《mLife》：Emerging role of metagenomic next-generation sequencing in infectious disease diagnostics: Clinical integration and future directions
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传染病诊断已通过宏基因组二代测序（mNGS）实现变革，这是一种无偏倚的方法，可在单次检测中检测细菌、病毒、真菌和寄生虫。通过对样本中所有核酸进行测序，mNGS克服了传统检测的检测范围狭窄和周转缓慢的问题，显著提高了病原体检测的灵敏度。在脑膜炎/脑炎、脓毒症和肺
传染病诊断已通过宏基因组二代测序（mNGS）实现变革，这是一种无偏倚的方法，可在单次检测中检测细菌、病毒、真菌和寄生虫。通过对样本中所有核酸进行测序，mNGS克服了传统检测的检测范围狭窄和周转缓慢的问题，显著提高了病原体检测的灵敏度。在脑膜炎/脑炎、脓毒症和肺炎等疾病中，mNGS经常识别出常规诊断检测遗漏的病因，从而促进更早的病原体导向治疗，并在特定环境下改善临床管理和预后。这种方法对于患有非典型感染的免疫功能低下者、儿科患者和重症监护病房（ICU）患者尤为宝贵。目前，临床mNGS工作流程主要依赖于短读长测序平台（例如Illumina），而长读长平台（例如Nanopore、PacBio）则为快速或高分辨率应用提供了优势。优化的生物信息学和严格的质量控制对于可靠结果至关重要。除了临床诊断，mNGS还提供有关抗菌药物耐药性（AMR）和病原体系统发育的宝贵遗传数据，支持公共卫生和疫情监测（例如废水监测和变异株追踪）。当前的挑战包括区分定植与感染、定量解读测序数据以及降低成本和周转时间。展望未来，靶向Panel、快速自动化工作流程和宿主反应整合等新兴策略有望进一步缩短获得结果的时间并提高诊断特异性。伦理和监管框架的并行进展对于确保其负责任地实施仍然至关重要。为支持临床应用，已开发并实施了一个用于临床解读mNGS结果的标准化框架及相关培训。总体而言，mNGS可能会成为传染病诊断中日益重要的组成部分，持续的革新预计将扩大其临床和流行病学影响。
1 引言
传染病仍是全球发病和死亡的主要原因，及时、准确的病原体鉴定对于有效治疗至关重要。传统诊断方法，如培养、血清学和靶向PCR，受限于其狭窄的检测范围和较长的周转时间。这种诊断差距经常导致危重患者经历漫长且昂贵的“诊断奥德赛”，在高达50%的脑膜炎/脑炎或肺炎病例中，广泛、反复的检测未能产生明确原因。宏基因组二代测序（mNGS）已成为帮助克服这些限制的有力手段。通过对临床样本中所有核酸进行无偏倚测序，mNGS可在单次检测中检测细菌、病毒、真菌和寄生虫，无需任何先验假设。早期的概念验证案例突显了mNGS的临床价值，此后mNGS被应用于广泛的感染领域，产生了常规方法无法获得的诊断结果。荟萃分析和真实世界数据一致显示，相较于传统检测，其病因检出率更高。在发热待查（FUO）队列中，mNGS使诊断率较基于培养的策略翻了一番。mNGS还被证明在检测罕见病原体和合并感染方面具有价值，从而实现更早的靶向治疗和改善患者预后。一项多中心肺炎试验表明其具有临床意义：纳入mNGS后缩短了临床改善的中位时间。此外，mNGS还提供抗菌药物耐药性（AMR）和病原体谱系的基因组数据，支持个性化治疗和疫情追踪。然而，高昂的成本、数据的复杂性以及缺乏标准化目前阻碍了其作为常规临床实践的采用。除临床诊断外，mNGS在公共卫生监测方面也具有巨大潜力，环境测序方法已被证明能有效检测新发病原体并监测AMR。本综述总结了支撑技术、临床适应症、决策影响、质量框架以及将塑造临床整合的近期革新。
2 技术革新
2.1 测序平台的演变
