内生真菌 Hypoxylon anthochroum Smeg4 菌株产生的植物毒性挥发物组：时间动态变化及线粒体损伤作为潜在的除草机制

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Phytotoxic volatilome from the endophytic fungus Hypoxylon anthochroum strain Smeg4: Temporal dynamics and mitochondrial disruption as a promising herbicidal mechanism

　　玛莎·莉迪亚·马西亚斯-鲁巴尔卡瓦 | 杰奎琳·富恩特斯-哈梅 | 埃韦拉多·塔皮亚-门多萨 | 帕特里夏·拉佩-奥利维拉斯 | 冈萨洛·罗克-弗洛雷斯
墨西哥国立自治大学（UNAM）化学研究所，天然产物系，墨西哥城科约阿坎区大学城，邮编04510

**摘要**
本研究对内生菌Hypoxylon anthochroum Smeg4产生的挥发物组进行了全面的时间特征分析，并评估了其对四种杂草的植物毒性。挥发性有机化合物（VOCs）的多样性和丰度随培养时间的变化而变化，经历了四个不同的代谢阶段（第1组至第4组）。在初始阶段（第1-2天，第1组），单萜类化合物占主导地位，多样性较低（11-17种化合物）。第3天（第2组）发生了化学变化，随后桉叶醇开始大量存在，第4天首次检测到酯类化合物，如乙基乙酸酯。第5至9天（第3组）代谢活性达到峰值，共检测到6个化学家族的38种化合物，其中包括2,5-二甲基呋喃、乙基丙酸酯、β-蒎烯、α-蒎烯、异石竹烯和7-表-α-塞林烯。这一阶段与最高的植物毒性相吻合，显著抑制了Amaranthus hypochondriacus和Medicago sativa的发芽、根系生长和呼吸作用。在后期阶段（第10-20天，第4组），多样性和丰度均下降。作用机制分析表明，该阶段的VOC混合物通过抑制基础线粒体呼吸并严重破坏膜电位（ΔΨm）来引发早期能量崩溃。这些结果表明，H. anthochroum Smeg4能够动态调节其核心挥发物组，生成具有物种特异性植物毒性的协同混合物，使其成为潜在的针对线粒体的生物除草剂来源。

