二醇受体1） | NM_012689.1 | F: CCATATCCGGCACATGAGT | R: TGAAGACGATGAGCATCCAGE |
| Esr2（雌二醇受体2） | NM_012754.1 | F: CTCACGTCAGGCACATCAG | R: TGTGAGCATTCAGCATCTC |
| Lhcgr（黄体生成素/促性腺激素释放激素受体） | NM_012978.1 | F: AGTGGAGCCTTCCAGGGGG | C: AGGAAGACAGGGCGATGAGCG |
| Tshr（卵泡刺激激素受体） | NM_199237.1 | F: TCACTGGCTGTGTCATTGCT | C: GAGATCTCTATTTTCTCCAGGTCT |
| Cyp11a1（细胞色素P450，家族11，亚家族a，多肽1） | NM_017286 | F: GGAGCTGGTATCTCCTCTCC | R: TTGCCCAGCTTCTCCCTGTAA |
| Star（类固醇生成急性调节蛋白） | NM_031558 | F: ACCAAGCGTAGAGGTTCCAC | R: TTCAGCTCTGATGACACCGC |
| Gals1（半乳糖凝集素1） | NM_019904.1 | F: TACACTTCAACCCCCGCT | C: TGATGCACACCTCCGTGATG |
| Ndrg4（NDRG家族成员4） | NM_00127109 | 1.1 | F: GCCCAGCCATCCTTACCTAC | R: GGCACACCACGAAGTGTTTG |
| Kit（KIT原癌基因受体酪氨酸激酶） | NM_022264.1 | F: ATGGAAGATGACGAGCTGG | C: AATCTTTGTGATCCGCCCG |
| Rhcg（Rh家族，C糖蛋白） | NM_0183053.1 | F: AGCGCTGTAGGCTTCAACT | R: GTCGGCTTGGATGAGGTTCTL |
| rrc34（富含亮氨酸重复序列34） | NM_00104469 | 6.1 | F: CATCGGTGGTGTGGATGTGAR | G: GCCTTCAGGTCCAATGTCGTR |
| pl19（核糖体蛋白L19） | NM_031103.1 | F: CAATGAAACCAACGAAATC | G: TCAGGCCATCTTTGATCAGCT |

**统计分析**
结果以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现，并随后进行了正态性检验，使用D'Agostino Pearson检验进行。学生t检验用于比较两组之间的差异。此外，应用了双向ANOVA，并进行了Bonferroni事后校正，以评估母体饮食（D）、年龄（A）以及这两个因素之间的交互作用（D×A）的影响。统计显著差异的p值小于0.05。实验测试使用GraphPad Prism版本8.0（GraphPad Software, Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）进行。

**结果**

**哺乳期间母鼠及其后代的体重**
在哺乳期间，LP组母鼠的体重低于NP组母鼠（AUC：-25.1%；P < 0.0001；图2A；每组16只母鼠）。第一周体重下降（-26.8%；P < 0.0001），第二周体重进一步下降（-40.1%；P < 0.0001）。第三周重新喂食NP饮食后，体重部分恢复，但仍显著低于NP组母鼠（-11.2%；P < 0.0001）。同样，与NP组幼崽相比，LP组幼崽在整个哺乳期间的体重也较低（AUC：-49.8%；P < 0.001；图2B，每组16只幼崽），在PND 7（-36.9%；P < 0.0001）、PND 14（-59.2%；P < 0.0001）和PND 21（-51.2%；P < 0.0001）时差异显著。

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**图2. 哺乳期间NP组和LP组母鼠及幼崽的体重（BW）**。母鼠（A）和幼崽（B）的体重以平均值±标准误差表示，每组16只母鼠（每组16窝，每窝16只幼崽），每窝产1只幼崽。侧面板显示曲线下面积（AUC）。统计分析使用学生t检验进行（****P < 0.0001）。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

**青春期前后和青年期的葡萄糖稳态**
在PND 35时，LP组后代的口服葡萄糖耐量试验（oGTT）的AUC显著降低（19.8%；P < 0.05；图3A），而NP组后代则没有变化。相比之下，PND 45、55和90时的葡萄糖耐受性保持不变（图3B–D）。

