迁移率、性成熟的时机以及居民群体的遗传多样性共同决定了轮虫在殖民过程中有效的基因流动情况

《Limnology and Oceanography》：Migration rate, timing of sex, and resident genetic diversity jointly shape effective gene flow during rotifer colonization

　　摘要

扩散是一个影响所有生物的复杂过程，其中定居阶段尤为重要。这一阶段取决于新栖息地的环境条件与居民种群和移民种群的生物特性之间的相互作用。尽管这些因素已经分别进行了研究，但它们的综合效应仍然知之甚少。为了填补这一空白，我们进行了一项受控的实验室实验，使用来自两个自然种群的克隆系的兼性繁殖轮虫Brachionus plicatilis作为研究对象——其中一个种群作为居民种群，另一个作为移民种群。我们研究了初始移民密度、居民种群的遗传多样性以及移民种群性繁殖时间的组合如何影响有效基因流。通过全基因组单核苷酸多态性（SNP）追踪技术，我们量化了移民对滞育卵库的贡献。研究结果表明，这三个因素——无论是单独还是相互作用——都显著影响定居成功率。具体来说，较高的移民密度、较低的居民种群遗传多样性和较早的移民种群性繁殖时间都与更大的有效基因流相关。值得注意的是，这些因素之间存在相互作用：高初始密度与较早的移民种群性繁殖时间结合时影响最大，而较低的居民种群遗传多样性则有利于延迟性繁殖的移民的定居。总体而言，我们的结果强调了多个相互作用因素共同塑造了殖民结果，并提供了关于扩散和繁殖如何共同驱动种群间基因流的机制性见解。扩散是一个基本的生态和进化过程，影响着所有生物（Dieckmann等人1999年；Havel和Shurin 2004年；Bonte和Dahirel 2017年）。作为一种进化上稳定的策略，扩散在整个进化史上一直受到青睐，因为它在高环境变异性的情况下最大化了种群的生存和繁殖成功率（Comins等人1980年；Dieckmann等人1999年；Bonte和Dahirel 2017年），并增加了种群随时间的持续存在机会（Comins等人1980年）。这一复杂过程包括三个主要阶段——离开、转移和定居——受到个体和物种特性以及环境因素的影响（Bonte等人2012年），这些因素共同作用改变了扩散的成本和收益（Kolar和Lodge 2001年；Tagg等人2005年；Montero-Pau等人2018年）。虽然一些研究已经收集了前两个阶段的直接证据（Vanschoenwinkel等人2008年；Moreno等人2016年），但定居阶段通常是通过遗传结构间接推断的（Louette等人2007年；Ortells等人2012年、2014年；Parry等人2023年）。因此，这一阶段仍然了解不足，特别是关于多个因素如何相互作用以决定在新栖息地的定居成功率（Kolar和Lodge 2001年；Montero-Pau等人2018年）。关键因素如繁殖压力（Richardson 2004年）、遗传多样性和繁殖策略可能会影响定居成功率。移民的数量和扩散事件的频率增加了成功到达新栖息地的概率（Blackburn等人2016年；Casssey等人2018年；Vedder等人2021年），从而减轻了环境筛选、人口随机性和小型创始种群低遗传多样性的影响（Simberloff 2009年）。在已占据的栖息地中，局部适应和居民种群的遗传多样性水平带来了额外的挑战，杂交优势或近交衰退起着关键作用（Ebert等人2002年）。虽然许多研究关注了移民的遗传多样性（Gamfeldt等人2005年；Crawford和Whitney 2010年；Aguirre等人2013年；Ottewell等人2014年；Hughes等人2019年），但较少有研究考虑居民种群的遗传多样性（Ebert等人2002年）。最后，与繁殖相关的策略，如高繁殖力或早期成熟策略，可以增强殖民能力（Stevens等人2014年）。与扩散成功相关的还有繁殖方式。例如，在植物中，无性（营养）繁殖是扩展已建立多年生种群的主要机制（Yang和Kim 2016年）。