**1. 引言**
农业目前面临一个严峻挑战，即越来越多的杂草种群对传统合成除草剂产生了抗性。这些产品的过度使用不仅降低了除草效果，还因其长期存在于生态系统中并对人类健康构成潜在风险而引发全球关注（Das等人，2025；Kostina-Bednarz等人，2023；Macías-Rubalcava和Garrido-Santos，2022；Raza等人，2025；Salda?a-Mendoza等人，2025）。在这种背景下，寻找基于天然产物的生物除草剂变得至关重要，这些生物除草剂应具有新的作用机制、更高的生物降解性和较低的生态影响，以促进可持续和有韧性的农业发展。
在开发可持续生物控制方法的新兴策略中，来自真菌的次级代谢产物成为特别有前景的生物活性化合物来源。其中，挥发性有机化合物（VOCs）具有高结构多样性、低分子量（100–500 Da）、亲脂性、低沸点和高蒸气压（20°C时为0.01 kPa）等特性，这些性质有助于其在环境中的扩散（Cerimi等人，2025；Elsherbiny等人，2025；Herrmann，2010；Razo-Belmán等人，2023）。许多单独的VOCs已被证明具有广泛的生物活性，包括杀菌、杀虫、杀线虫作用，以及诱导对生物和非生物胁迫的抵抗力并促进植物生长（Cerimi等人，2025；Elsherbiny等人，2025；Razo-Belmán等人，2023；Wang等人，2023）。同时，它们也被发现具有显著的植物毒性（Hung等人，2014；Kaddes等人，2019；Lee等人，2014）。最近的研究表明，不同形态的Hypoxylon anthochroum内生菌产生的VOCs通过干扰草本植物的关键能量过程表现出显著的除草活性（Roque-Flores等人，2025）。然而，对这些代谢产物的孤立评估限制了对其作为整体系统时产生的协同或拮抗作用的理解，因此需要从整个挥发物组的角度进行研究。
近年来，人们对真菌挥发物组越来越感兴趣，将其视为真菌在特定条件和时间下产生的VOCs的综合动态表达（Elsherbiny等人，2025；Pennerman等人，2022）。尽管如此，其研究仍较为有限，尤其是在应用层面。大多数研究集中在评估其抗真菌活性及其促进植物生长和发育的作用上（Abdel-Motaal等人，2022；Achimón和Pizzolitto，2025；Camarena-Pozos等人，2021；Jiang等人，2021；Moisan等人，2019；Mookherjee等人，2018；Wonglom等人，2020；Yalage Don等人，2020；Zhang等人，2018；Zhang等人，2025）。相比之下，这些挥发性代谢产物的植物毒性潜力却鲜有关注。迄今为止，只有少数研究系统评估了内生真菌挥发物组的生物除草潜力。例如，Xylaria sp. PB3f3产生的VOCs被证明能抑制Amaranthus hypochondriacus和Solanum lycopersicum的根系生长（Sánchez-Ortiz等人，2016）。同样，Hypoxylon anthochroum Blaci菌株的挥发物组也显示出对A. hypochondriacus、Panicum miliaceum、Trifolium pratense和Medicago sativa的种子发芽、根伸长和幼苗呼吸的抑制作用（Ulloa-Benítez等人，2016）。Muscodor yucatanensis的挥发物组也对A. hypochondriacus、Lycopersicon esculentum和Echinochloa crus-galli的根系发育产生了负面影响（Macías-Rubalcava等人，2010）。这些背景证据突显了关于真菌挥发物组作为生物除草剂来源的知识空白。因此，识别具有植物毒性的VOC产生真菌，并详细分析其化学谱型，对于扩展挥发物组作为生物控制工具的应用以及开发新型可持续生物除草剂具有重要意义。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品和试剂
牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、蔗糖、葡萄糖、2-噻诺酰三氟丙酮（TTFA）、3-甲基-1-丁醇、（±）-2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、桉叶醇、α-萜品烯、苯乙基醇、α-菲兰烯、α-萜品醇、β-石竹烯、α-胡木烯、α-蒎烯、β-蒎烯和γ-萜品烯均从Sigma-Aldrich购买，纯度≥90%（美国密苏里州圣路易斯）。四甲基罗丹明甲酯过氯酸盐（TMRM）从Thermo Scientific购买（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。正常烷烃混合物（C8–C20）从Supelco购买（美国宾夕法尼亚州贝尔丰特）。
2.2. 真菌材料
内生菌Hypoxylon anthochrum Smeg4菌株（Nodulisporium sp.的完整形态）是从Sapium macrocarpum Mull. Arg的健康叶片中分离出来的，基于其宏观和微观形态特征以及ITS1–5.8S-ITS2 rDNA区域的系统发育分析进行鉴定。H. anthochrum Smeg4菌株的纯培养物保存在PDA培养基中（200克马铃薯浸液、20克葡萄糖和20克琼脂，溶于1升蒸馏水中），存放于UNAM化学研究所和生物学研究所（C006微生物实验室）。这些培养物存放在墨西哥国家植物标本馆（MEXU）的真菌收藏库中，编号为MEXU 29005（Macías-Rubalcava等人，2018）。
2.3. 内生菌Hypoxylon anthochrum Smeg4菌株挥发物组的鉴定
H. anthochrum Smeg4菌株以2%的浓度在15毫升PDA培养基中培养，置于40毫升装有聚丙烯孔盖和PTFE涂层硅胶隔膜的固相微萃取（SPME）小瓶中。接种物来自8天龄的菌株培养物，直径为5毫米的菌丝块。SPME小瓶在28°C下培养，光照/黑暗周期为12小时，培养时间分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和20天。另外4个未接种的2% PDA小瓶也在相同条件下培养，作为阴性对照。
进行了研究，分析H. anthochrom Smeg4培养物在13个不同生长阶段产生的VOCs以及未接种小瓶中的VOCs。使用SPME纤维（HS-SPME）进行检测，该纤维由二乙烯基苯/羧苯/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）制成，长度2厘米，宽度50/30毫米（Supelco，宾夕法尼亚州贝尔丰特）。在吸附挥发物之前，SPME纤维在250°C下预热30分钟。为确保13天期间的分析一致性，每次实验前都监测SPME纤维的性能，确保硅氧烷信号的稳定性。然后将SPME纤维放入小瓶的顶空部分，暴露于蒸汽相中60分钟。
VOCs的脱附通过将纤维插入Agilent Technologies Model 7890B气相色谱系统（300°C）的分流模式下进行2分钟完成。分离过程使用5%苯基取代甲基聚硅氧烷相（HP-5MS；J&W Scientific，加利福尼亚州福尔索姆）毛细管柱（内径0.25毫米，长度30米，膜厚0.25微米）。载气为氦气，流速为1毫升/分钟。初始 oven 温度设为40°C，持续10分钟，随后以每分钟20°C的速度升高至300°C。GC系统连接至单四极质谱仪（Agilent Technologies 5977 A），电子电离能量为70电子伏特。扫描质量范围为34至600 uMa，扫描速率为每秒20个谱图。进样口和传输线的温度分别为250°C和280°C。
数据后续分析使用Mass Hunter Workstation软件（Agilent Technologies，版本B07.00）进行。VOCs根据其质谱碎片模式和相对保留指数（RI）进行初步鉴定，RI是根据C8–C20正烷烃系列的保留时间计算得出的。通过线性保留指数和直接及反向匹配因子（通常>850）与NIST数据库和Adams（2017）进行谱图去卷积，以确保谱图纯度。当可能时，通过将化合物的MS和Kovats指数与纯度≥90%的 authentic 标准品（3-甲基-1-丁醇、（±）-2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、桉叶醇、α-萜品烯、苯乙基醇、α-菲兰烯、α-萜品醇、β-石竹烯、α-胡木烯、α-蒎烯、β-蒎烯和γ-萜品烯）进行比较来确认化合物的最终鉴定。
由于本研究旨在表征挥发物组的化学谱型和时间动态，而非测定绝对浓度，因此使用的是各组分的相对量。这些VOC的相对量以总峰面积的百分比表示，并基于三次生物学重复实验的平均值计算得出（表1）。四个未接种PDA小瓶中检测到的化合物被排除在数据分析之外（Macías-Rubalcava等人，2018；Sánchez-Fernández等人，2016）。