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**图3. PND35（A）、PND45（B）、PND55（C）和PND90（D）时NP组和LP组雄性后代的血糖反应**。数据以每组16只动物的平均值±标准误差（SEM）表示。左侧的图表显示血糖反应的曲线下面积（AUC）。组间比较使用学生t检验进行，统计显著性定义为*P< 0.05和**P< 0.01。蓝色条形和圆圈代表NP组后代，红色条形和圆圈代表LP组后代。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

**青春期期间的生物测量参数和血清睾酮浓度**
如图4A所示，D×A的交互作用显著影响了整个青春期期间的体重和体重增加（图4B），生长过程中的体重逐渐增加（P < 0.0001；双向ANOVA）。然而，LP组的体重增加幅度显著低于NP组（图4A；P < 0.0001；双向ANOVA，每组16只）。PND 25–35和PND 45–55期间的体重增加减少（图4B；P < 0.05；双向ANOVA；每组16只）。D、A及其交互作用对脂肪量的影响也观察到类似的趋势。青春期前后，腹膜周围（p-WAT）和腹膜后（r-WAT）白色脂肪组织的质量逐渐增加。然而，LP组的WAT含量低于NP组（图4C–D；P < 0.0001；双向ANOVA，每组16只）。LP组后代的体重较低，在PND 35时减少35.9%，PND 45时减少28.3%，PND 55时减少29.4%（图4A；所有年龄组；P < 0.0001）。PND 25–35和PND 45–55期间的体重增加减少，分别减少了19%和23%（图4B；P < 0.001和P < 0.001），而p-WAT在PND 35时减少45%，PND 45时减少26%，PND 55时减少36%（图4C；所有年龄组；P < 0.0001）。D×A的交互作用减少了LP组后代的睾丸重量增加（图4E；P < 0.0001；双向ANOVA，每组16只）和循环睾酮水平的变化（图4F；P < 0.05；双向ANOVA，每组9只）。睾丸重量仅在PND 35时减少，减少了11.7%（图4E；P < 0.0001）。PND 45时血浆睾酮浓度降低了57.4%（图4F；P < 0.05）。

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**图4. 青春期期间母体蛋白质限制对雄性后代的影响**
动物体重（A）、体重增加（B）、p-WAT（C）、r-WAT（D）、睾丸重量（E）和血清睾酮浓度（F）。生物测量分析每组16只动物，睾酮浓度每组9只动物，来自4个不同的窝。统计分析使用双向ANOVA进行，考虑了母体饮食（D）、年龄（A）及其交互作用（D×A），随后进行Bonferroni事后多重比较。显著性水平如下：*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

**阴蒂分离作为青春期发育的标志**
喂食LP饮食的母鼠所生的后代青春期开始延迟（图5A；P < 0.05），并且青春期开始时的体重较低（-17.5%；图5B；P < 0.05）。青春期的中位年龄为45天[[44]，[45]，[46]，[47]，[48]]。

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**图5. LP组和NP组雄性Wistar大鼠的生殖标志**
青春期开始的时间（A）和青春期时的体重（B），数据来自PND55和PND90的动物。结果以平均值±标准误差表示。组间比较使用学生t检验进行（n=24–32只动物/组，显著性水平为****P< 0.0001）。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

**青年期的生物测量参数和睾酮浓度**
在PND 90时，LP组后代在成年期表现出持续的瘦型表型，其特征是体重显著降低（图6A；P < 0.0001；n=16每组），体重增加（图6B；P < 0.0001），p-WAT（图6C；P < 0.05；n=16每组）和r-WAT（图6D；P < 0.0001）均低于NP组后代。尽管如此，LP组后代的血清睾酮水平仍然较低（图6F；P < 0.01；n=9每组）。

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**图6. 青年期参数**
动物体重（A）、体重增加（B）、p-WAT（C）、r-WAT（D）和睾丸重量（E）和睾酮（F）。数据以平均值±标准误差（SEM）表示，共9–16只动物，来自每个实验组的4个不同窝。统计分析使用学生t检验进行。统计显著性定义为*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。蓝色条形和圆圈代表NP组后代，红色条形和圆圈代表LP组后代。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

