PAR2对胃食管反流病患者紧密连接和食管黏膜炎症的影响

《Neurogastroenterology & Motility》：Impact of PAR2 on Tight Junctions and Esophageal Mucosal Inflammation in Rats with Gastroesophageal Reflux Disease

　　**摘要**

**背景**
胃内容物反流会激活蛋白酶激活受体2（PAR2），这是胃食管反流病（GERD）病理生理机制中的关键步骤。Claudins是紧密连接（TJs）的主要组成部分，负责维持上皮细胞的屏障功能和极性，其功能障碍可能导致慢性炎症。本研究旨在探讨PAR2是否在GERD的发展中影响TJs。

**方法**
在体内和体外建立了GERD模型，并给予雷贝拉唑和/或GB-88（一种PAR2抑制剂）。测量了PAR2、Claudin-1和Claudin-4的表达量，以及M1巨噬细胞、跨上皮电阻（TEER）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。此外，还用SLIGKV-NH2（一种PAR2激动剂）和GB-88处理细胞，以验证PAR2对TJs的影响。

**结果**
雷贝拉唑改善了GERD大鼠的病理变化，降低了IL-8和IL-1β的浓度，并抑制了M1巨噬细胞的积聚。在体内实验中，雷贝拉唑抑制了PAR2的表达并增强了Claudin-1和Claudin-4的表达。在体外实验中，GB-88降低了PAR2及IL-8和IL-1β的浓度，并增加了Claudin-1、Claudin-4和TEER。GB-88与雷贝拉唑联合使用在恢复Claudin-4表达方面更为有效。

**结论**
在GERD中，PAR2表达升高通过下调和重新分布Claudin-1和Claudin-4来损害食管黏膜屏障功能，同时促进M1巨噬细胞分泌IL-8和IL-1β。

**关键词**
在GERD中，PAR2通过下调关键紧密连接蛋白（Claudin-1和Claudin-4）破坏黏膜屏障，并通过促进M1巨噬细胞积聚和驱动炎症细胞因子（IL-8和IL-1β）的分泌引发局部慢性炎症反应。

**缩写**
CD206：分化簇206
CD86：分化簇86
DIS：扩张的细胞间间隙
EGJ-CI：食管胃交界处收缩整合蛋白
ELISA：酶联免疫吸附测定
ERK1/2：细胞外信号调节激酶1/2
FoxM1：叉头框蛋白M1
FO XO1：叉头框O1
GERD：胃食管反流病
HE：组织病理学检查
HEECs：人食管上皮细胞
HIF-1α：缺氧诱导因子-1α
IF：免疫荧光
IHC：免疫组化
IL-1β：白细胞介素-1β
IL-8：白细胞介素-8
MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1
MIT：黏膜完整性测试
OD：光密度
PAR2：蛋白酶激活受体2
PARs：蛋白酶激活受体家族
PPIs：质子泵抑制剂
ROI：感兴趣区域
TEER：跨上皮电阻
Th1：1型辅助T细胞
TJs：紧密连接
TLR4：Toll样受体4
TNF-α：肿瘤坏死因子-α
TUNEL：TdT介导的dUTP末端标记
WB：Western blotting从食管-胃交界处开始，向上进行约1厘米的钝性解剖。同时，用4-0尼龙线对幽门进行半结扎（图1A）。我们完成了手术（图1B），并在第28天最终获得了食管组织。在假手术组中，大鼠下段食管的黏膜是完整的，基底层是平坦的（图1C）。在胃食管反流病（GERD）大鼠中，鳞状上皮发生增生，固有层的乳头延长，超过了黏膜层的3/4，并伴有淋巴细胞浸润（图1C）。给予雷贝拉唑后，这些病理变化显著改善。仅观察到少量的炎症细胞浸润（图1C）。GERD组的组织损伤评分为3.00±0.71，高于雷贝拉唑组（p<0.001，图1D）。雷贝拉唑在改善GERD的病理变化方面有效。此外，分别使用TUNEL和Ki67染色评估了细胞凋亡和增殖的程度。GERD食管组织中的Ki67阳性细胞比例（p<0.05，图1E）和TUNEL阳性细胞比例（p<0.05，图1F）均高于假手术组。雷贝拉唑治疗显著减轻了TUNEL阳性细胞的积聚（图1F）。