**表1. Hypoxylon anthochrum Smeg4在PDA培养基中生长13天内产生的VOCs的化学组成和相对丰度**
ID：通过质谱（MS）鉴定，Kovats指数来自文献（KI）和Sigma-Aldrich购买的authentic 标准品（≥90%纯度）。
RIexp：从DB-5MS毛细管柱注入的烷烃系列保留时间数据计算出的Kovats保留指数。
RIlit：来自NIST数据库（Adams，2017，美国国家标准与技术研究院）的Kovats保留指数。
（---）DB-5MS柱上未报告Kovats指数。
（?）在此期间培养物中未检测到或未产生的化合物。
由于相似度低于85%，一些次要峰和突破峰被从总分析中省略。
2.4. Hypoxylon anthochrum Smeg4菌株挥发物组的植物毒性
研究了H. anthochrom Smeg4菌株产生的VOC混合物对植物生长的抑制作用。通过在13个不同生长阶段测试其对三种双子叶植物（Amaranthus hypochondriacus、T. pratense、M. sativa）的种子发芽、根系生长和幼苗呼吸（氧气吸收）的影响来进行评估。此外，还测试了对一种单子叶植物（P. miliaceum）的影响。种子来自墨西哥墨西哥城Central de Abastos的Casa Cobo, S.A. de C.V.
生物测定在无菌的300毫升玻璃烧瓶中进行。每个烧瓶中都包含一个30毫升的玻璃烧瓶，其中含有不同培养天数的H. anthochroum Smeg4菌株的培养物，这些培养物是在PDA培养基中生长的。30毫升的玻璃烧瓶中装有5毫升的PDA培养基和一份5毫米的内生真菌接种物，该接种物来自在28°C下培养8天的PDA培养物。内生真菌在28°C下，12小时光照-12小时黑暗的光周期（T12 30瓦荧光灯；Phillips，墨西哥奇瓦瓦州）下培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20天。在每个特定的时间点，将20颗A. hypochondriacus、T. pratense、M. sativa或P. miliaceum的种子播种在含有1%水琼脂的35毫米培养皿中，然后转移到含有相应年龄真菌培养物的300毫升玻璃烧瓶中。为了使VOC饱和同时防止分生孢子的传播，真菌培养物被Magitel?布覆盖。种子引入后，烧瓶用Parafilm?密封并在28°C下避光培养48小时（Thermo Scientific Precision，型号3759，美国俄亥俄州）。随后，烧瓶再次在黑暗中培养48小时。为了确保观察到的植物毒性确实是由每个生长阶段真菌释放的VOC引起的，每个评估点（从第0天到第20天）都平行培养了未接种的PDA培养基作为阴性对照。这些对照在所有生理参数和时间点上都显示出0%的抑制作用，证实了植物毒性效应严格归因于H. anthochroum Smeg4在其生长周期的每个不同阶段产生的特定挥发性化合物组。使用了一种含有六种VOC混合物的小瓶（桉叶醇、ocimene、terpinolene、phenethyl alcohol、2-methyl-1-butanol和3-methyl-1-butanol，每种浓度为10 μg/mL）作为阳性对照。选择这种特定混合物是因为它在之前的试验中证明了其植物毒性活性，能够达到100%的发芽抑制率和超过70%的幼苗呼吸抑制率（Roque-Flores等人，2025年）。这种对照仅用于验证生物测定的灵敏度和实验设置的效率，而不是作为与真菌释放物的直接定量比较的基准。在施加VOC处理后，测量了种子的发芽率、根的生长和幼苗的氧气吸收量。种子发芽是指种皮破裂，同时幼苗的初生根长出超过1毫米。对于氧气吸收实验，幼苗被转移到含有4毫升空气饱和去离子水的10毫升玻璃室中，温度为28°C。在H. anthochroum Smeg4 VOCs存在的情况下，使用极谱法测量了幼苗在整个发芽过程中的氧气消耗率，持续时间为3分钟。该测量使用连接到YSI?型号5300 A生物氧监测器（YSI Inc.，美国黄斯普林斯）的Clark型O2电极进行。然后将VOCs的植物毒性效应与未接种内生真菌的对照组进行比较。结果以抑制百分比表示，以阴性对照为100%，并通过标准生成曲线的简单线性回归分析确定（Flores-Reséndiz等人，2021年；Mead等人，2002年；Roque-Flores等人，2025年；Ulloa-Benítez等人，2016年）。

2.5. Hypoxylon anthochroum菌株Smeg4的挥发性化合物组对呼吸作用和线粒体膜电位的影响
通过使用暴露于H. anthochroum Smeg4产生的VOC混合物的M. sativa种子和幼苗来分离植物线粒体。这些样本的测试在13个不同的日期进行，时间范围从0天到20天，遵循之前由(Flores-Reséndiz等人，2021年)和(Roque-Flores等人，2025年)概述的标准协议和技术，并进行了相应的修改。这些修改的详细说明可以在后续段落中找到。粗线粒体部分的分离是通过使用植物生长抑制生物测定获得的每个培养皿来进行的。需要注意的是，所有分离步骤都在4°C下进行，所有材料都事先冷却并保持在冰上。总共收集了20颗种子和/或幼苗，并放入研钵中。然后立即加入大约两倍体积的冷提取介质，该介质由5 mM Tris-HCl、50 mM EDTA和300 mM蔗糖组成。调整pH值至8.0，然后用研杵剧烈捣碎材料5分钟。细胞匀浆液通过湿润的细布过滤，滤液在1000 xg下离心15分钟。随后在8000 xg的加速度下离心30分钟。粗线粒体部分然后在由10 mM Tris-HCl、5 mM KH2PO4、250 mM蔗糖、150 mM KCl和1 mM MgCl2组成的呼吸缓冲液中匀浆。调整pH值至7.4，蛋白质浓度最终确定为150 μg/mL。匀浆液随后在冰上保存直至使用。蛋白质含量通过Bradford测定法（Bradford，1976年）测定，使用BSA作为标准品。线粒体氧气消耗量和线粒体膜完整性的损伤或通透性（膜电位的变化；ΔΨm）分别使用极谱法和荧光法测量。线粒体氧气消耗率的测量是在含有150 μg/mL总蛋白质（大约500–800 μL粗线粒体部分）的10毫升玻璃瓶中进行的。体积用测定缓冲液调整至2毫升。使用连接到YSI?型号5300 A氧计（YSI Inc.，美国黄斯普林斯）的Clark型O2电极，在27°C下测量线粒体氧气消耗率。每5秒记录一次，持续5分钟。在所有试验中，使用TTFA（一种特定的复合物II抑制剂）作为阳性对照，浓度范围在50至200 μg/mL之间。基础氧气消耗量按照标准方法测量，使用结果曲线的简单线性回归分析。结果以相对于阴性对照的百分比表示，阴性对照被指定为100%的消耗量。使用在没有VOC混合物的情况下发芽的M. sativa种子获得的粗线粒体作为阴性对照（Flores-Reséndiz等人，2021年；Mead等人，2002年；Roque-Flores等人，2025年）。

2.6. 统计分析
各种生物测定的结果，包括发芽、根的生长、幼苗呼吸、线粒体氧气消耗率和ΔΨm的变化（线粒体膜完整性的损伤或通透性），都进行了两次重复实验，每种处理重复四次，遵循完全随机设计。然后通过方差分析（ANOVA，α = 0.05）来分析这些结果，以确定与阴性对照的显著差异，并通过Tukey HSD对比检验来确定处理之间的显著差异（Flores-Reséndiz等人，2021年；Mead等人，2002年；Roque-Flores等人，2025年；Zar，2010年）。使用GraphPad Prism版本6软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行这项分析。数据以平均值±标准差（SD）表示。P值< 0.05被认为是统计学上的显著差异。

3. 结果
在这项研究中，我们调查了从S. macrocarpum中分离出的内生真菌H. anthochroum菌株Smeg4在其PDA培养基中产生的挥发性化合物组的生物除草潜力。首先，确定了H. anthochrom Smeg4合成的VOC混合物的化学组成。随后，将VOCs按化学家族分组，以将其组成和丰度（VOCs对纤维的亲和力；百分比面积）与其对四种杂草物种（A. hypochondriacus、T. pratense、M. sativa和P. miliaceum）的发芽、根生长和幼苗呼吸的植物毒性效应相关联。此外，还评估了VOC混合物对M. sativa分离出的完整线粒体的基础呼吸作用和线粒体膜完整性或通透性（ΔΨm）的影响。

