Tagetes erecta提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用

《Phytomedicine Plus》：Neuroprotective effects of Tagetes erecta extract on H2O2-induced damage in SH-SY5Y cells

　　苏拉德瓦迪·通蒙米（Suradwadee Thungmungmee）、蒙西查·库阿内卡潘（Monsicha Khuanekkaphan）和纳昆特瓦莱·威西德里（Nakuntwalai Wisidsri）
泰国帕图姆塔尼府塔尼亚布里（Thanyaburi）拉贾曼加拉技术大学（Rajamangala University of Technology）综合医学学院
地址：Phaholyothin 87 Road, Prachathipat, Thanyaburi, Pathum Thani, Thailand 12130

**摘要**
氧化应激是导致神经元功能障碍和神经退行性疾病的关键因素。Tagetes erecta（万寿菊）是一种富含抗氧化生物活性化合物的药用植物，其中包含叶黄素。本研究探讨了万寿菊提取物（TE）对过氧化氢（H2O2）诱导的人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用。H2O2暴露显著增加了细胞内活性氧（ROS）水平、氧化DNA损伤以及与衰老和炎症相关的生物标志物的表达。预先用12.5-50 μg/ml浓度的TE处理可有效减轻H2O2引起的细胞损伤。TE显著降低了细胞内ROS的积累，并抑制了氧化DNA损伤，这通过8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）水平的降低得到证实。此外，TE处理还减轻了与衰老和炎症相关的生物标志物，表现为p21表达的降低以及促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）水平的下降。这些保护作用与细胞抗氧化防御机制的增强有关，这通过超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）水平的升高得到证实。这些发现表明，TE能够保护神经元细胞并具有潜在的神经保护作用。

**1. 引言**
神经退行性疾病是一组以大脑和脊髓中神经元逐渐功能障碍、损伤和丧失为特征的疾病，导致运动、认知、行为和其他重要神经功能受损。在细胞和分子水平上，神经退行性疾病的特点是由过度氧化应激、慢性神经炎症和过早细胞衰老等相互关联的病理机制驱动的神经元丢失（Tesco和Lomoio，2022；Zhang等人，2023）。过氧化氢（H2O2）是神经元细胞中氧化应激的主要诱导因素。虽然在生理条件下它作为信号分子发挥作用，但H2O2的过度积累会导致蛋白质、脂质和核酸等细胞大分子的氧化损伤（Hong等人，2024；Olufunmilayo等人，2023）。H2O2既可以通过线粒体呼吸和酶活性（如单胺氧化酶、NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶）内源性产生，也可以通过接触外源性物质、辐射、污染物以及不良饮食或吸烟等生活方式因素外源性产生（Olufunmilayo等人，2023）。在神经元细胞中，H2O2容易穿透细胞膜并参与芬顿反应，产生羟基自由基，从而加剧脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤（Huang等人，2024；Su等人，2019）。尽管细胞具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等内在抗氧化防御系统，但在氧化应激下这些系统常常不堪重负，导致氧化还原失衡和细胞损伤（Jomova等人，2024）。作为对氧化应激的反应，细胞会激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）信号通路。在氧化刺激下，Nrf2与其胞质抑制剂Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）分离，转移到细胞核，并诱导抗氧化和解毒基因（包括SOD和CAT）的转录（Ngo和Duennwald，2022）。这种适应性反应在维持氧化还原平衡和保护神经元免受氧化损伤方面起着关键作用（Jin等人，2021）。然而，慢性氧化应激会损害这一保护机制，从而促进细胞衰老的发生（Martínez-Cué和Rueda，2020）。

除了氧化应激外，H2O2暴露还会通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路引发神经炎症反应。NF-κB激活后转移到细胞核，上调促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的转录（Shih等人，2015）。这些细胞因子的增加 production 放大了炎症信号，从而促进神经元损伤和退化的自我循环。NF-κB的持续激活与慢性神经炎症和神经退行性疾病的进展密切相关（Adamu等人，2024）。氧化应激和炎症是高度相互关联的病理过程，共同导致H2O2引起的神经元损伤（Dash等人，2025）。因此，人们越来越关注具有抗氧化和抗炎特性的天然化合物。