雷贝拉唑在改善GERD的食管病理变化方面有效。（A）心脏肌切开术和幽门半结扎；（B）培养系统的实验流程图；（C）用HE染色检查大鼠食管的组织病理变化，比例尺=100μm。（D）食管组织的组织损伤评分。数据以平均值±标准差表示。***p<0.001。n=5。（E）食管中的Ki67免疫组化染色（比例尺=50μm）以及各组中Ki67阳性细胞的定量。（F）食管中的TUNEL染色（比例尺=50μm）以及各组中TUNEL阳性细胞的定量。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05。

在GERD大鼠中，Claudin-1和Claudin-4的表达减少，而PAR2和M1型巨噬细胞增加。据报道，PAR2可能参与GERD的发病机制[25, 26]。在食管腔内，反流物质中的反复弱酸或丝氨酸可触发PAR2的激活[27]。PAR2介导炎症反应。我们进一步探讨了PAR2在GERD中关于紧密连接（TJs）和炎症因子的作用。免疫组化染色图像显示，GERD大鼠中的PAR2光学密度（OD）显著增加（p<0.01，图2A）。同时，观察到PAR2的细胞质染色增强（图2A）。Claudin-1和Claudin-4在黏膜中大量表达，防止小分子通过TJs扩散[28]。在假手术组中，Claudin-1和Claudin-4主要位于细胞膜上（图2B,C）。在GERD组中，观察到Claudin-1和Claudin-4的细胞质染色增强而膜染色减弱。Western blot显示，GERD大鼠中的PAR2表达量约为假手术组的两倍（图2E）。与假手术组相比，GERD组中的Claudin-1（p<0.001）和Claudin-4（p<0.05）显著下降（图2E），这与免疫组化结果一致。Claudin-1和Claudin-4的错误定位和表达减少表明TJs的结构受损。GERD大鼠食管组织中的IL-8水平升高至2093.96±684.08 pg/mL，而假手术组为591.96±108.31 pg/mL（图2F）。与GERD组相比，雷贝拉唑组中的IL-8水平显著降低（p<0.05）。GERD大鼠中的IL-1β浓度约为假手术组的2.02倍。雷贝拉唑治疗后，IL-1β浓度下降（p<0.01）。此外，通过免疫荧光（IF）染色评估了大鼠食管组织中的巨噬细胞变化。IF分析显示，GERD组中的CD86阳性细胞显著增加（p<0.05，图3B），表明M1型巨噬细胞浸润增强。雷贝拉唑治疗有效减少了这种积聚。GERD大鼠中的CD206阳性细胞比例显著降低至2.52%±0.64%，而雷贝拉唑治疗后的比例增加到21.78%±5.59%（图3C）。

在GERD大鼠中，Claudin-1和Claudin-4的表达减少，而PAR2增强。（A–C）大鼠食管组织中PAR2、Claudin-1和Claudin-4的代表性免疫组化染色图像及其相应的定量，比例尺=50μm（上）和10μm（下）。n=5。（D, E）大鼠食管组织中PAR2、Claudin-1和Claudin-4的Western blot分析及其相应的定量。（F）食管组织中IL-8和IL-1β的ELISA分析。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。n=3。

雷贝拉唑抑制了GERD大鼠食管组织中M1型巨噬细胞的表达。（A）食管组织中CD86阳性细胞（绿色）、CD206阳性细胞（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光（IF）染色图像，比例尺=50μm。CD86阳性细胞（B）和CD206阳性细胞（C）的定量分析。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。n=5。

在体外实验中，GB-88减少了Claudin-1和Claudin-4的表达。据报道，PAR2在某些慢性炎症疾病（如肠易激综合症）中下调紧密连接（TJs）的表达[29-32]。为了探讨PAR2是否调节GERD中的Claudin-1和Claudin-4，我们在细胞培养系统中添加了SLIGKV-NH2（一种PAR2激动剂）和GB-88（一种PAR2抑制剂）。TRYPsin组的PAR2表达量约为GB-88组的两倍（图4A）。GB-88有效抑制了PAR2。此外，GB-88组中的Claudin-1表达量增加到1.01±0.06，而TRYPsin组为0.59±0.10（图4A）。预先用GB-88处理的HEECs表达的Claudin-4多于TRYPsin组（图4A）。GB-88组中的IL-1β水平降至55.49±23.17 pg/mL，而TRYPsin组为107.97±10.26 pg/mL（图4B）。ELISA显示，GB-88组中的IL-8水平显著低于TRYPsin组（p<0.01，图4B）。