在变化的环境中——特别是当波动的时间尺度与世代时间相匹配或超过时——选择应该优化扩散和性繁殖之间的关系（例如，脊椎动物的性别偏向扩散或植物的两性结实），因为这两种策略都有助于提高生物适应性（Auld和Rubio de Casas 2013年）。从这个意义上说，兼性繁殖生物为研究扩散与性繁殖或无性繁殖投资之间的关系提供了一个极好的框架（Kokko 2020年），然而兼性繁殖在扩散中的作用仍然研究不足。尽管一些影响扩散定居阶段成功的因素之前已经被研究过（例如，Blackburn等人2016年），但它们尚未被综合考察。为了填补这一空白，需要采用多因素方法。我们提出了兼性繁殖的单生殖轮虫Brachionus plicatilis作为模型生物，以研究这些因素在定居过程中的共同作用。像B. plicatilis这样的单生殖轮虫栖息在临时水域系统中，是浮游生物群落的关键组成部分（Dobson和Frid 2008年）。它们通过周期性孤雌生殖进行繁殖，这种生命周期中主要以克隆（无性）繁殖为主，偶尔穿插着性繁殖（Wallace和Smith 2009年；Wallace等人2015年）。每个生长季节都从沉积物中的滞育卵开始，这些卵孵化成二倍体的无性雌性，它们通过孤雌生殖繁殖几代并产生基因相同的后代（Wallace等人2006年）。因此，轮虫种群可以被视为克隆的集合体（Gómez和Carvalho 2000年）。在Brachionus属中，性阶段的转变由种群密度触发（Carmona等人1995年、2011年；Stelzer和Snell 2003年）。性雌性产生的单倍体卵如果未受精会孵化成矮小雄性，如果受精则会孵化成滞育卵（Serra和King 1999年）。每个性雌平均产生2.8个滞育卵（最多5个；Gabaldón和Carmona 2015年），这些卵在沉积物中积累，不会对当前种群增长做出贡献。当有利条件恢复时，一部分可存活的滞育卵会孵化，开始一个新的生长季节（García-Roger等人2006年）。有趣的是，基因型在性繁殖时间上存在差异，反映了在投资于促进种群增长的无性后代与产生长期生存滞育卵的性后代之间的密度依赖性权衡（Serra和King 1999年；Aparici等人2001年；Carmona等人2009年；Franch-Gras等人2017年）。这种权衡决定了滞育卵的总数，并可能影响定居成功率。居民种群内的遗传多样性可能在轮虫的移民成功定居中起重要作用，特别是在只有少数个体殖民的栖息地中（Montero-Pau等人2018年）。在自然轮虫种群中，由于克隆侵蚀，遗传多样性在整个年度周期中会下降（Ortells等人2006年；Carmona等人2009年）。因此，导致居民种群近交衰退的克隆内繁殖可以为后来的移民创造定居机会。移民和居民之间的杂交后代可能表现出更高的适应性，从而促进种群间的基因流（Tallmon等人2004年；Frankham 2015年）。滞育卵由于其小尺寸和抗干燥性，是有效的传播媒介（Rivas等人2018年、2019年；Arenas-Sánchez等人2023年）。滞育卵通过水、风或动物媒介的被动传播对于维持种群结构至关重要（Vanschoenwinkel等人2013年）。虽然通常认为动物浮游生物的迁移率很高，特别是通过风传播（Brendonck和Riddoch 1999年；Cáceres和Soluk 2002年；Cohen和Shurin 2003年），但最近对轮虫的研究发现，迁移率并不像预期的那么高，但在临时池塘的干燥阶段可以显著增加（Moreno等人2016年；Rivas等人2018年；Parry等人2023年）。基于这些见解，我们设计了一个完全因素化的实验室实验，以测试三个特定因素如何相互作用影响兼性繁殖轮虫B. plicatilis的有效基因流。我们采用了来自两个不同地点的克隆的实验方法——一个作为居民种群，另一个作为移民种群——并操纵了（i）初始移民密度（低 vs. 高，分别对应于起始种群的2.5%和9.4%），（ii）居民种群的遗传多样性（单克隆 vs. 八克隆混合物），以及（iii）移民克隆的性繁殖时间（在性繁殖开始时早期 vs. 晚期）。通过追踪滞育卵库中移民特有的核和线粒体等位基因来量化有效基因流。我们的假设是，较高的初始迁移密度、较低的居民种群遗传多样性和较早的移民种群性繁殖时间将增加定居成功的几率。