3.1. 内生真菌Hypoxylon anthochroum菌株Smeg4的挥发性化合物组的鉴定
图1a展示了在PDA培养基上生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20天的内生真菌H. anthochrom Smeg4合成的VOCs的代表性色谱图。VOCs是通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC–MS）获得的。VOCs的代谢多样性和对纤维的亲和力（百分比面积）取决于内生真菌培养的时间。表1展示了H. anthochrom Smeg4在十三个特定生长天数产生的VOC混合物中鉴定出的各个成分的化学组成和相对丰度。每个峰的相对丰度表示为总面积的百分比，并为四次重复实验的平均值。在整个研究期间共鉴定出42种VOC。

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图1. 在28°C下PDA培养基上生长的内生真菌Hypoxylon anthochrom Smeg4产生的挥发性化合物组的时间过程分析，共13天。(a) 代表性的HS-SPME-GC–MS色谱图。(b) 混合物的总VOC峰面积（AUC），根据相对丰度和产生的VOC数量分为四类。条形图上方的数字表示每种混合物中的化合物数量。统计显著性通过ANOVA后跟Tukey的事后检验确定。ap < 0.05表示不同培养时间之间的差异；bp < 0.05表示组之间的差异。垂直条形代表SD（n = 3）。(b) 按化学家族分类的VOCs的化学多样性和百分比组成：烷烃（蓝色）、醇（粉色）、酯（黄色）、呋喃（ turquoise）、单萜（绿色）和倍半萜（紫色）。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网页版本。）
鉴定出的VOCs根据两个标准分为四类：相对丰度和随H. anthochrom Smeg4培养时间产生的挥发性化合物的数量。如图1b所示，在最初的2天生长期间，挥发性化合物组包含11到17种化合物，如表1所详述。VOCs的总和约为1.0 × 10^7平均面积单位，在这些混合物中未观察到VOC数量的显著差异（第1组）。在生长第3天和第4天，内生真菌合成了超过26种化合物（表1），总面积大于1.2 × 10^8面积单位。在第3天和第4天的培养期间，第2组内的VOC总面积没有统计学上的显著差异。相反，在生长第5天到第8天之间，观察到VOC产生的最大多样性和丰度，检测到32到38种化合物（表1），总面积超过2.0 × 10^8面积单位。在第5天到第9天，第3组内的VOC产生量没有显著差异。随后，在第10天、第15天和第20天，产生的挥发性化合物组之间没有统计学上的显著差异。量化VOCs的曲线下面积约为5.4 × 10^7平均面积单位。然而，在第10天产生的化合物数量更多，鉴定出24种VOC。相比之下，在第15天和第20天，鉴定出的化合物数量略超过10种（第4组）（表1）。此外，在13天的培养期间，H. anthochroum Smeg4产生的挥发物根据挥发性有机化合物（VOCs）与纤维的亲和力（%面积）被分为不同的化学家族。如图1c所示，在培养的初始阶段（仅对应于内生菌的接种），VOC混合物主要由醇类、单萜类和倍半萜类组成，其中后两者含量显著更高。在培养的前两天内，化学多样性有所增加，除了第一天检测到的三种化合物家族外，还发现了烷烃类。萜类化合物的比例与第0天的比例相似，单萜类始终是主要家族，在所有三天的培养中占比均超过60%。到第3天，鉴定出的挥发物混合物主要由单萜类和倍半萜类组成。在实验的第4天，除了之前检测到的化学家族外，还发现了酯类。在培养的第5天和第9天，挥发物的代谢多样性相比早期有显著增加。在此期间，共鉴定出六种化学家族：烷烃类、醇类、酯类、呋喃类、单萜类和倍半萜类，但第5天只鉴定出五种家族。总体而言，单萜类仍然是主要家族，占混合物中总VOCs的50%以上。最后，在培养的第10天、第15天和第20天，随着真菌的生长，化学多样性和VOCs的数量有所减少。在第15天和第20天，醇类成为第二大主要家族，占比超过30%，高于之前的天数。相比之下，倍半萜类的数量显著减少，降至6%到11%之间，而烷烃类和呋喃类则完全消失。图2显示了鉴定出的42种VOCs，并按化学家族进行了分类。

图2. 在PDA培养基上生长的13天内，内生真菌Hypoxylon anthochroum Smeg4产生的VOCs按化学家族分类。

图3a展示了基于H. anthochroum Smeg4在不同培养天数内VOC总混合物曲线下面积定义的四个组中每组的典型化学组成。在生长的第一天（第1组），单萜类是主要家族，占总混合物的68.4%。倍半萜类是第二丰富的化合物类别，占总量的16.9%，其中β-elemene占5.3%。醇类占总混合物的13.6%，其中2-phenylethanol的比例最高，为6.8%。最后，n-hexane是该组中唯一鉴定的烷烃类，占总混合物的2.0%。在生长的第4天（第2组）和第5天（第3组），单萜类仍然是VOC混合物中的主要化学家族，占总量的约52%。在这个家族中，最普遍的化合物是桉叶醇，占总丰度的约37%。倍半萜类是第二丰富的家族，占总量的约31%，其中aristolochene是主要化合物，占总量的约7.5%。醇类占总VOC混合物的约14%，其中2-methyl-1-propanol的含量最高，为4%。最后，烷烃类和酯类的比例较低，分别占总量的约1.2%和2.0%。值得注意的是，尽管H. anthochroum Smeg4在生长第4天和第5天的挥发物比例和化学多样性相似，但第5天产生的总挥发物面积是第4天的约1.5倍（图1b）。在实验的第15天（第4组），单萜类仍然是VOC混合物中的主要化学家族，占总量的47%。在这个家族中，桉叶醇是最主要的化合物，占总量的45.4%。与前几组不同，醇类成为第二丰富的类别，占比为32.9%。这一类别中最普遍的化合物是3-methyl-1-butanol和2-methyl-1-butanol，分别占总量的8.4%和8.0%。倍半萜类是第三丰富的家族，占总量的11.3%，其中β-selinene是主要成分，占总量的4.5%。VOC混合物中有8.9%是ethyl ethanoate（5.6%）和ethyl butyrate（3.2%），这是唯一鉴定的酯类。分析显示，在这个组中不存在烷烃类（见图1c）。第15天产生的挥发物混合物面积是第5天（第3组）的四分之一（图1b）。