GB-88在体外减少了Claudin-1和Claudin-4的表达。TRYPsin组、SLIGKV-NH2组和GB-88组的HEECs在用SLIGKV-NH2和GB-88预处理后，分别接受0.65 nM的TRYPsin刺激6小时。（A）PAR2、Claudin-1和Claudin-4的Western blot分析。（B）细胞培养上清液中IL-1β和IL-8的ELISA分析。数据以平均值±标准差表示。*p或#p<0.05；**p或##p<0.01；***p或###p<0.001。*与对照组相比；#与TRYPsin相比。n=3。

为了探讨GB-88和雷贝拉唑的组合是否更有效，我们将细胞实验分为对照组、GB-88组、雷贝拉唑组和药物组合组。结果显示，药物组合组中的PAR2表达量低于GB-88组（p<0.05，图5A,B）。在Claudin-1的表达方面，雷贝拉唑组和药物组合组之间没有统计学差异（图5A,B）。药物组合组中的Claudin-4表达量高于GB-88组和雷贝拉唑组（p<0.05，图5B）。药物组合组中的IL-1β水平降至46.04±20.87 pg/mL，而GB-88组为70.33±2.66 pg/mL（图5C）。此外，雷贝拉唑组中的IL-8浓度（53.08±30.40 pg/mL）高于药物组合组（34.05±13.88 pg/mL；图5C）。为了评估PAR2在屏障功能中的关键作用，进行了TEER测量。GB-88组、雷贝拉唑组和药物组合组的TEER均显著高于TRYPsin组（p<0.001，图5D）。组合疗法在恢复TEER方面最为有效（96.80%±1.74%），而GB-88组和雷贝拉唑组分别为89.13%±2.30%和89.83%±1.02%（图5D）。

GB-88和雷贝拉唑的组合抑制了Claudin-4的表达。（A）用GB-88预处理或/和雷贝拉唑处理的HEECs中PAR2、Claudin-1和Claudin-4的Western blot电泳图。（B）PAR2、Claudin-1和Claudin-4的Western blot分析。（C）细胞培养上清液中IL-1β和IL-8的ELISA分析。（D）HEECs在Transwell插件上培养7天，用GB-88（100 μM）预处理2小时，在含TRYPsin的培养基（0.65 nM，pH=6）中孵育6小时，然后用含10%雷贝拉唑的培养基处理24小时。在GB-88处理后30小时的不同时间点测量TEER。数据以平均值±标准差表示。*p或#p或△p或▲p<0.05；**p或##p或△△p或▲▲p<0.01；***p或###P或△△p<0.001。*与对照组相比；#与TRYPsin相比；△与GB-88相比；▲与雷贝拉唑相比。n=3。