材料与方法

实验种群和实验克隆的建立

在实验中，我们使用了从野外收集的滞育卵中获得的严格意义上的B. plicatilis克隆，以捕捉自然水平的遗传多样性。我们从西班牙东部的两个临时池塘中采集了样本：Atalaya de los Ojicos（ATA），一个位于Albacete的内陆闭流池塘（38.462097°N, 1.254912°W），被指定为居民种群；Torreblanca Sur（TOS），一个位于Prat de Cabanes-Torreblanca湿地自然保护区的沿海池塘（40.089170°N, 0.101480°E），作为移民种群。这两个种群属于不同的系统地理群组（Gómez等人2000年），这使它们成为后续分子鉴定的理想候选者。此外，没有观察到这些支系之间存在交配障碍的迹象（Jezkova等人2022年）。在干旱期间收集池塘的上层沉积物，并在实验室中4°C、黑暗条件下储存，直到实验开始。然后使用蔗糖浮选技术从沉积物中提取滞育卵（Gómez和Carvalho 2000年）。根据它们的形态，将疑似B. plicatilis的滞育卵分离到含有200 μL盐水（Instant Ocean?，Aquarium Systems；盐度6 g L?1）的聚苯乙烯96孔板中，并在标准孵化条件下培养（即，恒定光照下的光合有效辐射（PAR）为35 μmol quanta m?2 s?1，温度25°C，持续28天（García-Roger等人2006年）。在此期间，每天检查孔洞中是否有幼体出现，如果发现，则添加50 μL轮虫培养基。这种培养基由12 g L?1盐度的人工海水（Instant Ocean?，Aquarium Systems）组成，富集了f/2培养基（Guillard和Ryther 1962），并含有Tetraselmis suecica（Kylin）Butcher 1959（IATS-CSIC微藻培养收集）作为食物，浓度约为500,000细胞/mL。由于滞育卵是性繁殖的结果，每个孵化的雌性代表一个独特的基因型。在几天的无性繁殖后，建立了克隆培养。轮虫克隆被转移到13 mL培养基中，并在20°C、恒定光照（PAR：35 μmol quanta m?2 s?1）下作为储备培养。这些条件（以下简称标准培养条件）用于藻类培养、轮虫储备克隆的维护以及实验（见下文）。由于B. plicatilis属于一个隐秘物种复合体（Gómez等人2002年；Suatoni等人2006年；Mills等人2017年），并且一些物种与B. plicatilis共存于所研究的池塘中（Montero-Pau等人2011年），因此特别注意确保准确的物种鉴定。因此，使用形态学区分来区分共存形态类型中的B. plicatilis克隆（Ciros-Pérez等人2001年；Dimas-Flores等人2013年），并通过线粒体COI基因片段的限制性片段长度多态性（RFLP）分析来区分同一形态类型内的物种（Franch-Gras等人2017年）。总共建立了来自TOS的30个克隆和来自ATA的8个克隆，并在标准条件下作为储备培养，直到它们在实验中的使用。这些克隆在建立后不久进行了性繁殖时间的生物测定。

性繁殖时间的测定

通过进行生物测定来估计性繁殖开始的密度阈值，研究了实验中使用的所有克隆的性繁殖时间。共进行了114次生物测定（38个克隆×3次重复），采用Carmona等人（2009年）和Franch-Gras等人（2017年）的方法进行调整。轮虫克隆在标准条件下以低种群密度（每个培养皿1个雌性）复制并预培养三代，同时定期更新培养基（每天用初始浓度为250,000细胞的T. suecica更新），以控制母体效应并避免在生物测定前诱导性繁殖（Stelzer和Snell 2006年）。每个克隆通过Franch-Gras等人（2017年）描述的程序维持三个独立的亚系。这种方法确保了三个克隆内重复之间的独立性，从预实验培养开始。在生物测定中，每个F3新生雌性被放置在一个含有15 mL新鲜培养基的Petri皿中，其中含有初始浓度为500,000细胞的T. suecica。F3型雌性被允许生长和繁殖，每24小时监测一次，直到观察到第一个雄性个体，这是性繁殖开始的可靠指标（Aparici等人2001年；Gabaldon和Carmona 2015年；Franch-Gras等人2017年）。此时，培养物用卢戈尔溶液（最终浓度4%）固定，并记录培养物中雌性的密度（Aparici等人2001年）。在较低密度下就开始性繁殖的克隆表明在浮游生长季节性繁殖发生较早。相反，需要较高密度才能开始性繁殖的克隆则被认为在生长季节性繁殖发生较晚。

为了测试可能影响B. plicatilis有效基因流的三个因素，我们模拟了移民克隆的入侵——在开始时进行一次接种——到一个已经由本地种群占据的地点。实施了多因素设计：（1）移民的性繁殖时间（早期 vs. 晚期，基于之前的生物测定）；（2）初始移民密度（9.4% vs. 2.5%）；（3）本地种群的遗传多样性（单克隆 vs. 八克隆混合物）（图1）。对于第一个因素，我们从移民种群中选择了五个性繁殖时间最早的克隆和五个性繁殖时间最晚的克隆（如上所述）。每个本地种群中引入了五个携带两个卵子的无性繁殖雌性作为移民。每个种群被单一克隆的个体入侵，每种类型的五个克隆作为重复实验。对于第二个因素，通过调整体积（9.4%移民密度为250毫升，2.5%移民密度为1升）来保持恒定的密度（0.2个个体/毫升）。因此，最初的高迁移处理包含5个移民和48个本地个体（来自ATA的无性繁殖雌性），而最初的低迁移处理包含5个移民和192个本地个体。对于第三个因素，低遗传多样性处理由一个本地克隆（单克隆种群）组成——性繁殖时间适中；而高遗传多样性处理混合了八个克隆，每个克隆贡献相同数量的雌性。

