结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，其最显著的驱动因素之一是致癌性Wnt信号通路。本研究证实，FDA批准的抗肥胖药物Orlistat是一种独特的致癌性Wnt信号通路和CRC抑制剂。研究人员证实已知的靶点FASN（脂肪酸合酶）与Orlistat抑制CRC无关，并确定NEDD8结合酶UBC12（UBE2M）为一个候选靶点。等温滴定量热法（ITC）测定证实了Orlistat与UBC12的直接结合，其KD值为678 nM。值得注意的是，Orlistat抑制了UBC12的NEDD8结合活性，阻断了UBC12与DCN1（cullin neddylation 1缺陷蛋白）的相互作用，从而选择性地抑制Cullin 1的neddylation（类泛素化）修饰。此外，在正常细胞中过表达UBC12可正向调节Wnt/β-catenin信号通路，而在CRC细胞中敲低UBC12不仅能抑制致癌性Wnt信号传导，还能消除Orlistat对Wnt信号通路及细胞增殖的抑制作用。综上所述，该研究揭示了UBC12是Orlistat的一个新型靶点，并确立了UBC12作为Wnt依赖性癌症的潜在治疗靶点。

《Pharmacological Research》：Orlistat targets NEDD8 conjugating enzyme UBC12 for cancer therapy

　　

结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，其中最显著的特征性驱动因素之一是致癌性Wnt信号传导。在本研究中，研究人员证明Orlistat（一种FDA批准的抗肥胖药物）是一种独特的致癌性Wnt信号传导和CRC抑制剂。研究人员证实，已知靶点FASN（脂肪酸合酶）与Orlistat抑制CRC无关，并确定NEDD8结合酶UBC12（UBE2M）为一个候选靶点。通过等温滴定量热法（ITC）测定证实了Orlistat与UBC12的直接结合，其KD值为678 nM。值得注意的是，Orlistat抑制了UBC12的NEDD8结合活性，阻断了UBC12与DCN1（cullin neddylation 1缺陷蛋白）的相互作用，从而选择性地抑制Cullin 1的neddylation（类泛素化）。此外，在正常细胞中过表达UBC12可正向调节Wnt/β-catenin信号传导，而在CRC细胞中敲低UBC12不仅能抑制致癌性Wnt信号传导，还能消除Orlistat对Wnt信号传导和细胞增殖的抑制作用。综上所述，这些发现揭示了UBC12是Orlistat的一个新型靶点，并确定了UBC12作为Wnt依赖性癌症的潜在治疗靶点。

论文解读：Orlistat通过靶向NEDD8结合酶UBC12抑制Wnt信号通路治疗结直肠癌

研究背景与立题依据

结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，其中致癌性Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是其主要的驱动因素。超过80%的CRC患者存在APC、AXIN或CTNNB1（编码β-catenin）基因的突变，导致β-catenin异常积累并激活致癌性Wnt信号。尽管过去几十年间已发现多种Wnt抑制剂，但尚未有药物进入临床应用。Orlistat（奥利司他）作为一种FDA批准的减肥药，通过不可逆抑制脂肪酸合酶（FASN）发挥作用，且在多种癌症中显示出抗肿瘤活性。然而，高选择性FASN抑制剂在临床试验中未能显示出显著疗效，提示Orlistat可能通过FASN非依赖途径发挥抗癌作用。因此，解析Orlistat除FASN之外的分子靶点对药物重定位治疗CRC具有重要意义。本研究由Mengzhen Shen、Huihui Li等学者完成，发表于《Pharmacological Research》。

关键技术方法

本研究综合运用了多种分子生物学、生物化学及体内外模型技术。主要包括：利用荧光素酶报告基因（TOPFlash）和斑马鱼胚胎眼发育模型评估Wnt信号通路活性；采用药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）联合质谱（MS）筛选Orlistat的结合蛋白；利用等温滴定量热法（ITC）和细胞热转移分析（CETSA）验证蛋白与小分子的直接结合；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建FASN敲除细胞系；利用表面等离子共振（SPR）检测蛋白互作；通过邻近连接试验（PLA）和免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白质相互作用；并在HCT116细胞异种移植瘤模型中评估药物的体内抗肿瘤效果。