**青春期期间雄性下丘脑的基因表达**
在下丘脑中，D×A的交互作用增加了Gnrh1 mRNA的表达（图7A；P < 0.0001）。相反，这种交互作用降低了Mkrn3、Ar、Gper1、Esr1、Esr2和Cyp19α1转录本的表达（图7D-I；p < 0.05；p < 0.05；p < 0.0001；p < 0.05；p < 0.05；p < 0.05）。D增加了Kiss1 mRNA的表达（图7B；p < 0.05）。对于Tac3转录本，D和A之间没有交互作用，导致基因表达增加（图7C；D效应：p < 0.01；A效应：p < 0.05）。Bonferroni分析显示，在青春期开始时（PND 35），LP组动物的Ar（p < 0.01）、Gper1（p < 0.05）、Esr1（p < 0.01）和Esr2（p < 0.001）mRNA表达较低。在P在青春期末期（PND 55），Ar（p < 0.0001）、Gper1（p < 0.0001）、Esr1（p < 0.001）和Esr2（p < 0.01）的表达量减少，而Tac3的表达量增加（p < 0.05）。下载：下载高分辨率图片（993KB）下载：下载全尺寸图片

图7. 在青春期期间，雄性Wistar后代的下丘脑转录本包括促性腺激素释放激素1（Gnrh1）（A）、KiSS-1转移抑制因子（Kiss1）（B）、速激肽前体3（Tac3）（C）、环指蛋白3（Mkrn3）（D）、雄激素受体（Ar）（F）、G蛋白偶联雌激素受体1（Gper1）（F）、雌激素受体1（Esr1）（G）、雌激素受体2（Esr2）（H）和芳香化酶（Cyp19α1）（I），这些转录本均以核糖体蛋白L19（Rpl19）为标准进行归一化。数据以平均值±标准误差（n = 7–8组）表示。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA），考虑了母体饮食（D）、年龄（A）及其交互作用（D × A），随后进行Bonferroni事后校正。图中标出了NP和LP后代之间的差异（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001）。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

成年早期的下丘脑基因表达
在成年期，LP后代和NP后代之间的下丘脑mRNA表达没有显著差异（图8）。

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图8. 在成年早期，雄性Wistar后代的下丘脑转录本包括促性腺激素释放激素1（Gnrh1）（A）、KiSS-1转移抑制因子（Kiss1）（B）、速激肽前体3（Tac3）（C）、环指蛋白3（Mkrn3）（D）、雄激素受体（Ar）（F）、G蛋白偶联雌激素受体1（Gper1）（F）、雌激素受体1（Esr1）（G）、雌激素受体2（Esr2）（H）和芳香化酶（Cyp19α1）（I），这些转录本均以核糖体蛋白L19（Rpl19）为标准进行归一化。数据以平均值±标准误差（n = 7–8组，来自4个不同的窝）表示。统计分析使用Student’s t检验进行。蓝色条形和圆圈代表NP后代，红色条形和圆圈代表LP后代。

青春期期间雄性睾丸类固醇生成相关基因的表达
双因素方差分析显示，无论交互作用如何，饮食和青春期年龄都对Lhcgr和Ar的转录水平有显著的主效应，导致表达量增加（图9 A和9E；饮食效应：P < 0.05；年龄效应：两者均为P < 0.0001）。相比之下，青春期年龄显著增加了Star、Cyp11a1和Esr1的表达量，而Gper1和Esr2的表达量在青春期期间波动（图9B、9C、9G、9F和9H；年龄效应分别为P < 0.0001、P < 0.001和P < 0.05）。在PND 35时，LP后代的Lhcgr（P < 0.05）和Esr1（P < 0.05）表达量减少，同时Cyp19α1（P < 0.001）和Esr2（P < 0.05）表达量增加。在PND 45时，Cyp19α1（P < 0.05）、Ar（P < 0.01）和Gper1（P < 0.05）的表达量减少。在PND 55时，只有Esr1的表达量在睾丸中减少（P < 0.05）。