图3b展示了随时间在VOC混合物中鉴定出的主要化合物。单萜类桉叶醇在所有13天的培养中都是普遍存在的化合物，其含量从第3天开始增加，占总混合物的30%以上，是研究样本中的重要成分。类似地，倍半萜类aristolochene和β-selinene分别在真菌生长的第13天和第11天被鉴定出来。在醇类家族中，3-methyl-1-butanol和2-methyl-1-butanol在真菌生长的第12天被检测到，而2-phenylethanol在9天的培养中被发现。

3.2. H. anthochroum菌株Smeg4合成的VOC混合物的植物毒性
如图4a–d所示，通过四种杂草A. hypochondriacus、P. miliaceum、T. pratense和M. sativa的发芽、根系生长和幼苗呼吸作用，定量评估了内生真菌H. anthochroum Smeg4合成的VOC混合物的植物毒性效应。总体而言，从内生菌生长的第2天到第15天，这三个生理过程都受到了显著抑制（ANOVA，P < 0.05）。此外，根据内生菌培养的年龄，这三个过程的抑制程度有所增加，在生长的第5天和第6天达到最大抑制效果，但从第7天开始急剧下降。在所检查的生理过程中，根系生长对VOC混合物的响应最为显著。如图4a所示，VOC混合物对A. hypochondriacus种子的植物毒性效应很明显。在生长的第5天和第6天，观察到这三个生理过程的植物毒性效应最为显著。研究发现，发芽受到约85%的抑制，根系生长受到约90%的抑制，幼苗呼吸受到约70%的抑制。A. hypochondriacus种子对VOC混合物的敏感性最高。如图4b所示，VOC混合物对P. miliaceum种子也有植物毒性效应。在生长的第7天和第8天，发芽过程受到最显著的抑制。同时，在生长的第4天和第5天，根系生长受到最明显的植物毒性效应，抑制率为约35%。然而，在内生菌生长的任何一天，P. miliaceum幼苗的呼吸作用都没有受到VOC混合物的抑制。相反，从第3天到第15天，基础呼吸作用受到显著刺激，在第4天达到最大刺激效果，增幅为20%。P. miliaceum种子对VOC混合物的敏感性最低。如图4c所示，VOC混合物对T. pratense种子也有植物毒性效应。在生长的第5天，发芽和根系生长受到最显著的植物毒性效应，抑制率分别为23%和43%。在生长的第7天，T. pratense幼苗的呼吸作用受到最显著的抑制，抑制率为35%。如图4d所示，VOC混合物对M. sativa种子也有植物毒性效应。在第5天和第6天产生的VOC混合物表现出最显著的植物毒性效应，发芽抑制率为75%。在第5天，根系生长的植物毒性效应最强，抑制率为90%。此外，在生长的第5天，M. sativa幼苗的呼吸作用受到最大的损害，抑制率为80%。

图4. 在PDA培养基上生长的13天内，内生真菌Hypoxylon anthochroum Smeg4产生的VOC混合物的植物毒性效应。评估了这些混合物对四种杂草种子发芽（绿色）、根系生长（黄色）和幼苗呼吸（粉色）的影响：(a) Amaranthus hypochondriacus，(b) Panicum miliaceum，(c) Trifolium pratense，(d) Medicago sativa。通过测量(e) 线粒体膜完整性和通透性（紫色）以及(f) 基础线粒体氧气消耗率（蓝色）来评估VOC混合物在孤立的M. sativa线粒体中引起的损伤。垂直条表示标准差（4n = 4）。通过与阴性对照的统计差异通过ANOVA确定（P < 0.05）。

3.3. 对Medicago sativa呼吸作用和线粒体膜的植物毒性效应
如图4e和f所示，H. anthochroum Smeg4在不同生长天数产生的挥发物对M. sativa的线粒体膜完整性和通透性以及基础线粒体呼吸作用有植物毒性效应。从生长的第2天到第9天，这两个过程都受到了显著影响（ANOVA，P < 0.05）。与前几个生理过程一样，最显著的植物毒性效应出现在第5天和第6天合成的VOC存在的情况下。VOC混合物对ΔΨm造成了严重损害，损害率分别为40%和35%（图4e），而基础线粒体呼吸作用分别受到57%和52%的抑制（图4f）。

4. 讨论
本研究全面且时间性地描述了内生真菌H. anthochroum Smeg4在PDA培养基上生长过程中产生的挥发物特征，并评估了这些VOC混合物对四种杂草的植物毒性效应及其作用机制。VOCs的代谢多样性、化学组成和相对丰度强烈依赖于内生菌培养的年龄，从而在四个代谢阶段（第1-4组）中建立了明显的动态变化。在生长的最初两天（第1组；图1C），VOCs的合成多样性有限，共鉴定出11-17种化合物。此外，在这两天内，VOCs的含量没有显著变化。在这个早期阶段，单萜类是主要的化学家族，其中两种未鉴定的化合物（RT 6.15和7.59分钟）特别值得注意，它们在第1天合计占总混合物的51.8%。倍半萜类和醇类的含量较低，其中β-elemene和phenylethyl alcohol分别是主要代表。β-elemene的合成已在多种微生物来源中被记录：Diaporthe sp. MFLUCC16–0051（Monggoot等人，2017年）、Penicillium clavigerum（Fischer等人，1999年）、Penicillium roqueforti（Jeleń，2002年）、Beauveria bassiana UniB2439–3（Camele等人，2023年）和Nodulisporium sp. GS4d2II1a（Sánchez-Fernández等人，2016年），以及植物来源（Camele等人，2023年；Park等人，2010年；Sieniawska等人，2018年）。许多研究将β-elemene赋予多种生物活性，包括：(i) 对Mycobacterium tuberculosis菌株H37Ra（Sieniawska等人，2018年）、Propionibacterium acnes和Staphylococcus aureus（Zhu等人，2013年）的抗菌活性；(ii) 对Malassezia furfur的抗真菌活性（Zhu等人，2013年）；以及(iii) 抗肿瘤、抗炎、致敏和抗氧化活性（Chen等人，2023a）。在生物防治的背景下，有一项特别相关的研究使用了Nodulisporium sp. CF016菌株进行菌熏处理，该研究证明了这种真菌能够在采后苹果中抑制Botrytis cinerea和Penicillium expansum的生长，研究还指出β-elemene是这种真菌产生的挥发性有机化合物（VOC）中最丰富的成分（Park等人，2010年）。到目前为止，尚未有研究单独考察β-elemene的植物毒性。在生长早期阶段，单萜和倍半萜的生物合成占主导地位，这表明除了活跃的初级代谢过程外，还存在着化学信号传导机制、防御机制以及拮抗作用（Galindo-Solís和Fernández，2022年；González-Hernández等人，2023年）。例如，Alternaria alternata在生长初期（第3天）就会释放倍半萜，其中β-cedrene和thujopsene是主要成分。作者认为这种早期释放与A. alternata在富含营养的培养基中的快速生长有关（Weikl等人，2016年）。另外，一项研究考察了在不同真菌在二氯甘油琼脂上培养3天、7天、10天和14天期间产生的VOC，发现Aspergillus versicolor在第三天开始释放倍半萜，并且其浓度随时间逐渐增加。同样，P. expansum和Penicillium chrysogenum也从发育的最早阶段开始产生倍半萜，尽管这些释放的增幅没有A. versicolor那么明显（Matysik等人，2008年）。