Tagetes erecta L. 是菊科（Asteraceae）的一年生草本植物，俗称万寿菊。它富含生物活性化合物，包括黄酮类和类胡萝卜素（如叶黄素和玉米黄质）（Sultana等人，2025）。这些化合物以其强大的自由基清除能力和调节氧化应激和炎症相关信号通路的能力而闻名。先前的研究表明，万寿菊提取物（TE）可以增强抗氧化防御并减少溃疡性结肠炎（Meurer等人，2019）以及活化中性粒细胞和巨噬细胞（Vaz等人，2024）中的炎症细胞因子产生。由于其有利的类胡萝卜素组成，这些提取物被广泛用作膳食叶黄素补充剂，以增强内源性抗氧化防御（Meurer等人，2019）。本研究旨在探讨TE对H2O2诱导的SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞氧化应激的神经保护效果，包括其对氧化损伤的影响、抗氧化防御系统的调节以及与细胞衰老相关的生物标志物（包括促炎细胞因子和p21表达）的调控。

**2. 材料与方法**
2.1 **化学试剂**
2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）、过氧化氢（H2O2）、二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）、雷沙津（resazurin）、蛋白酶抑制剂、Folin-Ciocalteu酚试剂和没食子酸均购自美国Sigma-Aldrich公司。乙醇、过氧化氢和甲醇的分析级试剂购自泰国RCI Labscan公司。二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养级试剂购自泰国RCI Labscan公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（FBS）、0.4%台盼蓝、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。RIPA缓冲液、一抗GAPDH和辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Abcam公司。NucleoSpin组织试剂盒购自德国Macherey-Nagel公司。SOD、CAT和Nrf2的一抗购自美国Affinity Biosciences公司，GAPDH由Abcam公司提供，PCNA购自美国Cell Signaling Technology公司。OxiSelect?氧化DNA损伤定量试剂盒由美国Cell Biolabs公司提供。酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（人TNF-α、IL-1β、IL-6）购自德国Immuno Tools公司。

2.2 **TE提取物的制备**
万寿菊的花朵来自泰国萨拉布里省（Saraburi Province）的Sanantraipop草药园。花朵彻底清洗后，在45°C的热风烤箱中干燥24小时。干燥后，将花朵研磨成细粉。提取时，将2克粉末与80克蒸馏水混合，在45°C下进行20分钟的超声辅助提取。所得提取物过滤后，用冷冻干燥机干燥得到粉末形式的粗提取物。粗提取物的产率百分比按以下公式计算：
\[Yield(\%) = (\text{粗提取物重量} / \text{所用植物材料重量}) \times 100\]

2.3 **总酚含量（TPC）的测定**
TE的TPC采用Folin-Ciocalteu法测定（Thungmungmee和Wisidsri，2025）。具体操作为：将20 μl提取物与100 μl 10% Folin–Ciocalteu溶液在室温下孵育7分钟，然后加入100 μl 7.5%碳酸钠溶液，继续在避光条件下孵育45分钟。使用SUNRISE Microplate reader（TECAN Austria GmbH，奥地利）在765 nm处测量吸光度。TPC根据没食子酸标准曲线（y = 3.6154x + 0.0661，R2 = 0.9996）计算，并以每克干提取物中的毫克没食子酸当量（mg GAE/g）表示。

2.4 **高效液相色谱（HPLC）分析测定叶黄素含量**
叶黄素的定性和定量分析采用Wang等人的方法（Wang等人，2019）进行。HPLC分析使用Shimadzu Nexera LC-40 HPLC系统。叶黄素在反相Luna C18柱（250 mm x 4.6 mm，5 μm粒径）上分离，流动相为乙腈和二氯甲烷（95:5 v/v），在等度系统中进行。流速为0.5 ml/min，进样量为50 μl，温度保持在25°C。检测波长为450 nm。使用浓度为0.3125、0.625、1.25和5 μg/ml的叶黄素标准溶液建立标准曲线进行评估。

