Rhodiosin promotes cerebral angiogenesis in mice with ischemic stroke via PI3K/Akt pathway activation

《Phytomedicine》：Rhodiosin promotes cerebral angiogenesis in mice with ischemic stroke via PI3K/Akt pathway activation

　　

背景 缺血性卒中仍然是一种具有高发病率和致残率的致死性疾病，然而针对慢性恢复期的有效治疗选择仍然有限。血管新生通过重建血管网络促进卒中后血液供应的恢复，有助于挽救半暗带并恢复神经功能。红景天素（Rhodiosin）是一种源自大花红景天（Rhodiola crenulata）的生物活性化合物，表现出多种药理活性。然而，红景天素是否通过促进卒中后的血管新生发挥保护作用及其潜在机制尚不清楚。 目的 本研究旨在探讨红景天素是否促进卒中后脑血管新生及神经功能恢复，并探索其潜在机制。 研究设计与方法 通过远端大脑中动脉阻塞（distal middle cerebral artery occlusion, dMCAO）诱导小鼠卒中模型。术后每日腹腔注射给予红景天素。基于神经功能缺损和梗死体积评估治疗效果。使用免疫荧光染色评估微血管密度和周细胞/星形胶质细胞覆盖率。通过激光散斑成像监测脑血流（cerebral blood flow, CBF）。采用双光子显微镜测量脑血管直径和密度的动态变化。进行RNA测序以鉴定红景天素相关通路。通过蛋白质印迹法（Western blot）和实时定量PCR（qRT-PCR）检测PI3K/Akt通路因子。利用人脑微血管内皮细胞（human cerebral microvascular endothelial cells, hCMEC/D3）在体外探索潜在机制。 结果 红景天素增强了卒中后的神经功能恢复并减少了梗死体积。它改善了CBF，增加了半暗带的血管直径和密度。它还通过增加BrdU?/CD31?细胞和增强微血管周围的周细胞/星形胶质细胞覆盖来促进血管新生。此外，在氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）条件下，红景天素促进了内皮细胞的迁移和成管能力。红景天素上调了PI3K/Akt的磷酸化及其下游靶标（HIF-1α, Ang1, VEGF）的表达。这些效应被PI3K/Akt抑制剂（体内LY294002/MK-2206，体外shRNA转染）部分或完全逆转。结合RNA测序和实验验证，研究人员证实PI3K/Akt的激活介导了红景天素的促血管新生作用。 结论 红景天素通过激活PI3K/Akt通路促进脑血管新生，从而促进卒中后的神经功能恢复，突显了其作为亚急性期/慢性恢复期缺血性卒中治疗候选药物的潜力。

论文解读：红景天素通过激活PI3K/Akt通路促进缺血性卒中后脑血管新生

研究背景与意义

卒中是全球主要的健康威胁，具有高死亡率和长期致残率，其中缺血性卒中约占所有卒中事件的85%。尽管现有疗法如重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）和血管内血栓切除术能够实现血管再通，但受限于狭窄的治疗时间窗和出血并发症风险。抗血小板和抗凝药物主要预防血栓形成，缺乏神经保护作用。因此，开发能够靶向内源性修复通路以促进缺血性损伤恢复的新型治疗药物至关重要。血管新生作为卒中后的一种自然防御机制，通过形成新的微血管恢复缺血半暗带的血液循环、氧气和营养供应，为神经元存活和神经发生创造有利微环境，已成为卒中恢复期治疗的核心目标。红景天（Rhodiola crenulata）作为一种传统中药，其活性成分红景天苷（Salidroside）已被证实具有促血管新生作用，但红景天素（Rhodiosin）在此方面的作用尚不明确。本研究由河北医科大学第二医院神经内科团队完成，发表于《Phytomedicine》，首次揭示了红景天素通过PI3K/Akt信号通路促进缺血性卒中后脑血管新生的机制，为其临床转化提供了理论依据。

关键技术方法

本研究采用了体内外相结合的策略。体内实验使用成年雄性C57BL/6小鼠建立永久性dMCAO卒中模型，术后每日腹腔注射不同剂量红景天素。通过Rotarod测试、改良神经功能缺损评分（mNSS）和抓力测试评估神经功能；采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色测定梗死体积；利用激光散斑对比成像（LSCI）和双光子显微镜（TPMI）分别监测脑血流动力学和微血管直径及密度的动态变化；通过免疫荧光染色观察CD31、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共定位以评估血管成熟度及周细胞/星形胶质细胞覆盖情况。分子层面采用RNA测序（RNA-seq）、Western blot和qRT-PCR分析通路变化。体外实验使用人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）建立氧糖剥夺（OGD）模型，结合PI3K基因沉默（shRNA）技术，通过伤口愈合实验和成管实验验证细胞迁移和成管能力。