为了研究迁移率、性繁殖时间和本地种群的遗传多样性对有效基因流的影响，我们模拟了移民克隆的入侵——在开始时进行一次接种——到一个已经由本地种群占据的地点。实施了多因素设计：（1）移民的性繁殖时间（早期 vs. 晚期，基于之前的生物测定）；（2）初始移民密度（9.4% vs. 2.5%）；（3）本地种群的遗传多样性（单克隆 vs. 八克隆混合物）（图1）。对于第一个因素，我们从移民种群中选择了五个性繁殖时间最早的克隆和五个性繁殖时间最晚的克隆。每个本地种群中引入了五个携带两个卵子的无性繁殖雌性作为移民。每个种群被单一克隆的个体入侵，每种类型的五个克隆作为重复实验。对于第二个因素，通过调整体积（9.4%移民密度为250毫升，2.5%移民密度为1升）来保持恒定的密度（0.2个个体/毫升）。因此，最初的高迁移处理包含5个移民和48个本地个体（来自ATA的无性繁殖雌性），而最初的低迁移处理包含5个移民和192个本地个体。对于第三个因素，低遗传多样性处理由一个本地克隆（单克隆种群）组成——性繁殖时间适中；而高遗传多样性处理混合了八个克隆，每个克隆贡献相同数量的雌性。

图1展示了用于研究迁移率、性繁殖时间和本地种群的遗传多样性对有效基因流影响的实验设置示意图。单克隆和多克隆处理分别指1个和8个克隆。高（9.4%）和低（2.5%）迁移率指的是初始移民密度，所有处理中的密度保持相等（0.2个个体/毫升），但在不同体积下培养（分别为1升和250毫升，由不同大小的烧瓶表示）。因此，高迁移处理开始时有5个移民和48个本地个体，而低迁移处理开始时有5个移民和192个本地个体。在之前的生物测定中选择了早期和晚期繁殖者，以评估性繁殖的开始时间。为了获得足够的雌性进行实验，所有实验克隆都在大体积培养基中培养，以维持高种群规模，同时防止性繁殖过早发生。总共建立了40个实验种群（2种迁移率 × 2种遗传多样性水平 × 2种性繁殖时间水平 × 5个重复实验）。这些实验种群以250,000个细胞/毫升的微藻浓度开始，并在整个实验过程中在轨道摇床中以温和的搅拌条件下维持。实验持续时间为20天（大约15代无性繁殖）。由于B. plicatilis雌性的世代时间较短，这个时期足以让早期和晚期克隆达到足够的密度以诱导性繁殖并产生滞育卵，同时防止新产生的滞育卵孵化（Gabaldón等人2015年；Tarazona等人2017年）。此外，野外观察（例如，Montero-Pau等人2011年）表明，在自然的B. plicatilis种群中类似的短生长季节很常见。在第10天，向培养物中补充浓缩藻类以恢复初始细胞浓度，同时保持培养体积恒定。实验结束时，过滤培养物以分离产生的滞育卵，然后计数并收集这些卵进行DNA提取。为此，使用小玻璃研钵在Eppendorf管中手动剥去卵壳，并使用JETFLEX基因组DNA纯化试剂盒（Invitrogen）按照制造商的协议提取DNA。为了通过扩增子测序来衡量基因流作为定居成功的代理指标，我们追踪实验种群中特定于移民的等位基因的频率。通过对每个TOS克隆和ATA克隆混合物进行全基因组测序（深度为10倍），识别出每个种群中的私有双等位基因单核苷酸多态性（SNPs）。样本的DNA提取遵循上述协议。总共构建并使用Illumina技术测序了150个配对末端基因组文库。读取数据通过长度和质量进行过滤，并使用Trimmomatic去除接头。然后将清洁后的读取数据映射到轮虫参考基因组（NCBI: ASM1027981v1），并使用FreeBayes进行SNP调用。使用自定义Python脚本过滤低质量SNPs和基因型，保留所有TOS样本共有的纯合等位基因但ATA中不同的SNPs。最后，选择了三个SNPs（两个核SNPs，QEOQ01000180.1_720451和QEOQ01000348.1_68624，以下简称nSNP1和nSNP2；以及一个线粒体SNP，AP009407.1_2719，以下简称mSNP），它们都具有保守的侧翼区域，从而可以设计引物进行扩增和基因分型。对每个实验种群产生的所有卵进行了池化DNA提取。使用Illumina平台上的扩增子测序确定这三个SNPs的等位基因频率，并结合唯一分子标识符（Unique Molecular Identifiers）以提高准确性（Crysup等人2023年；Peng和Dorman 2023年）。为了测量基因流作为定居成功的代理指标，进行了扩增子测序。