2.5 **2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）抗氧化能力测定**
采用DPPH自由基清除试验评估TE的抗氧化能力。将不同浓度的提取物约20 μl与180 μl 0.20 mM DPPH甲醇溶液混合。反应混合物在室温下避光孵育30分钟，然后使用微孔板读取器在520 nm处测量吸光度。维生素C（Vit C）作为阳性对照，0.2% DMSO作为阴性（溶剂）对照。自由基清除活性以DPPH抑制百分比表示，并计算半最大抑制浓度（IC50）。

2.6 **过氧化氢（H2O2）清除能力测定**
过氧化氢（H2O2）是一种相对稳定的活性氧，可通过芬顿反应生成羟基自由基（•OH），从而造成显著的细胞损伤。为了评估TE的H2O2清除潜力，使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制40 mM H2O2溶液。将TE在不同浓度（12.5至200 μg/ml）下取80 μl与720 μl H2O2溶液混合。混合物在室温下孵育10分钟，使用分光光度计在230 nm处测量吸光度。维生素C作为阳性对照，磷酸盐缓冲液作为阴性对照。提取物的H2O2清除能力以抑制百分比表示，并计算IC50值。

2.7 **细胞培养**
人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在含有5% CO2的湿润培养箱中维持在37°C。每周使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行两次常规传代培养。实验中使用存活率超过80%的细胞，细胞密度为2 × 10^5个细胞/ml。

2.8 **雷沙津还原试验**
使用雷沙津还原试验评估TE对SH-SY5Y细胞活力的影响。SH-SY5Y细胞用不同浓度的TE（6.25-200 μg/ml）或不含FBS的DMEM（溶剂对照）处理24小时。处理后，细胞在含有50 μg/ml雷沙津的溶液中孵育4小时，温度为37°C。使用微孔板读取器在560和600 nm处测量吸光度。细胞活力以相对于溶剂对照的百分比表示，并按以下公式计算：
\[%Cellviability = \((OD_{570} - OD_{600}\text{样品}) / (OD_{570} - OD_{600}\text{对照}) \times 100\]

2.9 **细胞处理的H2O2浓度测定**
将SH-SY5Y细胞以2 × 10^5个细胞/ml的密度接种在培养基中培养24小时，然后用不同浓度的H2O2（50-800 μM）处理24小时。通过雷沙津还原试验测定H2O2处理后的细胞活力。选择最大非细胞毒性浓度的H2O2用于后续实验。

2.10 **2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）试验**
通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）试验测定细胞内ROS水平。SH-SY5Y细胞用6.25-200 μg/ml的TE或5 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）（阳性对照）处理24小时，然后在含有400 μM H2O2的培养基中孵育24小时。处理后的细胞在37°C下用50 μM DCFDA处理30分钟并避光。去除上清液，细胞用PBS洗涤两次。使用荧光微孔板读取器在485 nm激发波长和535 nm发射波长下测定荧光强度。

2.11 **酶联免疫吸附测定（ELISA）**
SH-SY5Y细胞先用TE预处理24小时，然后暴露于400 μM H2O2中24小时。处理后，收集培养上清液，按照制造商说明书使用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。简要来说，ELISA板在4°C下过夜涂覆了针对每种细胞因子的捕获抗体。然后去除涂层溶液，并在室温下用封闭缓冲液封闭孔洞1小时。封闭后，加入收集的上清液或标准溶液，在室温下孵育2小时。随后清洗板子，并用生物素化的检测抗体孵育2小时。再次清洗后，加入poly-HRP-链霉亲和素，孵育30分钟，接着用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物孵育10分钟。使用停止溶液终止反应，并使用微孔板读取器在450 nm处测量吸光度。根据为每种细胞因子生成的标准曲线计算细胞因子浓度。