在第三天（第2组；图1C），挥发性化合物的复杂性发生了突然变化，检测到了超过27种VOC。单萜成为主要的化学类别，其中桉叶醇是主要成分。也检测到了倍半萜aristolochene和2-甲基-1-丙醇，但含量较低。值得注意的是，这一阶段首次检测到了酯类化合物，其中乙基乙酸酯的丰度最高。这一转变标志着代谢谱型的多样化。已有文献记载，乙基乙酸酯是一种具有显著抗菌和生物防治潜力的微生物代谢产物，在采后系统中被广泛应用。例如，在Wickerhamomyces anomalus、Metschnikowia pulcherrima、Aureobasidium pullulans和Saccharomyces cerevisiae等酵母中都发现了它的释放，这些酵母能够抑制采后植物病原菌的生长（Contarino等人，2019年；Saerens等人，2010年）。在体内研究中，由S. cerevisiae产生的乙基乙酸酯表现出明显的抗真菌活性，能够抑制Sclerotinia sclerotiorum的生长（Fialho等人，2011年）。同样，在Bacillus subtilis SV75–1等细菌中，乙基乙酸酯也被发现是抑制Moniliophthora perniciosa DM4B和Fusarium oxysporum f. sp. lactucae MA28生长的关键VOC之一（Chaves-López等人，2015年）。在采后应用中，由W. anomalus产生的乙基乙酸酯能够完全抑制Botrytis cinerea的生长，并抑制草莓的灰霉病（Oro等人，2018年）。此外，乙基乙酸酯还是Hanseniaspora uvarum MP1861产生的主要VOC，该菌株对Phytophthora nicotianae FQ01表现出显著的抗卵菌活性，有效减少了番茄果实的病害发生率（高达95.8%）。在体外试验中，这种酯类化合物对卵菌的生长表现出显著的抑制作用（Liu等人，2022年）。然而，目前尚无证据支持乙基乙酸酯具有内在植物毒性的假设。

VOC的多样性和丰度最高的阶段出现在第5天到第9天之间（第3组；图1C），共检测到了38种化合物。这一时期的化学多样性显著增加，包括六种不同的化学家族：单萜、倍半萜、醇类、酯类、呋喃类和烷烃类。这一生长阶段的特征是生物合成能力的增强，这对于化学防御物质的合成至关重要。真菌调节多种代谢途径，主要是甲瓦龙酸途径、莽草酸途径和埃利希途径。全面理解这些机制可以发现，包括聚酮合酶活性、脂质过氧化和酶促酯化在内的多种途径同时增强，从而产生复杂的挥发性化合物谱型（Elsherbiny等人，2025年；González-Hernández等人，2023年；Korpi等人，2009年；Razo-Belmán等人，2023年）。尽管如此，单萜仍然是主要成分，桉叶醇是最典型的例子。此外，分析还发现了一些VOC，如aristolochene、β-selinene、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇，在这一阶段具有较高的持久性和相对丰度。在代表性较低的家族中，乙基乙酸酯是最主要的酯类化合物，而2,5-二甲基呋喃是呋喃家族的唯一代表。已知有多种微生物能够产生2,5-二甲基呋喃，包括Penicillium commune和Paecilomyces variotii（Sunesson等人，1996年）；引起木材腐烂的棕色腐朽菌Fomitopsis palustris（Konuma等人，2015年）；以及Burkholderia gladioli菌株BBB-01（Lin等人，2021年）。此外，2,5-二甲基呋喃对多种植物和人类病原菌具有杀菌活性（Lin等人，2021年）。然而，目前尚无实验证据支持乙基乙酸酯具有植物毒性的假设。

在培养的后期阶段（第10天、第15天和第20天；第4组；图1C），VOC的丰度和化学多样性显著下降，尤其是在第15天和第20天，仅检测到约17种VOC。这种模式表明次级代谢活动逐渐减少，可能是由整合生长状态、营养可用性和废物积累信号的遗传网络调控的（Bayram和Braus，2012年；Tudzynski，2014年；Walker和White，2017年；Yu和Keller，2005年）。