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图9. 在青春期期间，NP和LP后代的睾丸转录本。黄体生成激素受体（Lhcgr）（A）、类固醇生成急性调节蛋白（Star）（B）、细胞色素P450家族11亚家族A成员1（Cyp11a1）（C）、芳香化酶（Cyp19a1）（D）、雄激素受体（Ar）（E）、G蛋白偶联雌激素受体1（Gper1）（F）、雌激素受体1（Esr1）（G）和雌激素受体2（Esr2）（H），这些转录本均以核糖体蛋白L19（Rpl19）为标准进行归一化。数值以平均值±标准误差（SEM）表示（n = 7–8组，来自4个不同的窝）。统计分析采用双因素方差分析，考虑了母体饮食（D）、年龄（A）及其交互作用（D × A），随后进行Bonferroni事后多重比较。图中标出了NP和LP后代之间的差异（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

青春期期间雄性睾丸精子生成相关基因的表达
有趣的是，双因素方差分析显示，A和D之间的交互作用增加了Fshr、Lgals1和Rhcg的mRNA表达量（图10A、10B和10E；交互作用D × A分别为P < 0.05、P < 0.0001和P < 0.05）。此外，D和A的非交互效应促进了Kit和Lrrc34的表达量增加（图10D和10F；饮食效应：P < 0.01和P < 0.05；年龄效应：分别为P < 0.05和P < 0.0001）。青春期年龄显著改变了Ndrg4的转录（图10C；P < 0.01）。在PND 35时，LP动物的Lgals1（图10B；P < 0.01）、Rhcg（图10E；P < 0.001）和Lrrc34（图10F；P < 0.0001）表达量减少。在PND 45时，Rhcg表达量减少（图10E；P < 0.05），而在PND 55时，Fshr和Kit的表达量减少（图10A，P < 0.05；图10B，P < 0.05），而Lgals1的表达量在LP后代中增加（图10B；P < 0.01）。

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图10. 在青春期期间，NP和LP后代的睾丸转录本。卵泡刺激激素受体（Fshr）（A）、半乳糖凝集素-1（Lgals1）（B）、NDRG家族成员4（Ndrg4）（C）、KIT原癌基因受体酪氨酸激酶（Kit）（D）、Rh家族C糖蛋白（Rhcg）（E）和富含亮氨酸重复序列34（Lrrc34）（F）的mRNA表达量，这些转录本均以核糖体蛋白L19（Rpl19）为标准进行归一化。数据以平均值±标准误差（n = 7–8组，来自4个不同的窝）表示。统计分析使用双因素方差分析，考虑了母体饮食（D）、年龄（A）及其交互作用（D × A），随后进行Bonferroni事后校正。图中标出了NP和LP后代之间的差异（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001）。缩写：NP，喂食正常蛋白质饮食的母鼠的后代；LP，喂食低蛋白质饮食的母鼠的后代。

成年期的睾丸基因表达
与NP后代相比，LP后代在成年期的任何睾丸转录本的相对mRNA表达上没有显著差异（图11）。

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图11. 在成年早期，雄性睾丸中黄体生成激素受体（Lhcgr）（A）、类固醇生成急性调节蛋白（Star）（B）、细胞色素P450家族11亚家族A成员1（Cyp11a1）（C）、芳香化酶（Cyp19a1）（D）、雄激素受体（Ar）（F）、雌激素受体1（Esr1）（G）、雌激素受体2（Esr2）（H）、卵泡刺激激素受体（Fshr）（I）、半乳糖凝集素-1（Lgals1）（J）、NDRG家族成员4（Ndrg4）（K）、KIT原癌基因受体酪氨酸激酶（Kit）（L）、Rh家族C糖蛋白（Rhcg）（M）和富含亮氨酸重复序列34（Lrrc34）（N）的表达情况。数据以平均值±标准误差（n = 7–8组/年龄，来自4个不同的窝）表示。统计分析使用Student’s t检验进行。蓝色条形和圆圈代表NP后代，红色条形和圆圈代表LP后代。