在进行主要分析之前，我们比较了ATA和TOS克隆的性繁殖时间，以验证两个种群的平均性繁殖时间是否不同。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性。由于TOS数据不符合正态性假设，因此使用非参数Wilcoxon秩和检验评估种群间的差异。差异的大小用Cliff的delta作为效应量进行量化。为了研究（1）性繁殖时间，（2）迁移率和（3）本地种群的遗传多样性对有效基因流的影响，我们首先关注核SNPs，因为它们反映了基因流中的双亲遗传模式。仅针对nSNP1构建了广义线性模型（GLM），因为它具有最多的读取次数。初步的比例测试（Wilson 1927）显示，在任何实验种群中，除了一个例外，两个核SNPs的频率没有显著差异。唯一的例外是一个试验中nSNP2的读取次数异常低（只有2次读取，而核SNPs的平均读取次数为767次）。nSNP1的读取计数数据的GLM将移民（成功）和本地个体（失败）的读取次数组合作为响应变量，假设错误服从二项分布。GLM纳入了上述三个因素作为解释变量，以及它们之间的所有交互作用。通过卡方检验评估效应的统计显著性。通过比较nSNP1和mSNP的移民等位基因频率模式，我们评估了入侵克隆的雄性和雌性在其定居过程中的不同作用。为此，我们构建了一个广义线性混合效应模型（GLMM），用于比较移民与本地个体的读取次数，假设错误服从二项分布。作为解释变量，广义线性混合效应模型包括SNP类型（核或线粒体）以及由性繁殖时间（早期 vs. 晚期）、迁移率（低 vs. 高）和本地种群的遗传多样性（单克隆 vs. 多克隆）的组合水平引起的八级处理因素，以及处理和SNP类型之间的交互作用。由于核和线粒体SNP的读取次数数据不是独立的——即它们是在相同的移民克隆中测量的——因此将克隆身份作为随机效应因素纳入模型。在这个模型上，我们进行了先验对比，以探索在每个处理水平的核和线粒体移民等位基因频率的差异。最后，生成了一个额外的GLM来检查三个研究因素对入侵实验期间产生的滞育卵数量的影响。为了考虑实验种群之间的体积差异，我们使用卵密度而不是卵数量作为响应变量。假设错误服从泊松分布，并使用卡方检验评估效应的显著性。所有分析均使用R 4.4.1统计软件（R Core Development Team）进行。广义线性模型和广义线性混合效应模型使用“lme”包中的glmer函数运行（Bates等人2015年）。卡方相关检验使用“car”包中的Anova函数进行（Fox和Weisberg 2018年）。我们使用“performance”包中的check_model函数（Lüdecke等人2021年）定性评估所有模型的假设，并使用同一包中的check_overdispersion函数评估过度离散。对nSNP1的读取计数数据的二项GLM显示了中等程度的过度离散。尽管如此，该模型的拟合优度（通过均方根误差评估）得出的结果与考虑准二项分布时得到的结果相同。因此，假设了第一种错误分布。使用“emmeans”包中的contrast函数（Lenth 2025年）进行了移民与本地个体读取的先验比较。使用“stats”包中的prop.test函数（R Core Team 2024年）进行了初步的比例测试，比较了每个实验种群中nSNP1与nSNP2的频率。最后，使用wilcox.test进行了Wilcoxon秩和检验，并使用cliff.delta（来自“effsize”包）的cliff.delta估计了效应大小。

生物测定显示ATA（本地）和TOS（移民）种群中的克隆在性繁殖时间上存在显著差异。ATA克隆的平均性繁殖起始密度为16.9个雌性/毫升（中位数=16.2），而TOS克隆的平均性繁殖起始密度为5.9个雌性/毫升（中位数=3.8），大多数克隆在低于5个雌性/毫升的密度下开始性繁殖（图2）。在TOS克隆中，被分类为早期性繁殖者的平均密度阈值为1.7个个体/毫升，而晚期性繁殖者在16.9个雌性/毫升时开始性繁殖。种群间的差异具有统计学意义（Wilcoxon秩和检验，W=201，p值<0.001），对应于较大的效应量（Cliff的δ=0.795，95%置信区间[0.50, 0.92]）。图2显示了本地（Atalaya de los Ojicos, ATA）和移民（Torreblanca Sur, TOS）克隆开始性繁殖的密度。灰色点代表每个克隆的性繁殖起始密度（三个重复实验的平均值）。在移民种群中，选出的用于入侵性实验的克隆被突出显示：蓝色点对应于性繁殖最早开始的克隆（即最低密度阈值），而红色点对应于性繁殖最晚开始的克隆（即最高密度阈值）。框显示了克隆均值的中位数和四分位数范围（第25至第75百分位数）。单个点代表每个克隆重复实验的平均值。入侵性实验中移民等位基因频率的变化表明，所有三个实验因素显著影响了有效基因流（图3）。在所有实验条件下，具有高迁移率和单克隆居民种群的种群中观察到了最高的入侵成功率，尤其是在移民早期进行性繁殖的情况下。相反，在低迁移率和遗传多样性高的居民种群中，有效基因流最低，无论移民的性繁殖时间如何。基于广义线性模型（GLM）的分析确认了迁移率（p值<0.001）和性繁殖时间（p值<0.001）的显著正面效应，而居民种群的遗传多样性对有效基因流有显著的负面影响（p值<0.001）。这些变量之间的相互作用也对有效基因流有显著影响（迁移率×遗传多样性，p值=0.024；迁移率×性繁殖时间，p值<0.001；性繁殖时间×遗传多样性，p值<0.001；迁移率×性繁殖时间×多样性，p值=0.007）（表1）。图3。