4. 讨论

GERD是一种常见的消化系统疾病，在西方国家的发病率很高，占这些地区与消化系统疾病相关的直接医疗成本的50%以上[33]。严重的GERD可能导致吞咽困难、出血和食管腺癌[34]。反流取决于侵袭性力量和防御力量之间的不平衡。食管黏膜屏障是防御力量的重要组成部分。尽管60%的GERD患者没有内镜可检测到的糜烂，但仍存在黏膜屏障缺陷，这可能有助于症状的发病机制[35]。屏障功能障碍可能表现为细胞间间隙（DIS）扩大，从而促进有害刺激渗透到食管黏膜下感觉神经元。即使是生理性的反流负荷也可能引发反流和烧心等症状[36]。食管黏膜屏障损伤是GERD发展的关键病理生理因素之一。在本研究中，PAR2的激活下调了Claudin-1和Claudin-4的表达，同时上调了IL-8和IL-1β的分泌，并促进了M1型巨噬细胞的积聚。GB-88和雷贝拉唑的组合可能通过增强Claudin-4发挥更大的作用。因此，我们揭示了PAR2与食管屏障功能障碍之间的先前未识别的机制，为GERD的临床管理提供了潜在的新治疗靶点。蛋白酶激活受体（PARs）是G蛋白偶联受体。PAR2作为PAR家族的成员，在整个胃肠道中表达。PAR2通过细胞外丝氨酸蛋白酶（如TRYPsin、激肽释放酶和凝血因子VIIa）的N端切割被激活。切割后，新暴露的N端配体与受体本身结合，从而启动下游信号通路。我们的实验结果表明，TRYPsin激活了PAR2并释放了大量IL-8和IL-1β。GERD患者的食管中PAR2表达上调。此外，PAR2与组织形态变化和症状的严重程度相关[25]。研究表明，PAR2激活了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路，并影响细胞骨架或促进TJs磷酸化以调节上皮通透性[37]。此外，PAR2激活通过forkhead box O1（FOXO1）依赖的通路诱导M1极化并引发炎症，导致IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的上调[38]。这一发现与我们的结果一致，表明PAR2可能参与M1型巨噬细胞的极化。GERD大鼠中的IL-6、IL-1β和IL-8水平显著升高，食管屏障损伤也被注意到[39]。食管上皮屏障功能受损时，鳞状细胞和感觉神经反复暴露于有害反流物中，导致症状出现。随着时间的推移，固有层和上皮变厚，基底细胞发生增生，乳头延长[40]。食管鳞状上皮细胞在酸和胆盐的作用下分泌IL-8和IL-1β，这些物质会招募中性粒细胞和巨噬细胞[41]。巨噬细胞释放的炎症细胞因子进一步破坏了上皮屏障。中性粒细胞分泌丝氨酸内肽酶，可能参与激活PAR2并进一步损害上皮的完整性[18]。此外，IL-1β独立调节神经源性食管肌肉收缩，从而增加黏膜暴露的可能性并加剧炎症[42]。在本研究中，PAR2表达的下调保护了食管黏膜屏障，PAR2抑制剂和雷贝拉唑的联合使用显示出更好的疗效。在生理条件下，食管的非角化分层鳞状上皮构成了一个强大的屏障，限制了离子的扩散，这对防止反流至关重要[43]。食管-胃交界处收缩完整性（EGJ-CI）和黏膜完整性测试（MIT）是屏障功能的指标。EGJ-CI的临界值为44.16，用于预测病理性的酸暴露，敏感性为46%，特异性为42%；MIT识别GERD的敏感性为76%，特异性为72%[44]。或许，在不久的将来，与食管屏障功能相关的指标将在临床实践中得到广泛应用。有研究表明，仅抑制胃酸分泌可能不足以缓解胃食管反流病（GERD）患者的症状。对质子泵抑制剂（PPIs）治疗无效的GERD患者约占GERD患者的30%，而黏膜屏障功能的受损是其发病机制之一[45]。黏膜屏障具有潜在的治疗价值[46]。雷贝拉唑能够激活芳烃受体，从而增加跨上皮电阻（TEER）以及Claudin-1、Claudin-2和Occludin的表达[47]；同时，它还能调节肠道微生物群，进而改善黏膜屏障功能[48]。与单独使用雷贝拉唑相比，GB-88与雷贝拉唑联合使用显著增强了Claudin-4的表达，而对Claudin-1的影响较小，这可能与两者C端结构域的氨基酸序列差异有关。Claudin-1与支架蛋白（如zonula occludens-1、occludens-2、occludens-3）的结合更为紧密，使其在紧密连接（TJs）中的定位更加稳定[49]。Claudin-1主要表达在基底层和棘层细胞中，而Claudin-4的分布较为局限，仅存在于上皮表层细胞中。Claudin-1主要维持高抵抗性的屏障，保护黏膜免受外部损伤；而Claudin-4则主要调节离子选择性通透性，以维持电解质平衡[50, 51]。需要指出的是，大鼠的食管是角化的，而人类的食管是非角化的，因此这一模型可能无法完全反映人类的病理生理过程。未来可以通过使用3D器官型或类器官模型来更准确地模拟人类食管黏膜的复杂性。此外，还需要通过利用PAR2基因敲除大鼠或给GERD大鼠使用GB-88来验证黏膜屏障和巨噬细胞的变化是否确实是由PAR2在体内的激活直接引起的。

5 结论
在GERD中，PAR2表达的增加导致Claudin-1和Claudin-4的表达减少和分布改变。同时，它还促进了M1型巨噬细胞的聚集以及IL-8和IL-1β的分泌。这些变化损害了食管黏膜的屏障功能。相比之下，GB-88与雷贝拉唑联合使用在恢复Claudin-4表达方面更为有效。

作者贡献
杜梦迪和王璐悦共同撰写了本文。段文倩负责动物实验，王伟进行了细胞实验。傅文尚负责数据的分析和整理。孙永顺设计了实验并进行了监督。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：81874402、82174128）的支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据获取
支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理请求后获得。