高通量短读长测序仪如Illumina一直是临床mNGS的主力，提供高精度和深测序覆盖度。Illumina平台能够平行测序数百个文库，每次运行产生吉碱基（Gb）级数据，这对于检测低丰度病原体至关重要。优化后的台式工作流程可使Illumina测序在约14-24小时内产生结果。另一主要参与者BGI（MGI）推出了BGISEQ和DNBSEQ系列作为Illumina的替代方案，这些仪器利用DNA纳米球（DNB）阵列和联合探针锚定合成（cPAS）化学法进行大规模平行短读长测序，其成本效益和高质量数据确立了其作为临床mNGS可行平台的地位。第三代测序平台（如Oxford Nanopore和PacBio）有望扩展mNGS能力。Oxford Nanopore Technology（ONT）设备提供实时长读长测序，可实现超快速诊断，例如基于纳米孔的靶向测序（NTS）测定在血液感染中从抽血到出结果仅需约7小时，且其便携性允许床旁或现场测序。新的高精度化学方法（如Q20+ reads）正在缩小与短读长平台在准确度上的差距，尽管仍需进一步改进和验证。PacBio HiFi测序擅长生成高精度基因组，有助于完整的病原体表征和发现新型或未培养生物体。虽然PacBio较慢的通量和成本限制了其常规临床应用，但它在解析混合感染或重复基因组区域方面有特定用途。总的来说，这些测序平台的进步提高了mNGS的诊断灵敏度并缩短了周转时间，尽管区分病原体与背景核酸和污染物仍具挑战。图1展示了基于文献数据的mNGS性能指标比较雷达图，显示mNGS在灵敏度、多重检测和AMR预测方面优于培养和靶向PCR，但周转时间和成本仍是其劣势。因此，虽然第三代平台为特定应用提供了令人兴奋的前景，但常规临床mNGS诊断的基础仍然是Illumina和BGI/MGI平台提供的高通量、高精度短读长测序。
2.2 样本预处理与宿主核酸去除
临床宏基因组标本通常含有极高比例的人类核酸（>95%–99%），需要在测序前进行预分析策略以增强微生物信号。优化的湿实验方法，包括差速离心、选择性人类DNA/RNA去除（如rRNA去除和DNase处理）以及基于化学的宿主裂解，通常被用来减少宿主背景同时保留微生物核酸。在呼吸样本的系统评估中，简单的15分钟离心步骤在测试方案中实现了最高的病毒读段回收率。这些湿实验措施与下游的硅学（in silico）宿主读段扣除相辅相成，结合使用时能实质性提高检测到低丰度病原体的概率。
2.3 生物信息学流程优化
生物信息学的进步与测序硬件同等重要。关键的早期步骤是宿主读段扣除，临床标本常含有>99%的人类序列，硅学方法通过将读段比对到人类参考基因组（如GRCh38）并丢弃匹配的片段来富集微生物信号。一旦生成序列，计算分析必须快速从数百万读段中识别病原体。诸如UCSF的SURPI+等流程使用精选的参考数据库（如FDA-ARGOS）和分层分类算法。重要的是，任何未分类的读段都要经过从头（de novo）组装和翻译比对，从而能够检测新型或高度分化的生物体。国际组织开展发布指南和标准，例如ISO 24420:2023为鸟枪法宏基因组数据处理和质量评估提供了标准。AMR基因预测现已常规整合，序列数据与抗性基因数据库（CARD, ResFinder, NCBI）交叉引用，确保mNGS报告不仅包括鉴定的病原体，还包括潜在的耐药基因。管道性能可能有所不同，基准研究正在指导最佳实践。除基于规则的算法外，人工智能（AI）和机器学习（ML）正被探索用于改进mNGS分析，例如通过建立背景知识库和应用多维阈值来减少假阳性。在临床应用中，加速工作流程至关重要，策略包括预分析自动化以减少手动时间和批次效应、计算端加速以压缩分析时间，以及集成运行治理以稳定运行间性能。对于紧急适应症，分阶段的两层方法很实用——部署快速的靶向Panel或基于纳米孔的阅读直至（read-until）协议以获得临时结果，同时并行的短读长mNGS运行以捕获意外病原体和AMR决定因子。
2.4 质量管理与控制
随着mNGS从研究转向临床实验室，稳健的质量管理体系（QMS）至关重要。监管机构已开始发布相关指南，例如美国FDA于2023年授予基于mNGS的病毒检测突破性设备称号。实验室必须根据监管QMS指南（如FDA的21 CFR Part 820或CLIA要求）建立性能特征，包括运行内部控制。标准化协议得到了国际指南的协助，ISO 17822:2020提供了核酸扩增病原体检测的“实验室质量实践指南”。参与外部质量评估（EQA）或能力验证计划也在增加。为了解决标准化的需求，专家共识框架被开发出来以指导呼吸道mNGS结果的临床解读。整合宿主反应信息代表了补充直接病原体检测的前沿进展，结合宿主转录组分析已在一些概念验证研究中提高了诊断准确性。为了促进临床宏基因组学的实验室间一致性，最近建立的协调标准ISO 24420:2023规定了数据处理和质量评估的严格要求。采用这些标准与CLIA/FDA QMS要素相结合，加强了实验室间的可重复性和可审计性。