2.12. 8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）定量
在H2O2处理后24小时，按照制造商的说明评估处理过的SH-SY5Y细胞中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）水平。首先，使用NucleoSpin Tissue试剂盒提取DNA，并在95°C下加热10分钟使其变性为单链DNA，然后在冰上快速冷却10分钟。取50 μl浓度为4 mg/ml的DNA，按照制造协议使用OxiSelect?氧化DNA损伤ELISA试剂盒（8-OHdG定量）测量8-OHdG水平。简要来说，将DNA样品与DNA结合溶液在轨道摇床上混合10分钟。随后加入50 μl抗8-OHdG抗体，在室温下持续摇动孵育1小时。然后用洗涤缓冲液清洗三次，并用100 μl HRP结合的二次抗体孵育1小时。再次清洗后，加入100 μl底物溶液并孵育10分钟。使用提供的停止溶液终止反应，并使用微孔板读取器在450 nm处测量吸光度。

2.13. 西部印迹分析
通过西部印迹分析确定感兴趣的蛋白质水平。SH-SY5Y细胞先用TE（12.5、25和50 μg/ml）处理24小时，然后用H2O2（400 μM）处理6小时，之后测定核内和细胞质中的Nrf2水平，再处理24小时后测定抗氧化酶（SOD和CAT）和细胞衰老生物标志物p21的水平。使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒提取核内和细胞质蛋白质。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液分离总蛋白质，并使用NanoDrop微量分光光度计测定蛋白质含量。每个样品取20 μg蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。用含有0.1% Tween-20的Tris-HCL缓冲液中的5%脱脂干牛奶（TBST封闭溶液）封闭膜1小时，用TBST清洗三次，每次间隔5分钟，然后在4°C下用针对每种感兴趣蛋白质的特异性一级抗体封闭过夜。之后用TBST清洗三次，每次间隔5分钟，再用封闭溶液中的HRP结合的二次抗体孵育1小时。通过CheBI化学发光生物成像仪器通过化学发光方法确定免疫反应条带。图像由NEOimage程序获取。

2.14. 统计分析
数据以三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA） followed by Tukey的事后检验分析组间统计差异。所有统计分析均使用SPSS软件（版本23.0）进行。p值< 0.05和p < 0.01被认为是统计学上显著的。

3. 结果
3.1. 提取率和TPCT
Erecta粉末提取物呈黄色。提取物的产率为6.30%，TPC值为88.42 ± 3.66 mg GAE/g。提取物储存在-20°C直到用于实验。

3.2. 叶黄素含量的HPLC分析
通过HPLC测定TE中的叶黄素的定性和定量分析。结果显示标准叶黄素的HPLC色谱图在保留时间16.015分钟（图1A）。正如预期的那样，TE在保留时间15.958分钟处显示叶黄素峰（图1B）。这一结果表明TE中含有叶黄素。从校准曲线可知，提取物中的叶黄素量为59.77 μg/g干提取物。

3.3. TE在体外表现出抗氧化活性
TE对稳定和活性氧化剂都表现出抗氧化活性。该提取物在DPPH测定和H2O2清除试验中显示出自由基清除能力（表1）。

表1. TE的DPPH和H2O2清除活性
化合物 IC50 (μg/ml) DPPH H2O2
TE提取物 42.62 ± 2.42 360.23 ± 10.61
维生素C 16.42 ± 1.21 149.57 ± 2.43

3.4. TE和H2O2对SH-SY5Y细胞活力的影响
图2A和B显示了用TE和H2O2处理的SH-SY5Y细胞的活力。TE浓度在6.25-200 μg/ml范围内对细胞活力没有影响（图2A）。另一方面，H2O2浓度在50-400 μM范围内对细胞无毒，而在800 μM时细胞活力下降到65.96±2.61%，与未处理细胞相比（图2B）。

3.5. TE降低了H2O2诱导的细胞内ROS
H2O2处理显著增加了SH-SY5Y细胞内的ROS水平。具体来说，ROS水平增加到160.24±5.81%，与未处理对照组相比。预先用TE处理有效减弱了这种效应，使ROS水平降低到与未处理细胞相当的水平。阳性对照NAC也显著降低了细胞内ROS水平（图3）。

3.6. TE降低了H2O2诱导的促炎细胞因子
H2O2处理显著增加了促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。用TE（12.5、25和50 μg/ml）预处理显著降低了H2O2诱导的所有这些细胞因子的升高。细胞因子水平的降低与浓度相关，TE浓度越高，TNF-α、IL-1β和IL-6的表达抑制越明显，如图4所示。