研究结果

3.1 Orlistat抑制Wnt/β-catenin信号通路和CRC

研究人员利用含有TGC报告基因的EPT1细胞和斑马鱼模型筛选FDA批准药物，发现Orlistat能显著抑制6BIO诱导的Wnt信号激活。在HEK293T、HCT116等多种携带APC或CTNNB1突变的结直肠癌细胞系及HepG2肝癌细胞中，Orlistat均能有效抑制TOPFlash活性和Wnt靶基因（如AXIN2、BMP4）的表达。体内实验表明，腹腔注射Orlistat（100和200 mg/kg/天）能显著抑制HCT116细胞的异种移植瘤生长。这些结果表明Orlistat具有抑制致癌性Wnt信号和CRC的潜力。

3.2 Orlistat直接结合NEDD8 E2结合酶UBC12

为了寻找Orlistat的非FASN靶点，研究人员利用CRISPR/Cas9构建了FASN敲除细胞系，发现FASN缺失并不影响Orlistat对Wnt信号的抑制作用，排除了FASN的主导作用。随后通过DARTS-MS技术筛选到UBC12（UBE2M）等多个候选蛋白。Western blot验证显示只有UBC12在Orlistat处理后表现出明显的蛋白酶抗性。进一步的ITC实验测得Orlistat与重组UBC12蛋白结合的KD值为678 nM，CETSA实验证实了两者在活细胞内的结合，分子对接模拟揭示了Orlistat在UBC12活性口袋中的结合模式。

3.3 Orlistat抑制UBC12的neddylation活性并阻断Cullin 1的neddylation

机制研究表明，Orlistat处理导致UBC12上的NEDD8修饰水平下降，且抑制了UBC12与NEDD8的相互作用。在Cullin家族成员中，Orlistat选择性地抑制了Cullin 1的neddylation，而对Cullin 2、3、4A、4B及5无显著影响。深入的机制探索发现，Orlistat并不干扰UBC12与E1酶UBA3或E3连接酶RBX1的相互作用，而是特异性地阻断了UBC12与DCN1的结合，进而破坏了DCN1与Cullin 1的相互作用，最终选择性抑制Cullin 1的neddylation。

3.4 UBC12是Wnt/β-catenin信号通路和CRC的正向调节因子

研究人员发现UBC12与β-catenin可直接结合（KD=26.4 nM）。在Wnt信号低活性的HEK293T细胞中过表达UBC12，能够上调β-catenin蛋白水平并增强Wnt报告基因活性。相反，在HCT116细胞中敲低UBE2M则导致总β-catenin和活性β-catenin水平下降，抑制Wnt信号通路活性，并显著减弱细胞克隆形成能力。这确立了UBC12作为Wnt信号通路和肿瘤生长的正向调控因子地位。

3.5 UBC12是Orlistat抑制Wnt信号通路和CRC所必需的

功能挽救实验显示，在UBE2M敲低的HCT116细胞中，Orlistat对Wnt信号的抑制作用和抗克隆形成能力均被显著削弱，而对ICG001（另一种Wnt抑制剂）则不敏感。蛋白互作分析进一步揭示，Orlistat处理减少了UBC12与β-catenin的结合，同时增加了UBC12与转录因子TCF4的相互作用，并降低了β-catenin的NEDD8修饰水平。这表明UBC12是Orlistat发挥药效的关键介质。

讨论与结论

本研究首次阐明Orlistat除抑制FASN外的全新分子机制：即直接靶向NEDD8结合酶UBC12。研究人员证实了Orlistat与UBC12的直接结合，并揭示了其通过阻断UBC12-DCN1相互作用，选择性抑制Cullin 1 neddylation，进而干扰Wnt/β-catenin信号通路的级联反应。重要的是，研究证明了UBC12是Orlistat发挥抗肿瘤活性的必要靶点。鉴于UBC12在癌症组织中高表达且缺乏合适的药物结合口袋，本研究发现的Orlistat作为一种选择性UBC12抑制剂，为CRC的药物重定位治疗提供了重要的理论依据和实验基础。尽管研究仍存在局限性，如对UBC12-TCF4-β-catenin复合物的结构生物学研究不足，且缺乏PDX模型验证，但这项工作无疑为开发针对Wnt依赖性癌症的新型疗法开辟了新路径。