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图12. 哺乳期营养不足的母鼠所生雄性后代在青春期和成年早期，HPT轴的生物测量、代谢和转录变化模型。哺乳期母体蛋白质限制与青春期和成年早期雄性后代下丘脑和睾丸转录本表达的中期改变有关。该模型整合了调节GnRH释放的下丘脑转录本变化、睾酮水平的变化以及睾丸中类固醇生成基因、激素受体和精子生成标志物的差异表达。创建于：www.biorender.com。

讨论
哺乳期早期（蛋白质摄入量仅为4%）会损害雄性的生殖健康。这些影响包括青春期期间睾丸和下丘脑转录本的变化，导致HPT轴基因失调和青春期延迟。在我们的研究中，在包皮分离当天（大约PND45），LP后代的体重和内脏脂肪量较低。Zambrano及其同事报告称，较低的青春期体重与后代黄体生成激素和睾酮水平降低有关，但并未影响270天时的生育能力[36]。尽管LP动物的体重和内脏脂肪量较低，但它们的脂肪质量和睾丸的线性生长持续时间较长，因此体重也较低；然而，这些参数在成年期仍低于NP后代。同样，母体热量限制导致后代对体重增加具有抵抗力，体重一直保持在较低水平，这与WAT中促进体重增加的基因表达减少有关[37]。在青春期前进行口服葡萄糖挑战后，LP母鼠的后代表现出更好的葡萄糖耐受性，可能是由于PND 35时外周组织对葡萄糖的吸收增加[38]；然而，体重直到成年期才恢复。

增加的睾丸质量是睾酮驱动的青春期发育和精子生成开始的标志[7,39]。在我们的研究中，PND 35的LP后代由于母体蛋白质营养不足导致的发育延迟，其睾丸重量减少，这与先前的研究结果一致[40]。它们还表现出Lhcgr mRNA表达量降低，这可能解释了尽管循环睾酮水平正常，但睾丸质量较低的现象，表明这一阶段睾丸对雄激素的敏感性增加。在青春期前，LP动物的Cyp19a1表达量较高，表明芳香化增强和类固醇生成过程受到干扰。在人类中，睾丸芳香化增强与生殖障碍有关，包括青春期延迟[41]。LP后代在包皮分离前一致表现出芳香化活性改变，表明青春期延迟可能是由于睾丸发育受损所致。尽管如此，循环睾酮水平保持正常，支持这一阶段睾丸对雄激素的敏感性增加。

睾酮是芳香化酶的底物，产生雌激素，刺激塞尔托利细胞增殖[16,42,43]。因此，睾丸芳香化增强以及睾丸重量减少可能与Lgals1表达量降低有关，Lgals1在塞尔托利细胞中高度表达[44]，而这些细胞对生殖细胞的结构和代谢支持至关重要[45,46]。与同龄NP后代相比，LP后代的Lgals1表达在青春期前减少，但在青春期末期达到峰值。青春期阶段也调节了两组的Ndrg4和Kit表达，表明在青春期前未分化和已分化的精原细胞数量减少。此外，精细胞（Rhcg）和精子细胞（Lrrc34）标记物的表达量降低表明生精细胞组成发生了变化，可能是由于塞尔托利细胞的支持减少。一致地，低母体蛋白质摄入与青春期前的生精组织发育不全有关，包括生精上皮层变薄和精子细胞数量减少[22]。

