《Nutrition Research》：Protein substitutes used in the treatment of Phenylketonuria distinctly modulate gut nutrient absorption and bacterial growth – an in vitro study
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卡塔琳娜·罗德里格斯（Catarina Rodrigues）|沙米拉·伊斯梅尔（Shámila Ismael）|安娜·丽塔·蒙特罗（Ana Rita Monteiro）|玛丽亚·若昂·阿尔梅达（Maria Jo?o Almeida）|蒂亚戈·诺罗尼亚（Tiago Noronha）
卡塔琳娜·罗德里格斯（Catarina Rodrigues）|沙米拉·伊斯梅尔（Shámila Ismael）|安娜·丽塔·蒙特罗（Ana Rita Monteiro）|玛丽亚·若昂·阿尔梅达（Maria Jo?o Almeida）|蒂亚戈·诺罗尼亚（Tiago Noronha）|吉尔贝托·马亚-桑托斯（Gilberto Maia-Santos）|伊瓦·费尔南德斯（Iva Fernandes）|康塞桑·卡尔豪（Concei??o Calhau）|阿妮塔·麦克唐纳（Anita MacDonald）|朱利奥·塞萨尔·罗查（Júlio César Rocha）|若昂·R·阿劳霍（Jo?o R. Araújo）|安娜·法里亚（Ana Faria）
葡萄牙里斯本新大学（Universidade NOVA de Lisboa）医学院（FCM）医学科学系（Faculdade de Ciências Médicas）NOVA医学院（NOVA Medical School）营养与代谢科（Department of Nutrition & Metabolism）
摘要
低苯丙氨酸（Phe）蛋白质替代品（PS），无论是L-氨基酸（L-AAs）还是添加了氨基酸的酪蛋白糖巨肽（CGMP-AAs），都是治疗苯丙酮尿症（PKU）的主要手段。鉴于肠道营养吸收和肠道微生物群在代谢调节中的核心作用，本研究探讨了不同PS对营养吸收和细菌生长的影响。研究假设L-AAs和CGMP-AAs会发挥不同的作用。使用Caco-2细胞（一种肠细胞的体外模型）来评估PS和乳清蛋白（WP）对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸类似物的吸收影响，以及它们对营养转运蛋白基因表达的长期影响。同时还评估了大肠杆菌（Escherichia coli）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和弗氏志贺菌（Shigella flexneri）的生长和代谢产物生成情况。结果表明，L-AAs降低了葡萄糖的吸收并下调了葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）的表达；虽然L-AAs对氨基酸和脂肪酸的吸收没有影响，但它们下调了L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）和肽转运蛋白1（PEPT1）的表达。CGMP-AAs对葡萄糖和脂肪酸的吸收没有影响，但抑制了氨基酸的吸收并上调了LAT1的表达。这些发现表明不同配方对营养吸收和转运蛋白基因表达具有特异性影响。所有PS都增加了细菌的数量，其中L-AAs的影响最为显著。L-AAs和WP加速了所有细菌种类的生长速度，而CGMP-AAs则选择性地促进了副干酪乳杆菌的生长，这可能具有类似益生元的作用。总之，PS显著调节了肠道营养吸收和细菌生长，强调了在PKU治疗中考虑其特定代谢影响的重要性，并需要进一步开展转化研究。
引言
苯丙酮尿症（PKU；OMIM编码：261600）是一种常染色体隐性遗传的苯丙氨酸（Phe）代谢障碍，主要由编码苯丙氨酸羟化酶（PAH）的基因突变引起[1]。PAH缺乏会导致血液和大脑中苯丙氨酸的积累，若不加以治疗，会导致神经认知和行为障碍[2,3]。
主要治疗方法是终身低苯丙氨酸饮食，并辅以低苯丙氨酸蛋白质替代品（PS）作为蛋白质的主要来源[4]。PS通常每天服用3-4次，可分为不含苯丙氨酸的L-氨基酸补充剂（L-AAs）或添加了氨基酸的酪蛋白糖巨肽（CGMP-AAs）[3,5,6]。酪蛋白糖巨肽（CGMP）是一种从乳清蛋白（WP）中提取的生物活性肽，天然含有较低的苯丙氨酸含量。但由于其氨基酸谱不完整，因此需要添加必需氨基酸和酪氨酸进行强化[4,7]。
近年来，一些研究（包括早期和晚期诊断的PKU患者）报告了并发症的发病率增加，包括糖尿病、血脂异常、肥胖和心血管疾病[8],[9],[10],[11]。然而，目前尚不清楚这些代谢并发症是由于疾病本身直接引起的，还是与限制苯丙氨酸的饮食有关，或是诊断时间的影响[12]。
葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等关键营养物质的肠道吸收对于维持代谢稳态和细胞功能至关重要[13]。在肠细胞中，特定的转运蛋白负责将营养物质从肠腔转运到血液循环中[13],[14],[15]。葡萄糖和脂肪酸的肠道吸收增加可能导致其血浆浓度升高，长期如此可能会导致高血糖[16]和血脂异常[17]。随着时间的推移，这些代谢变化可能增加胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的风险[18,19]。因此，研究PS是否影响肠道营养吸收对于揭示PKU患者并发症风险增加的机制至关重要。此外，鉴于这些患者长期摄入主要由游离氨基酸组成的PS，确定这种摄入是否改变肠道氨基酸吸收情况也非常重要。