3.7. TE降低了H2O2诱导的DNA损伤
正常细胞表现出与细胞内ROS相关的基线DNA损伤，然而，H2O2处理显著增加了氧化DNA损伤，表现为8-OHdG水平升高（946.69±35.27 ng/ml），与未处理细胞相比。用TE（25和50 μg/ml）预处理显著降低了H2O2诱导的DNA损伤，8-OHdG水平分别降至669.46±6.15和542.93 ng/ml（图5A）。

3.8. TE降低了H2O2诱导的DNA损伤
TE处理显著降低了H2O2诱导的DNA损伤。正常细胞表现出与细胞内ROS相关的基线DNA损伤，然而，H2O2处理显著增加了氧化DNA损伤，表现为8-OHdG水平升高（946.69±35.27 ng/ml），与未处理细胞相比。用TE（25和50 μg/ml）预处理显著降低了H2O2诱导的DNA损伤，8-OHdG水平分别降至669.46±6.15和542.93 ng/ml（图5A）。

3.9. TE降低了p21水平
H2O2处理24小时显著增加了p21蛋白表达，约为未处理对照细胞的1.67 ± 1.11倍。相比之下，用TE（25和50 μg/ml）预处理显著减弱了H2O2诱导的p21上调，使得p21水平明显低于单独暴露于H2O2的细胞（图5B）。

3.10. TE对抗氧化酶和Nrf2转录因子的影响
H2O2处理降低了抗氧化酶SOD和CAT的蛋白表达。用TE预处理可以通过恢复SOD和CAT蛋白水平来抵消这种效应。值得注意的是，TE（50 μg/ml）使这两种抗氧化酶的水平升高到高于未处理细胞的水平（图6A-B）。相反，虽然H2O2处理的细胞中Nrf2转录因子向核内的转位显著增加，但用TE（25和50 μg/ml）处理降低了Nrf2的转位（图6C-D）。

4. 讨论
每年都有越来越多的关于神经元退化的报道，这是许多神经系统疾病的主要病理特征（Cannon和Greenamyre，2011）。越来越多的证据表明，多种因素通过直接和间接损害神经元导致神经元退化，包括氧化应激、炎症过程、线粒体功能障碍和细胞稳态失调（Guo等人，2013）。这些病理因素共同损害了神经元的结构和功能，最终导致神经元逐渐丧失（Cannon和Greenamyre，2011；Singh等人，2019）。近年来，氧化应激已被证明是改善神经元细胞的目标（Liu等人，2025）。几种植物提取物已被证明具有保护神经元细胞免受ROS诱导的损伤的生物活性，从而提高神经元细胞的活力和功能。这些神经保护作用主要归因于它们的抗氧化和细胞保护特性，这些特性可以减轻氧化应激并保持细胞完整性（Cui等人，2020；Junsathian等人，2018）。H2O2广泛用于体外模型中诱导氧化应激，因为它容易穿透细胞膜，破坏细胞内的氧化还原平衡，并激活凋亡信号通路（Ransy等人，2020）。SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系具有儿茶酚胺能特性和对氧化损伤的高度敏感性，因此常被用作神经元模型。因此，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞被广泛用于研究氧化损伤和评估潜在的神经保护剂（Zhang等人，2025）。在本研究中，暴露于无毒剂量的H2O2诱导了氧化损伤的特征性变化，随后利用这些变化建立了氧化应激的细胞模型。T. erecta已被广泛记录为富含生物活性化合物的来源，其中叶黄素被认为是主要成分之一（Siddiqa等人，2025）。超声波辅助提取技术已被广泛用于高效提取水溶性和脂溶性抗氧化化合物，包括酚类、黄酮类、类胡萝卜素和萜类化合物（Khursheed等人，2024年；Kumar Kashyap等人，2022年；Pereira等人，2025年；Suwanklang等人，2023年；Trevisiol等人，2026年）。该技术具有多种优势，如高提取效率、缩短处理时间以及最小化热不稳定或易降解的生物活性成分的破坏。其背后的机制主要归因于超声波引起的强烈空化作用，这种作用增强了溶剂的渗透性，改善了物质传递，并促进了细胞内化合物的释放。我们的研究表明，TE表现出TPC（抗氧化能力参数），该参数反映了其捐赠电子以中和自由基的能力（Thungmungmee等人，2025年）。TE的TPC值为88.42 ± 3.66 mg GAE/g，与先前研究中的结果相似（Rivas-García等人，2023年）。我们的方法得到的TPC值高于70%乙醇提取物的结果（Gong等人，2012年）。有趣的是，通过超声波辅助提取得到的水提取物可以不使用乙醇等有机溶剂就获得次级代谢产物。叶黄素就是可以通过非极性溶剂单独或结合辅助提取技术提取的有益化合物之一（Kumar Kashyap等人，2022年；Suwanklang等人，2023年）。值得注意的是，水溶性提取物可以进一步开发用于各种健康相关产品和膳食补充剂。我们的结果发现，使用水结合超声波辅助提取T. erecta不仅可以获得酚类化合物，还可以获得油溶性生物活性成分，如叶黄素。这些特性凸显了所得提取物进一步开发和商业化的潜力。