对于每种因素组合，nSNP1的移民等位基因频率如下：迁移率（分别为9.4%和2.5%，高和低），居民种群的遗传多样性（单克隆和多克隆），以及性繁殖时间（早期和晚期）。x轴显示了性繁殖开始的密度，这是性繁殖时间的倒数。虚线表示初始移民的比例（等于迁移率）。基于二项分布显示了95%的置信区间。表1列出了用于分析核SNP频率的GLM中的因素，包括自由度、卡方统计量和p值。

比较线粒体和核SNP的等位基因频率显示，在八个处理组合中的七个组合中存在显著差异（图4）。在以多克隆居民种群和早期性繁殖为特征的两个组合中，观察到nSNP1的频率较高，无论迁移率如何。在其余存在显著差异的组合中，观察到mSNP的频率较高。唯一没有显著差异的组合对应于低迁移率、单克隆居民种群和早期性繁殖的移民。图4。

对于每种因素组合，nSNP1和mSNP的移民等位基因的平均频率如下：迁移率（分别为9.4%和2.5%，高和低），居民种群的遗传多样性（单克隆和多克隆），以及性繁殖时间（早期和晚期）。虚线表示初始移民的比例（等于迁移率）。数值是基于克隆的平均值，显示了平均值的标准误差。黑色星号表示根据广义线性混合效应模型分析，线粒体和核SNP频率之间存在显著差异（p值<0.05）。实验种群中休眠卵的产生情况差异很大，居民的遗传多样性有明显的影响。单克隆居民种群始终表现出最低的休眠卵密度，范围从0.08到0.82个卵/mL，而多克隆居民种群的卵密度较高，范围从2.40到7.77个卵/mL，无论迁移率如何（图5）。GLM分析确认，居民种群内的遗传多样性水平是唯一对休眠卵密度有显著正面影响的因素（p值<0.001；表2）。

实验结束时产生的休眠卵密度如下：迁移率（分别为9.4%和2.5%，高和低），居民种群的遗传多样性（单克隆和多克隆），以及性繁殖时间（早期和晚期）。具体统计结果见表2。只有主要因素遗传多样性具有显著性，多克隆居民种群的卵密度较高。表2列出了用于分析实验结束时产生的休眠卵密度的GLM中的因素，包括自由度、卡方统计量和p值。

讨论

与我们的假设一致，B. plicatilis的有效基因流在迁移率增加、居民种群遗传多样性降低以及移民早期性繁殖的条件下更高。我们的发现强调了考虑多个相互作用的生态和遗传因素的重要性，因为它们的效应不是独立的，而是协同的。此外，与之前通过遗传结构的空间模式间接推断扩散或定居的研究不同（Bilton等人2001；Gómez等人2002；Mills等人2007），我们的方法实验性地量化了有效基因流，即移民对居民种群休眠卵库的实际遗传贡献。此外，我们的实验设计允许我们在受控条件下操纵因果因素——迁移率、移民的繁殖特征和居民的遗传多样性，从而直接评估这些特征如何相互作用以确定种群间的有效基因流。本研究的一个关键发现是，早期性繁殖增加了B. plicatilis克隆入侵成功的可能性。人们可能会认为早期性繁殖的克隆产生的休眠卵较少，因为它们在达到较大种群规模之前就投入了繁殖。然而，那些较早开始性繁殖的克隆的等位基因在卵库中的频率增加了。这种效应在移民不利的情况下尤为显著，即迁移率低且居民种群遗传多样性高的情况下。这一结果为繁殖物候在扩散过程中的关键作用提供了新的见解。通过早期产生休眠卵，移民克隆可以利用资源 and 配偶竞争减少的时间窗口。这种策略可能有助于抵消无性繁殖和有性繁殖之间的权衡（Serra和King 1999；Innes和Singleton 2000；Montero-Pau等人2014），同时在面对不确定环境时确保产生休眠卵。探索扩散克隆中早期性诱导与扩散之间的潜在联系将是未来研究的一个有趣方向。此外，早期性繁殖可能有助于保持休眠卵库中的遗传多样性，因为克隆选择在生长季节逐渐侵蚀种群的遗传多样性（Pfrender和Lynch 2000；Gómez和Carvalho 2000；De Meester等人2006；Ortells等人2006；Carmona等人2009）。保持休眠卵库中的高遗传多样性增强了种群面对新环境或变化环境的适应潜力（例如，Hurst和Peck 1996；West等人1999；Tagg等人2005）。