哺乳期蛋白质限制会损害大脑发育；减少神经元数量、皮质灰质和树突分支；并导致下丘脑畸形和生长受限[47, [48], [49]]。LP后代的Ar、Esr1、Esr2和Gper1表达量降低，表明雄激素和雌激素信号的重新编程可能影响青春期期间的HPT轴调节。尽管雌二醇通过ESR1和ESR2调节脉冲式GnRH释放[50]，但在PND 35时，较低的Esr1和Esr2表达并未伴随Gnrh1表达的变化，表明受体表达的变化不一定影响Gnrh1的转录[51,52]。对Mkrn3（HPT轴的抑制因子[53]的评估显示，NP和LP表型之间的表达没有差异。然而，PND 35时的Mkrn3表达量显著高于PND 55，这与其对Kiss1和Tac3的抑制作用一致，这两种因子起到生物制动器的作用，防止过早青春期。这些发现支持了PND 35到PND 55期间雄性后代的青春期进展，其中随着Mkrn3的减少，青春期提前[13]。此外，Tac3在KNDy神经元中起中枢兴奋作用[55]，我们的数据显示PND 55时LP后代的Tac3表达量增加。在男孩中，青春期对应于青少年时期（11–15岁），其特征是睾酮水平逐渐升高和行为变化[8]。在雄性大鼠中，青春期大约发生在出生后第六周，表现为包皮分离和睾丸生长加速，表明性成熟[7,15,54]。LP后代的包皮分离延迟（PND 44–48），这是青春期开始的一个外部标志，对阴茎外露和获得交配能力所需的雄激素作用非常敏感[7]。先前的一项研究表明，在哺乳期间母体蛋白质营养不良会编程HPT轴，导致包皮分离时的体重较低，但与对照组相比，青春期进展没有差异[36]。相比之下，在雌性LP后代中，同样的营养剥夺会延迟青春期进展[55]，这与我们观察到的雄性包皮分离延迟的结果一致。这些观察结果表明，对早期生命蛋白质限制的反应存在性别差异，表明在哺乳期间可能需要更严重的营养编程来延迟雄性的青春期进展。在经历热量限制的母亲所生的雄性后代中，哺乳期间出现了早期的瘦素激增，这是下丘脑成熟的敏感时期，并对成年表型有持久影响[37]。在青春期，下丘脑瘦素作为慢性能量平衡的主要传入信号[56]，并根据脂肪质量调节生殖功能[57]。尽管没有测量，但在PND 35到PND 45之间LP动物的正常脂肪组织（WAT）质量增加可能通过代谢信号增加了下丘脑Kiss1的表达，支持睾丸重量的正常化并促进性成熟。此外，GnRH神经元不表达瘦素受体[58]，这表明青春期期间的体重减轻不会改变雄性的Gnrh1转录本合成。PND 45的LP后代表现出睾酮水平降低和Ar mRNA表达减少，表明类固醇生成受损，可能是由于睾丸内睾酮水平降低所致。睾丸芳香化减少也可能导致Gper1下调，这在性成熟过程中介导睾丸中的雌激素反应，尽管青春期进展会持续到成年睾丸重量达到。支持这一点的是，芳香化抑制剂通过延迟骨骺闭合来延迟人类的青春期进展[41]。在这个窗口期内类固醇生成的改变也可能损害精子发生动态，如Rhcg mRNA表达减少所示。这些啮齿动物还显示出下丘脑和睾丸基因表达的变化，这些基因在青春期调节类固醇生成和精子发生。同样，从出生到断奶期间的营养不良会改变下丘脑回路中控制生殖功能的基因表达[59]。虽然哺乳期间的适度LP饮食不会损害生育能力，但当妊娠和哺乳期间都发生蛋白质限制时，这种效果会丧失，成年雄性的睾酮水平降低与精子数量减少和生育能力下降有关[40]，这与PND 90时观察到的低睾酮水平一致。因此，需要在成年期进行功能分析，以确定蛋白质限制的严重程度是否影响精子数量，或者结果是否取决于营养剥夺的时间。在青春期末期[8]，Lhcgr、Star、Cyp11a1和Cyp19a1的表达恢复正常，表明LH受体反应性、胆固醇运输、孕烯醇酮合成和睾丸芳香化得以保持[16]。包皮分离后，NP和LP群体的睾丸生长一直持续到年轻成年期，这取决于FSH的活性、生精小管扩张和精子发生过程[8,39,60,61]。在PND 55时，雄激素生物合成恢复正常，但尽管Lgals1表达增加，精子发生仍然受到影响，表明FSH调节Sertoli细胞增殖[62]。抑制素B的增加可能通过负反馈调节FSH[63]。由于FSH通过FSHr受体传递信号，Fshr和Kit表达的减少可能会损害精原细胞分化和精子发生动力学，从而减少精子产量[54]。有趣的是，在PND 35和PND 55的下丘脑组织中，LP后代的雄激素和雌激素受体表达发生了变化。雌激素及其受体调节生殖成熟和能量平衡，其缺乏与食欲亢进和能量消耗减少有关[64,65]。LP后代始终表现出食欲亢进的表型[66]，这表明改变的雌激素信号可能通过能量平衡调节促进青春期后的体重增加。在这种背景下，Hales和Barker提出的节俭表型假说[67]以及Gluckman等人的扩展[68]表明，围产期营养限制适应了稀缺环境。然而，暴露于标准饮食可能会造成环境不匹配，导致LP后代尤其是年轻成年期的激素和身体组成改变。在年轻成年期，后代保持了瘦弱的表型，脂肪质量减少，基础睾酮水平较低。一致地，青春期期间的低蛋白暴露与成年期睾酮水平降低有关[69]。尽管性成熟延迟实现，但在达到年轻成年期时，下丘脑转录本（如Ar、Esr1和Esr2）的表达减少。相比之下，包括Lhcgr、Ar、Lgals1和Fshr在内的睾丸转录本水平逐渐增加并恢复正常，表明HPT轴以及类固醇生成和精子发生功能得以保持。尽管HPT相关mRNA水平动态稳定，但睾酮水平降低可能反映了胆固醇可用性的减少、5α-还原酶活性的增加或激素运输的改变，影响组织递送和效力[15,54]。由于缺乏雌二醇、FSH和LH的测量，限制了反馈调节的评估，缺乏免疫组织化学分析也限制了对生殖细胞和Sertoli细胞的评估。未来的研究应确定睾酮水平降低是否影响衰老过程中的生殖功能，以及母体营养编程效应是否通过表观遗传机制在雄性配子发生过程中传递给后代。