为了评估TE的神经保护作用，首先通过检测其在体外清除DPPH和H2O2的能力以及抑制SH-SY5Y细胞中H2O2诱导的细胞内ROS生成的能力来评估其抗氧化潜力。尽管TE的清除效果低于参考抗氧化剂维生素C，但该提取物仍显示出显著的抗氧化潜力，支持其作为天然抗氧化源的功能相关性。此外，TE的抗氧化活性与其高TPC值相关，这为其在后续实验中观察到的对抗氧化应激介导的细胞损伤的保护作用提供了基础。我们进一步证明，TE在神经元模型中对H2O2诱导的损伤具有显著的保护作用。在生理条件下，ROS水平的升高会激活转录因子Nrf2，Nrf2从其细胞质抑制因子Keap1中释放并转移到细胞核中与抗氧化反应元件（AREs）结合。这种激活会诱导抗氧化和细胞保护基因的转录，从而增加解毒酶的产生，维持氧化还原平衡（Navarro和Esteras，2024年）。在这些酶中，SOD和CAT构成了第一道细胞抗氧化防线，通过将ROS转化为危害较小的物质来保护细胞免受氧化应激的损害。具体来说，SOD催化超氧阴离子转化为分子氧和H2O2，后者随后被CAT或谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）解毒为水（H2O），从而限制氧化损伤（Chidambaram等人，2024年；Zhang等人，2021年）。我们的研究发现，H2O2暴露显著增加了细胞内ROS水平，导致第一道抗氧化防线酶SOD和CAT的表达下降。值得注意的是，预先用TE处理显著减轻了这些不良影响。浓度在12.5至50 μg/ml范围内的TE有效减少了ROS的积累。此外，25和50 μg/ml浓度的TE能够将SOD和CAT的表达水平恢复到基础条件下的水平。50 μg/ml浓度的TE处理进一步增加了SOD和CAT的表达，超过了未处理细胞的基础水平，表明细胞内抗氧化防御机制得到了显著增强。Western blot分析显示，H2O2处理后的细胞中Nrf2的激活增强，表现为核内转位增加，而25和50 μg/ml浓度的TE预处理则减少了Nrf2的转位。可能是因为TE减少了氧化应激，从而降低了Nrf2激活的需求。尽管TE含有叶黄素，据报道叶黄素可以调节Nrf2信号通路（Ahn和Kim，2021年；Frede等人，2017年），但我们的结果并未显示TE直接激活了Nrf2通路。这可能是由于TE中的叶黄素浓度不足以触发Nrf2激活，因为先前的研究表明，需要更高浓度的叶黄素（例如HT22细胞中的10 μM（Li等人，2024年）和BV2小胶质细胞中的50 μM（Wu等人，2015年）才能诱导Nrf2激活）。相反，TE处理增加了抗氧化酶（包括SOD和CAT）的表达，表明该提取物具有抗氧化作用，并有助于维持细胞氧化还原平衡。