3 临床应用与决策影响
3.1 广泛的临床适应症与证据矩阵
mNGS已应用于广泛的传染病环境。在中枢神经系统（CNS）感染中，mNGS特别有价值，常规诊断往往失败。大型研究显示，mNGS在脑脊液（CSF）中的检出率显著高于培养和血清学检测，并且常作为唯一确诊手段。中国研究者亦贡献良多，一项针对成人脑膜炎/脑炎的比较研究发现，无偏倚mNGS与靶向扩增子Panel各有优势，提示互补使用。在CNS感染中，mNGS不仅能提高诊断灵敏度，还能直接指导治疗决策。在血流感染和脓毒症中，快速病原体鉴定至关重要。研究表明，mNGS和靶向纳米孔测序（NTS）的阳性率约为74.7%，是血培养（33.9%）的两倍多，且NTS可在约7小时内出结果，并能同时识别多重病原体和基因型耐药标记。在呼吸道感染（肺炎、结核和非结核分枝杆菌[NTM]）中，尽管面临共生菌群的挑战，mNGS已被证明在诊断非典型肺炎和肺结核（TB）方面具有价值，可将TB检出率从常规的~35%提高到~50%。一项针对中国ICU重症社区获得性肺炎（CAP）的多中心随机对照试验（RCT）提供了A级证据，表明mNGS可提高14天临床改善率并加快达到临床稳定。在其他新兴应用中，如心内膜炎、人工关节感染（PJIs）、眼科感染、皮肤软组织感染（SSTIs）以及发热待查（FUO）中，mNGS均显示出比传统方法更高的检出率和临床干预价值。图2提出了整合mNGS的临床诊断路径算法，强调在传统检测阴性或不确定时使用mNGS，特别是在危重疾病或免疫受损宿主中。表1总结了主要感染类别的临床证据，其中CNS感染和重症肺炎的证据等级最高（A级），显示mNGS带来了显著的绝对诊断率提升和治疗方案调整。
3.2 对治疗决策和成本效益的影响
多项研究和实践经验表明，mNGS结果确实会改变临床管理。数据显示，相当比例的患者根据mNGS结果调整了抗生素方案，包括降阶梯治疗或覆盖意外病原体。这种调整转化为更好的临床结果，例如在深部颈间隙脓肿和重症肺炎中，mNGS引导的治疗与更高的治疗成功率、更短的住院时间和ICU停留时间相关。在选定的危重感染中，早期病原学诊断可能改善生存率，系统评价显示mNGS引导的管理与显著降低的28天和90天死亡率相关。尽管mNGS的前期成本较高，但新兴证据表明，通过减少下游医疗支出和优化治疗，它具有成本效益。卫生经济学分析显示，在疑似呼吸道感染中添加mNGS可能带来净成本节约，这主要由缩短住院时间和降低药物成本驱动。因此，虽然在低急性或非自限性感染中广泛使用mNGS并不划算，但在高影响力场景（如危重患者、诊断不明或潜在疫情）中选择性部署被认为是合理的。
4 mNGS面临的挑战
4.1 区分感染与定植
准确解读宏基因组结果需要将真正的感染与定植或污染区分开来，特别是对于来自非无菌部位（如下呼吸道）的样本。一个结构化的半定量方法可能有帮助，包括：读段水平指标（独特读段、基因组覆盖度、微生物与人类RPM比率）；生物体特异性先验概率和致病性；内部/阴性对照和实验室“背景”数据库以降低反复出现的污染物权重；以及临床相关性（宿主免疫状态、影像学、炎症标志物和治疗的反应）。对于非无菌标本，较高的报告阈值和优势度标准可减少过度报告定植菌；而对于无菌区室（如CSF和血液），即使是很低水平的合理病原体信号也可能具有可操作性。在呼吸分枝杆菌病和侵袭性真菌病中，量身定制的阈值和区室特异性规则（如“中山标准”）在不实质性增加假阳性的情况下提高了灵敏度。最后，当mNGS检测到多种分类群时，提倡分层报告（优势/次要/微量）并附带解释性评论，明确说明因果关系的可能性并建议确认性检测。
4.2 处理意外或新型病原体
mNGS检测罕见和以前未知生物的能力意味着临床医生可能会面临不熟悉的名称。近年来，晦涩难懂的感染病例激增，这些发现通常需要专家咨询和仔细的文献回顾以确定其临床相关性和治疗意义。对于真正的新病原体，报告存在困境，管道可能组装出一个明确指示新物种的序列。策略之一是报告最接近的已知亲属以提供病原体类别的线索。持续策划数据库并纳入新发现的呼吸道病毒基因组是必要的，以便更快识别新病原体。国际间共享新序列的合作也是解决方案的一部分。