本研究得出结论，该真菌的核心挥发性化合物谱型主要由醇类、单萜和倍半萜组成。检测到的主要醇类包括2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙基醇。单萜类包括桉叶醇、未知单萜2和α-萜品醇，而检测到的倍半萜包括caryophyllene V1、未知倍半萜、aristolochene和β-selinene。最近的研究表明，由H. anthochroum的内生形态种产生的VOC 2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙基醇和桉叶醇对草本植物A. hypochondriacus、T. pratense、M. sativa和P. miliaceum以及水生植物Lemna gibba具有植物毒性（Roque-Flores等人，2025年）。α-萜品醇具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、镇痛、心脏保护、神经保护、抗腹泻、抗氧化、抗癌、抗惊厥、抗溃疡、降压、镇痛、杀虫和抗真菌作用（Chen等人，2023b；Khaleel等人，2018年；Kong等人，2019年；Wang等人，2023年）。在植物毒性方面，它被确定为具有除草活性的精油成分（Verdeguer等人，2020年），并且已被证明可以抑制Raphanus sativus L.的发芽（De Martino等人，2010年），以及Lactuca sativa的发芽和根系生长（Kennedy等人，2011年）。此外，β-香叶烯是多种微生物产生的常见代谢产物，包括Phialophora fastigiata（Kramer和Abraham，2012年）、Penicillium caseifulvum、Penicillium roqueforti、Muscodor albus、Fusarium oxysporum CanR-46（Kaddes等人，2019年；Larsen，1998年）和Cladosporium sp.（Walther等人，2021年）。它也是已知具有除草活性的植物精油的常见成分（Abd-Elgawad等人，2021年；Araujo等人，2022年；Gurgel等人，2019年）。特别是倍半萜β-香叶烯通过抑制Phytophthora nicotianae FQ01的发芽和根系生长表现出显著的抗卵菌活性，有效减少了番茄果实的病害发生率（高达95.8%）。在体外试验中，这种酯类化合物对卵菌的生长表现出显著的抑制作用（Liu等人，2022年）。然而，目前尚无证据支持乙基乙酸酯具有植物毒性的假设。

VOC的多样性和丰度最高的阶段出现在第5天到第9天之间（第3组；图1C），共检测到了38种化合物。这一时期的化学多样性显著增加，包括六种不同的化学家族：单萜、倍半萜、醇类、酯类、呋喃类和烷烃类。这一生长阶段的特征是生物合成能力的增强，这对化学防御物质的合成至关重要。真菌调节多种代谢途径，主要是甲瓦龙酸途径、莽草酸途径和埃利希途径。深入了解这些机制可以发现，包括聚酮合酶活性、脂质过氧化和酶促酯化在内的多种途径同时增强，从而产生多方面的挥发性化合物谱型（Elsherbiny等人，2025年；González-Hernández等人，2023年；Korpi等人，2009年；Razo-Belmán等人，2023年）。尽管如此，单萜仍然是主要成分，桉叶醇是最典型的例子。此外，分析还发现了一些VOC，如aristolochene、β-selinene、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇，在这一阶段具有较高的持久性和相对丰度。在代表性较低的家族中，乙基乙酸酯是最主要的酯类化合物，而2,5-二甲基呋喃是呋喃家族的唯一代表。已知有多种微生物能够产生2,5-二甲基呋喃，包括Penicillium commune和Paecilomyces variotii（Sunesson等人，1996年）；引起木材腐烂的棕色腐朽菌Fomitopsis palustris（Konuma等人，2015年）；以及细菌Burkholderia gladioli菌株BBB-01（Lin等人，2021年）。此外，2,5-二甲基呋喃对多种植物和人类病原菌具有杀菌活性（Lin等人，2021年）。然而，目前尚无实验证据支持这种VOC具有植物毒性的假设。

在培养的后期阶段（第10天、第15天和第20天；第4组；图1C），VOC的丰度和化学多样性显著下降，尤其是在第15天和第20天，仅检测到约17种VOC。这种模式表明次级代谢活动逐渐减少，可能是由整合生长状态、营养可用性和废物积累信号的遗传网络调控的（Bayram和Braus，2012年；Tudzynski，2014年；Walker和White，2017年；Yu和Keller，2005年）。

本研究得出结论，该真菌的核心挥发性化合物谱型主要由醇类、单萜和倍半萜组成。检测到的主要醇类包括2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙基醇。单萜类包括桉叶醇、未知单萜2和α-萜品醇，而检测到的倍半萜包括caryophyllene V1、未知倍半萜、aristolochene和β-selinene。最近的研究表明，由H. anthochroum的内生形态种产生的VOC 2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙基醇和桉叶醇对草本植物A. hypochondriacus、T. pratense、M. sativa、P. miliaceum以及水生植物Lemna gibba具有植物毒性（Roque-Flores等人，2025年）。α-萜品醇具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、镇痛、心脏保护、神经保护、抗腹泻、抗氧化、抗癌、抗惊厥、抗溃疡、降压、镇痛、杀虫和抗真菌作用（Chen等人，2023b；Khaleel等人，2018年；Kong等人，2019年；Wang等人，2023年）。在植物毒性方面，它被确定为具有除草活性的精油成分（Verdeguer等人，2020年），并且已被证明可以抑制Raphanus sativus L.的发芽（De Martino等人，2010年），以及Lactuca sativa的发芽和根系生长（Kennedy等人，2011年）。此外，β-香叶烯是多种微生物产生的常见代谢产物，包括Phialophora fastigiata（Kramer和Abraham，2012年）、Penicillium caseifulvum、Penicillium roqueforti、Muscodor albus、Fusarium oxysporum CanR-46（Kaddes等人，2019年；Larsen，1998年）和Cladosporium sp.（Walther等人，2021年）。它也是已知具有除草活性的植物精油的常见成分（Abd-Elgawad等人，2021年；Araujo等人，2022年；Gurgel等人，2019年）。特别是倍半萜β-香叶烯通过抑制Echinochloa crusgalli L. Beauv.、Lolium perenne L.、Amaranthus retroflexus L.和Digitaria sanguinalis L. Scop.种子的发芽和根系生长表现出植物毒性（Araniti等人，2017年）。相比之下，Aspergillus terreus、Penicillium roqueforti（Kramer和Abraham，2012年）和Emericellopsis maritima BC17（Virués-Segovia等人，2023）产生的aristolochene仅与抗真菌活性相关，目前尚未发现其植物毒性。最后，在几种微生物的代谢产物中检测到了β-selinene，包括Fusarium sambucinum、Muscodor albus（Kramer和Abraham，2012年）、Alternaria infectoria、Alternaria sp. 1（Walther等人，2021年）和Nodulisporium sp. CF016（Park等人，2010年）。这种倍半萜是Nodulisporium sp. CF016产生的VOC之一，该菌株表现出抗真菌活性（Park等人，2010年）。尽管β-selinene是植物精油中的常见成分，其中一些精油具有细胞毒性、抗炎和除草作用（Garcia等人，2024年；Gurgel等人，2019年；Trang等人，2024年），但其单独的植物毒性潜力仍有待阐明。