我们的分析显示，移民雄性和雌性在定居过程中对遗传更新的贡献不同。在大多数处理中，移民的线粒体SNP频率高于核SNP频率，表明移民雌性对基因库的贡献大于移民雄性。这表明移民雌性主要与居民雄性交配，特别是在移民性繁殖较晚的情况下，因为居民雌性较早开始性繁殖。因此，当移民雌性开始繁殖时，许多居民雄性已经可以交配。相反，在居民遗传多样性高且移民早期性繁殖的种群中，核SNP的频率超过了线粒体SNP的频率，表明雄性介导的基因流更大。这种模式可能是因为移民雌性较早开始性繁殖，使移民雄性能够使居民雌性受精。一些居民克隆在性繁殖时间上的变异性可能促进了这一过程，因为一些居民克隆可能足够早地开始性繁殖，与移民同时进行。有趣的是，在低迁移率、单克隆居民种群和移民克隆早期性繁殖的处理中，没有观察到线粒体和核SNP频率之间的差异。这种模式表明移民和居民之间的交配有限，移民克隆在居民克隆变得性活跃之前就开始了性繁殖，有效地阻止了基因交换。然而，这种模式在高迁移率的处理中并未持续，可能是因为移民数量的增加提高了在有限空间内与居民相互作用的可能性。这些发现强调了繁殖时间在入侵成功中的复杂性，并突出了雄性和雌性在扩散过程中的不同贡献。它们表明，繁殖时间不仅对扩散者的生存至关重要，还影响居民和移民种群之间的杂交和基因流模式。居民种群的遗传多样性似乎解释了部分建立成功的原因。我们的结果表明，即使在低迁移率下，居民种群中的低遗传多样性也可能促进移民的定居。在单克隆居民种群中，移民等位基因的频率始终超过初始迁移率，而在多克隆种群中，移民等位基因的频率接近或甚至低于其初始频率。有趣的是，Ebert等人（2002）在Daphnia中实验性地证明，当居民种群近交时，移民和居民之间的杂交是有利的。因此，预计移民在生长季节的后期会更成功，因为此时克隆选择已经侵蚀了居民种群的遗传多样性（Pfrender和Lynch 2000；De Meester等人2006；Ortells等人2006，2014；Louette等人2007）。另一方面，如果在生长季节初期孵化率低，那么在生长季节初期也可能有成功的定居机会。据认为，浮游动物种群的遗传结构受到创始人效应的强烈影响（所谓的垄断假说；De Meester等人2002）。根据这一假说，一旦循环无性生殖的种群建立起来，移民的入侵将非常具有挑战性，因为居民种群达到了高密度。然而，这一假说没有解释居民种群的遗传多样性如何影响定居过程。这是一个非常有趣的问题，可以通过像我们这样的实验设计来探讨，其中居民既有种群数量上的优势也有适应上的优势，正如垄断假说所假设的那样，同时也会测试不同的遗传多样性水平。值得注意的是，在我们的实验中，居民和移民克隆都是从自然种群中收集的休眠卵中建立的，并且没有适应实验室条件。尽管如此，居民（ATA）和移民（TOS）克隆来自不同的自然种群，具有各自的进化历史，因此不能完全排除对实验室条件的微妙差异。然而，这些种群栖息在相似的盐沼环境中，经历的环境条件相似，因此不太可能出现强烈的适应分歧。实验的目的不是测试局部适应，而是使用遗传上不同的种群作为可追踪的来源，以量化移民对休眠卵库的有效贡献。这种设计使我们能够评估居民遗传多样性是否可以限制移民等位基因融入休眠卵库，正如垄断假说所预测的那样。正如预期的那样，初始迁移密度对移民的有效基因流有强烈的正面影响，支持了理论模型，即高繁殖压力会减少种群间的遗传分化（Montero-Pau等人2018）。当与早期性繁殖结合时，这种效应尤为明显，进一步强调了移民数量和它们的繁殖时间是入侵成功的关键决定因素。值得一提的是，所测量的两种迁移率代表了不同的传播情景，承认这两个值可能超过了自然浮游动物群落中典型的有效迁移率。然而，这一决定是为了确保在实验时间和使用的种群规模内有足够的移民到达和建立，从而最小化随机灭绝或殖民失败的风险，这在小型实验种群中尤为常见。尽管与自然条件相比两者都相对较高，但我们的结果揭示了两种迁移率之间的明显和一致差异。我们的研究结果还表明，居民群体的遗传多样性对滞育卵的产生有显著的正面影响：单克隆居民群体的卵密度明显低于多克隆群体。一个可能的解释是，在单克隆实验群体中，基因相同的个体之间进行交配会导致近交衰退，从而降低卵的产量和存活率（Tortajada等人，2009年）。此外，可能存在克隆内部的生殖障碍，这些障碍减少了同一克隆中的雌雄个体交配的可能性，进一步降低了滞育卵的产量（Jezkova等人，2024年）。与此模式一致的是，另一个影响因素可能是生殖期的持续时间。在多克隆群体中，不同克隆之间的性成熟时间存在差异，延长了雄性和可繁殖雌性共存的时间，从而增加了滞育卵产生的机会。相比之下，单克隆群体同步开始性成熟，导致交配窗口较短，滞育卵的产量减少。将实验结果转化为合理的生态场景虽然具有参考价值，但必须谨慎进行，因为实验室条件与自然系统之间存在重要差异。我们的研究旨在探讨初始移民比例、遗传多样性和性成熟时间之间的机制性相互作用，这些条件与临时水体环境具有广泛相关性。然而，一些具体限制因素限制了结果的直接外推。首先，自然池塘中的基因型和表型多样性通常远大于我们的实验群体，这可以缓解奠基者效应并改变种群建立的过程。其次，如上所述，实验中使用的初始移民频率高于典型的背景迁移率；尽管偶尔的扩散事件（例如，在池塘干涸过程中风驱动的静止阶段迁移）可以暂时增加移民输入（Vanschoenwinkel等人，2008年；Moreno等人，2016年），但长期低水平的迁移可能会产生不同的结果。第三，我们的实验使用的是单一克隆的群体（因此没有改变移民的遗传组成），这限制了我们对移民多样性在种群建立中作用的研究。第四，在自然群体中，居民个体通常会适应其特定的环境条件，从而降低移民的有效基因流。然而，正如之前讨论的，我们的实验中并未出现这种情况。第五，随着时间的推移，实验室群体可能因代谢产物的积累而经历环境恶化，这可能有利于早期性成熟的克隆，因为在这种条件下滞育卵的产生可能会减少。然而，这种情况也可能发生在体积较小的自然群体中，例如临时池塘。第六，实验持续时间相对较短。然而，根据初始密度（0.2个体·毫升?1）和在20°C下的内在生长率（r）0.65天?1（Gabaldón & Carmona，2015年），早期和晚期克隆分别在大约3.3天和6.8天后达到各自的阈值。因此，两种策略都有足够的时间在实验时间内进行性成熟，尽管更长期的实验可以进一步验证这些差异的持久性。最后，实验室维护不可避免地忽略了关键的生态复杂性——捕食、多物种相互作用、空间异质性和长期环境变化，这些因素可能会影响生命史的表现，并使某些克隆比其他克隆更具优势。尽管存在这些限制，这种实验方法在研究轮虫扩散方面代表了重要的进展，并为未来研究奠定了基础，以弥合实验室发现与现实世界生态复杂性之间的差距，最终为其他生物体的扩散和种群动态研究提供理论和应用方面的见解。