**结论**
哺乳期间严重的母体蛋白质限制会延迟雄性后代的青春期，并暂时影响HPT轴的功能。即使在营养恢复后，青春期的LP后代仍表现出睾酮水平改变、睾丸芳香化增加以及类固醇生成和精子发生基因的表达异常。这些转录本变化在成年期恢复正常，而低睾酮水平持续存在。总体而言，这些发现表明，尽管HPT生殖轴的功能可能在成年期恢复，但生命早期的睾酮水平降低引发了关于长期生殖健康的担忧。需要进一步的研究来确定青春期期间的激素紊乱是否对生育能力和生殖能力产生永久性影响。

**作者贡献声明**
William Rodrigues、Paulo Mathias和Renata Romano参与了研究的概念化、数据管理、正式分析和手稿撰写。William Rodrigues、Renata Romano、Sabrina Grassiolli、Maria Peres、Veridiana Lima、Jeane Oliveira、Marianna Flauzinho、Marco Aurelio Romano和Paulo Mathias参与了研究设计、方法学、数据管理、结果解释、手稿审阅和资金获取。

**资助**
本研究得到了巴西联邦高等教育人员协调基金会（CAPES）、INCT DOHaD Brazil、国家科学技术发展委员会（CNPq）和Jo?o Batista Sobrinho基金会（JBS）的支持。

**伦理声明**
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了马林加州立大学（CEUA/UEM）动物使用伦理委员会的批准（协议编号8620070222/2022）。

**数据可用性声明**
本研究中的数据可在以下机构存储库中获取：
http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/9365

**利益声明**
所有作者声明与本研究无关的利益冲突。

**作者贡献声明**
William do Nascimento de Souza Rodrigues：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。
Renata Marino Romano：撰写 - 审稿与编辑、验证、监督、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。
Sabrina Grassiolli：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、研究、正式分析。
Jeane Maria de Oliveira：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、研究、正式分析、数据管理。
Maria, Veridiana Mota Moreira Lima：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、正式分析、概念化。
Marianna Wirthmann Pompeo Flauzinho：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、正式分析、概念化。
Maria Natália Chimirri Peres：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、研究、正式分析、概念化。
Marco Aurelio Romano：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、研究、正式分析。
Paulo Cezar de Freitas Mathias：撰写 - 原稿、资源、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。