生长阶段（第5天到第9天；第3组）在生物测定中表现出最高的植物毒性潜力。这一阶段对应于挥发性化合物谱型最复杂的时期，期间仅检测到了以下VOC：2,5-二甲基呋喃、乙基丙酸酯、β-蒎烯、α-蒎烯、异香叶烯和7-epi-α-selinene。乙基丙酸酯被确定为Pichia anomala、Pichia kluyveri和Hanseniaspora uvarum产生的主要VOC之一。先前的研究已将这种化合物的抗菌活性归因于它（Masoud等人，2005年；Ruiz-Moyano等人，2020年），并且它还被证明对Drosophila suzukii具有有效的驱避作用（Conroy等人，2024年）。此外，α-蒎烯和β-蒎烯被确定为精油的常见成分，其中一些精油具有除草作用（Abd-Elgawad等人，2021年；Rolim De Almeida等人，2010年；Verdeguer等人，2020年）。当单独评估α-蒎烯和β-蒎烯时，它们对Lolium perenne表现出植物毒性（Kennedy等人，2011年）。同样，7-epi-α-selinene也被确定为来自多种植物来源的精油的成分，其中一些精油具有植物毒性（Mu?oz-Acevedo等人，2023年；Rolim De Almeida等人，2010年）。此外，某些精油还表现出细胞毒性、抗炎和抗菌作用（Trang等人，2024年）。这些化合物在这一阶段的唯一检测表明，它们的生物合成可能受到严格调控，并与真菌的生理状态直接或协同作用，从而影响植物毒性效应。因此，H. anthochroum Smeg4在这段时间产生的VOC混合物显著抑制了所评估植物物种的发芽、根系生长和呼吸作用。A. hypochondriacus和M. sativa表现出最大的敏感性，而P. miliaceum则表现出较低的响应，甚至呼吸作用略有增强，这表明不同物种对挥发性化合物混合物的响应存在差异。

综合这些结果，强调了在评估VOC对植物毒性的贡献时，不仅要确定其种类，还要考虑它们的时间动态和在不同植物物种间的差异作用。此外，研究VOC对M. sativa线粒体生理的影响发现，从第2天到第9天，基础呼吸受到显著抑制，膜电位（ΔΨm）严重受损（图4E和F）。这些变化表明挥发性化合物谱型的主要作用机制是通过线粒体功能障碍引起的能量缺陷。ΔΨm的崩溃表明，这些VOC的因此，在M. sativa中观察到的ΔΨm损失代表了挥发性有机化合物（VOCs）作用机制的早期事件，这种能量崩溃解释了生物测定中观察到的植物毒性效应。挥发性成分组的最大代谢丰富度与生理和线粒体测定中观察到的峰值生物效应之间的相关性支持了这样的假设：植物毒性是由多种VOCs的协同或叠加作用引起的，而不是单一成分的作用。在这种情况下，已识别的不同化学类别（例如醇类和单萜类）之间的协同相互作用是非常合理的。先前的研究报道，复杂的VOC混合物由于其互补的作用机制，通常比其单个组分具有更强的生物活性（Medina-Romero等人，2017；Roque-Flores等人，2025；Sánchez-Fernández等人，2016；Strobel等人，2001）。具体来说，含有3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇（我们研究中鉴定出的关键成分）以及单萜类如桉叶醇的混合物，已被证明能够通过同时靶向多种生理和线粒体途径而表现出更强的生物除草活性（Roque-Flores等人，2025）。虽然H. anthochroum Smeg4挥发性成分组中的具体协同或拮抗比例仍有待实验验证，但我们的结果表明了一种强大的多靶点机制，这可能会阻碍杂草种类的抗性发展。

5. 结论

本研究的结果表明，H. anthochroum分离株Smeg4以动态且与培养时间相关的方式产生和调节化学成分多样化的挥发性成分组，其组成和丰度与真菌的生理状态密切相关。研究确定了四个不同的代谢阶段，包括复杂的VOC混合物以及某些VOC在最具植物毒性的组中的唯一存在。这些化合物似乎在挥发性成分组的植物毒性活性中起着关键作用，无论是直接作用还是协同作用。结果表明，挥发性成分组的核心主要由醇类、单萜类和倍半萜类组成，它们具有破坏关键生理过程（如萌发、根系生长和能量代谢）的能力，可能是通过诱导线粒体功能障碍实现的。从生物技术的角度来看，所获得的结果将H. anthochroum Smeg4定位为天然VOC的重要来源，具有开发生物除草剂的潜力。其生物活性的时间依赖性和作用机制表明它比传统除草剂具有优势，包括较低的抗性发展概率。然而，由于缺乏对所鉴定出的几种单个VOC的植物毒性的实验证据，强调了未来需要进行功能表征的研究以及系统评估其协同作用的重要性。这些方法对于全面理解挥发性成分组的作用机制和生物技术至关重要，从而有助于其在可持续杂草管理和创新生物基除草剂开发中的潜在生物技术应用。

**作者贡献声明**

Martha Lydia Macías-Rubalcava：写作 – 审稿与编辑、写作 – 原稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法学研究、资金获取、数据分析、概念化。

Jacqueline Fuentes-Jaime：写作 – 审稿与编辑、写作 – 原稿撰写、可视化、软件使用、方法学研究、数据分析。

Everardo Tapia-Mendoza：写作 – 原稿撰写、软件使用、方法学研究、数据分析。

Patricia Lappe-Oliveras：写作 – 原稿撰写、软件使用、方法学研究、数据分析。

Gonzalo Roque-Flores：方法学研究、数据分析。

**资助**

本研究由墨西哥国立自治大学（UNAM）的PAPIIT技术研究与发展支持计划（PAPIIT-DGAPA，项目编号IN215623和IN213026）资助。Jacqueline Fuentes-Jaime感谢墨西哥科学技术创新部（SECIHTI；项目编号443492）提供的博士后奖学金。Gonzalo Roque-Flores是墨西哥国立自治大学（UNAM）化学科学硕士和博士项目的博士生，并获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT；项目编号629486）的奖学金以继续其研究生学习。