作者贡献：
- 研究设计：Cristina Arenas-Sánchez、Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 方法开发：Cristina Arenas-Sánchez、Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 实验实施：Cristina Arenas-Sánchez、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 新试剂或分析工具的提供：Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 数据分析：Cristina Arenas-Sánchez、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 数据解释：Cristina Arenas-Sánchez、Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 图表和表格制作：Cristina Arenas-Sánchez
- 文章撰写：Cristina Arenas-Sánchez、Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 监督：Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 资金获取：Raquel Ortells、María José Carmona、Eduardo M. García-Roger、Javier Montero-Pau
- 项目管理：Raquel Ortells、Javier Montero-Pau

致谢：
我们非常感谢来自比利时VIVES应用科学大学的合作学生Gabriele Campanile在实验室生物测定和实验开发过程中提供的宝贵帮助。本研究得到了瓦伦西亚自治区创新、大学、科学与社会部（西班牙）资助的CIGE2021-139和CIPROM/2023/31项目、MCIN/AEI/10.13039/501100011033和欧盟ERDF“塑造欧洲”项目资助的PID2020114153GB-100项目，以及欧盟MCIU/AEI/10.13039/501100011033和ESF“投资你的未来”项目资助的FPU19/03779项目的支持。

利益冲突：
无

数据可用性声明：
原始数据和R脚本可在Zenodo.org上免费获取（https://zenodo.org/records/15496281）。本研究中生成的基因组数据已存入NCBI数据库，访问号为[PRJNA1228349]。