肠道微生物群是栖息在胃肠道中的复杂微生物群体[20]。其组成受饮食（包括蛋白质来源）的强烈影响，从而导致特定微生物及其代谢产物的富集或减少[20],[21],[22]。这些微生物代谢产物，包括短链脂肪酸（SCFAs）、支链脂肪酸（BCFAs）和吲哚，会影响宿主的生理功能，如能量稳态、葡萄糖和脂质代谢以及炎症。因此，肠道细菌组成和代谢产物的变化与多种疾病的发展有关，包括肥胖、2型糖尿病和其他代谢紊乱[23]。考虑到这一点，PS对肠道微生物群及其代谢产物的有益或有害影响可能会影响PKU患者的肠道健康和胃肠道症状[24]。
鉴于肠道营养吸收和肠道微生物群在代谢调节中的核心作用，本研究旨在使用肠细胞体外模型探讨L-AAs、CGMP-AAs和WP对营养吸收的影响。同时，还评估了这些蛋白质来源对真正肠道细菌物种（如大肠杆菌（共生菌）、副干酪乳杆菌（益生菌）和弗氏志贺菌（致病菌）的生长和代谢产物的影响。研究假设L-AAs和CGMP-AAs会对营养吸收和细菌生长产生不同的影响。
章节片段
蛋白质替代品的制备
本研究中使用的粉末状PS包括L-氨基酸（Milupa PKU 3 Advanced，Nutricia，荷兰）和CGMP-AAs（Bettermilk，Cambrooke，美国马萨诸塞州）。水作为阴性对照，乳清蛋白（WP，100% Real Whey Protein，Prozis，葡萄牙埃斯波桑德）作为阳性对照。选择乳清蛋白作为对照是因为CGMP来源于这种完整的蛋白质[7]，因此可作为可靠的参考。每种PS和乳清蛋白每100克产品的营养成分见表1。
Caco-2细胞的细胞毒性
使用MTT试验评估了PS和WP对Caco-2细胞的细胞毒性（图1）。15 mg/mL浓度的CGMP-AAs、DWP和WP处理2小时后，细胞活力显著下降（图1A）。同样，12.5 mg/mL浓度的DWP和WP处理2小时后，细胞活力也显著下降（图1B）。然而，在上述浓度下处理24小时后，细胞活力没有显著变化（
讨论
近期研究显示，PKU患者的并发症发病率有所增加，如糖尿病、血脂异常、肥胖和心血管疾病[8],[9],[10],[11]。鉴于肠道营养吸收和肠道微生物群在代谢调节中的核心作用，本研究旨在使用肠细胞模型评估L-AAs、CGMP-AAs和WP对营养吸收的影响，以及它们对……
结论
这项开创性的体外研究表明，PS显著调节了肠道营养吸收和细菌生长。这些发现强调了在PKU患者中考虑不同PS摄入后潜在代谢反应的必要性。需要进一步的转化和临床研究来验证这些结果，并为优化该人群中PS的使用提供基于证据的策略。
作者贡献
概念构思：CR、AM、JCR、JRA、AF。数据整理：CR。数据分析：CR。资金获取：AF。研究实施：CR、SI、ARM、MJA、TN、GMS、CC、AM、JCR、JRA、AF。方法学设计：CR、JRA、AF。监督：AM、JCR、JRA、AF。初稿撰写：CR。修订与编辑：CR、SI、ARM、MJA、TN、GMS、CC、AM、JCR、JRA、AF。
资金来源
本研究得到了欧洲区域发展基金（ERDF）通过项目POCI-01-0145-ERDF-007746的支持，该项目由Competitividade e Internacionaliza??o – COMPETE2020计划资助；同时得到了葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过CINTESIS（R&D Unit，UIDB/4255/2020，UID/04923——综合健康研究中心）以及项目PTDC/BAA-AGR/7419/2020和2022.11716.BD的支持。实验工作在经过绿色认证的研究实验室中进行。
作者声明
阿妮塔·麦克唐纳（Anita MacDonald）从Nutricia、Vitaflo International和Merck Serono获得了研究资金和酬金。她是欧洲营养学家专家小组（Biomarin）的成员，Sapropterin咨询委员会的成员，ELEMENT咨询委员会（Danone-Nutricia）的成员，以及Arla和应用制药研究的咨询委员会成员。卡塔琳娜·罗德里格斯（Catarina Rodrigues）作为演讲者获得了PIAM的酬金，她的会议旅行费用也得到了PIAM的支持。
人工智能和人工智能辅助技术的声明
在本研究的准备过程中未使用任何人工智能或人工智能辅助技术。
CRediT作者贡献声明
卡塔琳娜·罗德里格斯（Catarina Rodrigues）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据整理、概念构思。沙米拉·伊斯梅尔（Shámila Ismael）：负责撰写、审稿与编辑、研究。安娜·丽塔·蒙特罗（Ana Rita Monteiro）：负责撰写、审稿与编辑、研究。玛丽亚·若昂·阿尔梅达（Maria Jo?o Almeida）：负责撰写、审稿与编辑、研究。蒂亚戈·诺罗尼亚（Tiago Noronha）：负责撰写、审稿与编辑、研究。吉尔贝托·马亚-桑托斯（Gilberto Maia-Santos）：负责撰写、审稿与编辑、研究。伊瓦·费尔南德斯（Iva Fernandes）：负责撰写、审稿与