研究结果

1. 红景天素改善卒中后神经功能并减少梗死体积

研究人员通过对小鼠进行旋转棒测试、mNSS评分和握力测试发现，中等剂量（20 mg/kg/d）的红景天素从术后第7天开始显著改善神经功能恢复，效果与阳性对照药红景天苷相当。TTC染色结果显示，红景天素治疗组在术后第7天的脑梗死体积显著小于模型对照组，从而确定了后续实验的最佳给药剂量。

2. 红景天素促进缺血区血液供应恢复

激光散斑成像显示，红景天素治疗组在术后第7、14、21和28天的脑血流（CBF）显著高于模型组。双光子显微镜进一步揭示，与模型组血管直径的波动变化不同，红景天素组表现出持续稳定的血管直径增大，且血管密度从术后第7天至28天均显著高于模型组，表明其促进了持久有效的血管网络重建。

3. 红景天素促进血管新生并增强微血管的周细胞/星形胶质细胞覆盖

免疫荧光结果显示，红景天素显著增加了术后第14和28天半暗带区域的微血管密度，并提高了BrdU?/CD31?双阳性细胞数量，证实了其对内皮细胞增殖的促进作用。更重要的是，红景天素显著提升了CD31?微血管被α-SMA?周细胞和GFAP?星形胶质细胞包裹的比例，这表明新生成的血管具有更好的结构成熟度和稳定性，有助于维持血脑屏障（BBB）完整性。

4. 红景天素与PI3K家族具有高结合亲和力

分子对接和分子动力学模拟结果表明，红景天素能与PI3K家族成员（特别是PIK3CG）形成多个氢键和疏水相互作用，结合自由能低至-28.35 kcal·mol?1，显示出高度的结合稳定性和特异性，提示其可能直接作用于PI3K蛋白发挥调节作用。

5. 红景天素通过激活PI3K/Akt信号通路上调Ang1和VEGF

RNA测序分析显示，红景天素治疗组的基因表达谱发生改变，GSEA分析提示PI3K/Akt信号通路显著激活。蛋白和mRNA水平验证表明，红景天素上调了p-PI3K、p-Akt及其下游效应分子HIF-1α、Ang1和VEGF的表达。当使用PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK-2206处理后，这些上调效应被显著阻断，证实了该通路的介导作用。

6. 红景天素在OGD条件下增强内皮细胞活性

体外实验显示，6小时OGD处理导致hCMEC/D3细胞活力下降至约55%，而5μM红景天素处理可将其恢复至70%-80%。此外，红景天素还能逆转OGD诱导的p-PI3K、p-Akt、HIF-1α、Ang1和VEGF表达的下降，但在PI3K基因敲低的细胞中，这一保护效应消失。

7. 红景天素通过激活PI3K/Akt通路增强内皮细胞迁移和成管能力

伤口愈合实验和Matrigel成管实验表明，红景天素显著促进了OGD后内皮细胞的迁移能力和成管数量。然而，在转染了PI3K-shRNA的内皮细胞中，红景天素无法发挥上述促血管生成作用，这进一步从细胞层面证实了PI3K/Akt通路是其发挥作用的关键介质。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次证实了红景天素能够促进缺血性卒中后的脑血管新生和结构重塑。与红景天苷主要通过Shh通路在早期诱导血管萌芽不同，红景天素特异性地靶向亚急性期（约14天）的PI3K/Akt通路，侧重于促进周细胞募集和内皮-周细胞串扰，从而实现新生血管的稳定化。这种差异使得两者有望形成序贯联合治疗方案：红景天苷在恢复早期启动血管新生，而红景天素在后期促进血管成熟，从而最大化治疗效果。尽管本研究存在仅使用雄性动物及体外模型难以完全模拟体内长期动态环境等局限性，但其结果为红景天素作为错过急性溶栓时间窗患者的潜在治疗药物提供了坚实的临床前证据。

结论

综上所述，本研究首次提供证据表明红景天素通过激活PI3K/Akt信号通路促进缺血性卒中后的脑血管新生，进而促进神经功能恢复。这些发现共同表明，红景天素作为一种在亚急性期/慢性恢复期促进血管新生的治疗候选药物，具有广阔的应用前景。