未能有效中和过量的ROS会导致氧化还原失衡。这种失衡会导致关键细胞大分子的氧化损伤，包括DNA（Liu等人，2025年）。暴露于氧化应激的细胞会出现DNA损伤，8-OHdG的形成是主要的氧化DNA修饰之一（Uddin，2025年）。在生理条件下，ROS诱导的8-OHdG损伤可以通过细胞DNA修复机制有效修复，主要是通过碱基切除修复（BER）途径。这一过程涉及关键酶，包括8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）、DNA聚合酶及相关修复因子，共同维持基因组完整性（Behrouzi等人，2022年）。然而，过量的ROS产生会降低BER的效率，导致氧化DNA损伤的积累、线粒体功能障碍以及随后的细胞死亡途径激活（Behrouzi等人，2022年）。在本研究中，H2O2暴露导致SH-SY5Y细胞中的DNA损伤显著增加，表现为处理后24小时8-OHdG水平升高。值得注意的是，预先用TE处理显著减轻了H2O2诱导的DNA损伤，表现为8-OHdG的形成显著减少。这种保护作用至少部分归因于抑制了细胞内ROS的积累，从而限制了对DNA的氧化损伤，并促进了通过BER相关机制的更有效DNA修复。持续的DNA损伤会损害基因组稳定性，并在神经元细胞中引发类似衰老的状态（Delint-Ramirez和Madabhushi，2025年）。衰老的神经元细胞的特点是细胞周期相关抑制因子（如p16和p21）的表达增加，以及形态和溶酶体改变，包括细胞肥大和β-半乳糖苷酶活性的升高。重要的是，这些细胞获得了与衰老相关的分泌表型（SASPs），表现为促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的持续释放，这解释了慢性炎症、破坏神经元稳态并导致与年龄相关的神经元功能障碍和神经退行性变（Melo dos Santos等人，2024年）。我们观察到H2O2暴露显著增加了8-OHdG的形成，这与衰老生物标志物p21的表达增加和促炎细胞因子的产生增强有关。持续的DNA损伤可能会维持DNA损伤反应（DDR）信号通路，从而促进p21介导的细胞周期停滞和SASPs的建立，表现为促炎细胞因子的释放增加。然而，TE处理似乎减轻了这些与衰老相关的生物标志物，表现为p21表达的降低以及促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-6.5）水平的下降。

结论：本研究通过超声波辅助提取制备了TE，获得了具有高TPC的生物活性成分。通过HPLC分析确认了活性成分叶黄素的存在。TE在体外对DPPH和H2O2氧化剂表现出显著的抗氧化活性，并在SH-SY5Y细胞中提供了对H2O2诱导的氧化损伤的显著保护。TE还减轻了细胞内氧化应激，减少了氧化DNA损伤，并降低了与细胞衰老相关的生物标志物。此外，抑制衰老相关生物标志物的同时，内源性抗氧化酶（包括SOD和CAT）的水平也升高，从而增强了细胞对氧化损伤的保护。总体而言，这些发现表明TE在氧化应激的体外条件下具有潜在的神经保护作用。然而，要确认这些效应并探索其他保护机制，需要使用更具生理相关性的模型进行进一步研究。

作者贡献：
Suradwadee Thungmungmee：撰写 - 原始草稿、审稿与编辑、方法学、研究、正式分析、概念化。
Monsicha Khuanekkaphan：方法学。
Nakuntwalai Wisidsri：撰写 - 原始草稿、审稿与编辑、方法学、研究、正式分析、数据管理、资金获取、概念化。

资助：本研究得到了泰国科学研究与创新基金（TSRI）的支持，通过Rajamangala理工大学Thanyaburi分校（FRB68E1205）（项目编号：FRB680045/0168）的资助。

数据可用性：用于支持本研究结果的数据可向相应作者请求获取。

声明：作者声明没有利益冲突。

作者贡献声明：
Suradwadee Thungmungmee：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。
Monsicha Khuanekkaphan：撰写 – 原始草稿、方法学。
Nakuntwalai Wisidsri：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。