靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的嵌合抗原受体（CAR）外泌体治疗宫腔粘连（IUA）的开发

《Journal of Extracellular Vesicles》：Development of CAR Exosomes Targeting FAP for the Treatment of Intrauterine Adhesion

　　

工程化细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）已成为极具前景的无细胞免疫治疗平台。本研究旨在开发源自靶向成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞的EVs，并探究其生物学功能与治疗潜能。研究人员发现，这些FAP-CAR EVs能有效抑制宫腔纤维化，促进子宫内膜再生，并提高宫腔粘连（Intrauterine Adhesion, IUA）小鼠模型的妊娠率。重要的是，基于外泌体的疗法不影响胚胎发育或引发全身炎症，显示出相较于T细胞疗法更高的安全性。机制研究表明，虽然FAP靶向T细胞可抑制纤维化，但会诱发严重的细胞因子释放毒性，而EV策略完全避免了这一风险。这些发现共同表明，FAP是纤维化疾病干预的关键靶点，且CAR-T细胞来源的EVs代表了一种安全有效的基于囊泡的治疗模式。

本研究针对宫腔粘连（IUA）现有治疗手段复发率高且缺乏有效内膜再生机制的难题，探索了基于嵌合抗原受体（CAR）技术的新型免疫疗法。研究人员首先构建了包含约10⁶多样性的CAR-T细胞库，并在IUA小鼠模型中验证了FAP（成纤维细胞活化蛋白）作为纤维化关键靶点的潜力。研究发现，尽管FAP靶向的CAR-T细胞能有效清除病变细胞，但会引发致命的细胞因子释放综合征（CRS）。为解决这一瓶颈，研究人员转向开发无细胞治疗策略，成功制备了FAP靶向的CAR-T细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）。体内实验表明，该疗法不仅能显著逆转子宫内膜纤维化、恢复生育力，且未观察到系统性毒性。该研究成果发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

在研究技术方法上，研究人员采用了噬菌体展示技术构建人源scFv文库并进行体内负筛选，结合深度测序分析富集的CAR克隆；利用流式细胞术、免疫组化和定量PCR评估FAP在IUA模型及人类样本中的表达；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western blotting及纳米颗粒追踪分析（NTA）对CAR外泌体进行表征；采用标准的⁵¹Cr释放实验检测体外细胞毒性；并通过建立小鼠IUA模型评估体内治疗效果及生殖预后。

2.1 CAR库在IUA模型中显示出疗效与高毒性

研究人员构建了包含约2×10⁶独特CAR构建体的T细胞库。在IUA小鼠模型中，输注该库导致急性炎症反应和高死亡率，伴随血清淀粉样蛋白A3（SAA3）及多种促炎因子（如IL-6、CCL2）显著上调，证实了严重的CRS发生。然而，幸存小鼠的子宫组织病理显示，纤维化病灶显著减少，Col1a1、Timp1和Tgfb1等纤维化标志物表达下调，证明了CAR-T细胞库在抗纤维化方面的治疗潜力，但也凸显了其安全性挑战。

2.2 鉴定C21D5结合的抗原为FAP

通过对存活小鼠体内富集的CAR库进行深度测序，研究人员发现了一个高频富集的特异性克隆C21D5。通过免疫沉淀结合质谱分析，确定其识别的抗原为FAP。表面等离子共振（SPR）验证显示C21D5与FAP具有高亲和力结合。这表明在IUA微环境中存在强烈的抗原选择压力，FAP是驱动CAR-T细胞富集的关键靶点。

2.3 FAP⁺细胞在IUA小鼠模型和人类标本中高度富集

在IUA小鼠模型中，受损子宫角中FAP mRNA和蛋白水平显著高于正常侧及其他器官。临床样本分析显示，重度IUA患者子宫内膜中FAP阳性细胞频率显著高于轻中度患者。利用FAP基因敲除（FAP^–/–）小鼠进行的实验进一步证实，缺失FAP可显著减轻宫内粘连严重程度并下调纤维化基因表达，确立了FAP在IUA发病机制中的核心地位。

2.4 FAP靶向T细胞兼具疗效与毒性

体外实验证实，表达C21D5的CAR-T细胞能特异性裂解FAP阳性的3T3细胞，且CD4⁺和CD8⁺亚群均能被激活。然而，体内回输后，尽管能有效清除FAP阳性细胞并减轻纤维化，但绝大多数小鼠在24小时内出现CRS症状并于72小时内死亡。尝试联合IL-6阻断剂虽能消除毒性，却同时抑制了CAR-T细胞的体内扩增，导致治疗无效。

2.5 CAR外泌体逆转子宫内膜纤维化并恢复IUA模型小鼠的妊娠能力

研究人员建立了从CAR-T细胞中高效分离外泌体的方法。表征结果显示，CAR外泌体直径约为80纳米，携带功能性CAR分子，能浓度依赖性地结合并杀伤FAP阳性靶细胞，且该过程可被阻断抗体抑制。体内分布研究显示其具有良好的安全性。治疗实验中，多次给药显著降低了受损子宫中FAP阳性细胞数量及Col1a1、α-SMA、TGF-β1的表达，Masson染色显示胶原沉积大幅减少。生殖评估发现，接受CAR外泌体治疗的小鼠在受损子宫角侧的胚胎着床数与正常侧相当，且胚胎及胎盘发育正常，显著改善了因IUA导致的生育力受损。

在讨论部分，作者指出，尽管FAP靶向的CAR-T细胞疗法概念验证成功，但其在非恶性纤维化疾病中引发的严重CRS限制了临床应用。相比之下，CAR-EVs作为一种无细胞治疗策略，既保留了靶向清除FAP阳性成纤维细胞和调节纤维化信号网络的能力，又规避了活细胞输注带来的致瘤性及细胞因子风暴风险。研究强调了IL-6信号在维持CAR-T细胞于纤维化组织中存活与扩增的双重作用，解释了为何在IUA模型中阻断IL-6虽能保命却失效的原因。此外，该研究还揭示了FAP阳性成纤维细胞不仅是基质成分的贡献者，更是纤维化信号网络的调控者。CAR-EVs通过直接靶向和间接调节微环境重塑，在早期损伤修复阶段发挥最佳效果。

研究结论总结如下：本研究确立了FAP是IUA干预的关键靶点。虽然FAP靶向的CAR-T细胞疗法因严重的CRS相关毒性而在临床应用受限，但CAR-EVs提供了一种安全的替代方案，能有效限制纤维化进展并改善子宫内膜功能。未来的研究应侧重于优化这些治疗策略，重点关注IUA中免疫激活、炎症和组织修复之间复杂的相互作用，这对于开发安全有效的治疗方法以改善患者生殖结局至关重要。