4.3 解读临床意义和整合结果
与简单的阳性/阴性测试不同，mNGS生成大量数据，通常需要专家解读。临床医生必须考虑诸如：鉴定的生物体是否可能是患者疾病的原因？多个生物体是否暗示多微生物过程？为了辅助这一点，mNGS报告现在通常包括额外信息，如比对上的读段数、基因组覆盖度甚至微生物丰度图表。一种结构化的报告方法将生物体分类为优势、次要和微量，并结合评论。此外，ISO标准和专家共识出版物正在出现以标准化结果解读。另一个固有的挑战在于传达诊断不确定性，特别是因为基于DNA的mNGS无法区分活生物体及其残留核酸。AI工具和ML算法正越来越多地被探索，通过整合宿主反应谱和微生物数据来促进解读。
4.4 阴性mNGS报告的临床意义
阴性mNGS报告应谨慎解读，不能视为确定性的排除性检查，特别是因为其预测值因样本类型而异。最近的研究强调，CSF和其他无菌体液中的假阴性率高得惊人，而血浆阴性结果在排除感染方面表现出更高的准确性。这种差异可能源于多种因素，包括低于检测限的病原体载量、难以裂解的生物体或其基因组在参考数据库中缺失。因此，阴性mNGS结果的临床权重必须根据感染的前验概率、具体样本来源和整体临床背景进行仔细校准。
5 mNGS的发展路线图
5.1 新兴技术与增强的工作流程
传染病诊断的下一个地平线涉及更快、更具靶向性的测序工作流程和宿主数据的整合。一个重要趋势是靶向NGS（tNGS）Panel作为无偏倚mNGS的补充。通过捕获或扩增数十种特定目标病原体，tNGS在这些靶标上实现了更高的深度，提高了灵敏度和周转速度。未来，混合方法很可能占主导地位：例如，对一组定义的病原体进行快速tNGS（结果在<6–12小时内），同时进行mNGS运行。另一个发展领域是超快速文库制备和测序，研究人员正在探索直接RNA测序、酶法文库制备试剂盒和纳米孔自适应采样（adaptive sampling）。从样本采集到结果解读的全自动一体化平台正在出现，减少了周转时间和人为错误。即时检测（POC）mNGS平台正在迅速发展，特别是Oxford Nanopore的MinION，它提供了便携、实时的测序能力，尽管其常规医院诊断使用仍受限于吞吐量和标准化工作流程。PacBio的平台虽然便携性较差，但提供高保真测序，能有效解析复杂的基因组结构、AMR基因和毒力因子。
5.2 临床整合策略（从实验室到床边）
为了使mNGS实现其潜力，必须将其有效地大规模整合到临床实践中。一种策略是发展区域mNGS参考实验室或网络，采用中心辐射型（hub-and-spoke）模式。另一个整合方面是制定医院指南和临床路径，规定何时以及如何使用mNGS。早期的医院级协议已经建立了明确的诊断标准。报告标准代表了另一个整合焦点，理想情况下，来自不同实验室的报告应具有通用格式。最后，教育和培训临床医生是关键的一步，将mNGS原则纳入传染病专科培训项目，并通过定期的病例研讨会展示mNGS如何解决诊断难题。
5.3 标准化与未来方向
随着领域的成熟，标准化将是确保mNGS测试在不同环境下可靠且可比的关键。优先事项之一是建立所有实验室都可以使用的参考标准和对照，例如具有已知成分的合成微生物群落。从监管角度来看，FDA正朝着监督像mNGS这样的高复杂性LDT（实验室自建检测）迈进，预计未来五年将出现首批FDA批准的mNGS诊断试剂盒。在国际层面，数据共享联盟正在讨论中，这可能允许汇集数千个mNGS病例，从而开发自动化的解读系统。最后，mNGS标准化的未来方向还将涉及临床实践指南，专业学会将发布关于宏基因组测序使用的指南或最佳实践声明。除临床环境外，mNGS在公共卫生监测方面具有巨大潜力，对环境样本（如废水、空气和媒介种群）的宏基因组测序可作为早期预警系统，捕捉临床爆发前的遗传信号。此外，mNGS显著增强了AMR基因流行和传播的监测，综合方法补充了传统的耐药性跟踪系统。未来几年将致力于完善和扩展临床医学中的mNGS，图3展示了过去二十年mNGS发展和采用的里程碑以及未来的预期进展。
