对极端微生物 Eutrema salsugineum 中褪黑素生物合成基因的全基因组研究，以及这些基因在盐胁迫下的转录响应

《Plant Gene》：Genome-wide investigation of melatonin biosynthesis genes in an extremophyte Eutrema salsugineum, and their transcriptional responses to salt stress

　　塞赫尔·约尔库（Seher Yolcu）| 阿明·米尔沙姆西·卡赫基（Amin Mirshamsi Kakhki）| 艾哈迈德·贾利利安（Ahmad Jalilian）| 伊斯梅尔·图尔坎（Ismail Turkan）
土耳其伊兹密尔博尔诺瓦（Bornova）亚萨尔大学（Yasar University）农业科学与技术学院（Faculty of Agricultural Sciences and Technologies）土壤科学与植物营养系（Department of Soil Science and Plant Nutrition）

**摘要**
已有研究表明，外源性褪黑素对盐胁迫下的甘氨酸植物具有缓解作用。然而，其在盐生植物适应盐分环境中的作用仍不明确。褪黑素生物合成过程中涉及四种关键酶：色氨酸脱羧酶（TDC）、色胺5-羟化酶（T5H）、N-乙酰血清素O-甲基转移酶（ASMT）和血清素N-乙酰转移酶（SNAT）。本研究旨在利用生物信息学和转录组数据，鉴定盐芥（Eutrema salsugineum）中的褪黑素生物合成基因。共鉴定出18个相关基因：2个TDC基因、10个T5H基因、4个SNAT基因和2个ASMT基因。系统发育分析显示，EsTDC1和EsTDC2与OsTDC2及AtTDC具有密切关系；T5H1、T5H2和T5H8与M. notabilis、G. soja、G. arboreum和C. cajan的T5H蛋白存在关联；SNAT基因分为两个簇。这些基因的顺式元件被分为5类，其中与应激反应相关的顺式元件数量最多，表明这些基因可能在应激响应中发挥作用。RNA-seq数据显示，TDC、T5H、ASMT和SNAT基因在叶片和根部分均表达，其中T5H6和T5H9基因仅在叶片中显著增加。本研究为揭示盐芥中褪黑素生物合成的潜在作用提供了新见解。

**引言**
褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一种低分子量抗氧化剂，存在于细菌、原生动物、植物、真菌和哺乳动物等多种生物体内（Tilden等，1997；Hardeland等，2008；Hardeland等，2012；Rodriguez-Naranjo等，2012；Altaf等，2023）。由于其水溶性和脂溶性，褪黑素可在细胞间自由移动（Arnao和Hernandez-Ruiz，2015）。1995年，研究人员在高等植物中首次发现褪黑素（Dubbels等，1995）。研究表明，褪黑素在油性种子中含量较高，可能有助于保护生殖组织或种子免受紫外线、干旱和高温等引起的氧化损伤（Manchester等，2000）。在植物中，褪黑素参与生长、发育、开花过程、生物和非生物胁迫响应、氮代谢维持以及抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环（Zhang等，2015；Hardeland，2016；Zhang等，2024）。作为活性氧（ROS）和活性氮物种（RNS）的清除剂，褪黑素能提高植物对寒冷、干旱、盐胁迫和重金属等非生物胁迫的耐受性（Back等，2016）。研究表明，褪黑素在分子和代谢水平上调控生物过程以对抗非生物胁迫（Sharma等，2020）。

**先前研究**
多项研究表明，外源性褪黑素可减轻盐胁迫、干旱、极端温度和重金属等非生物胁迫的负面影响（Zhang等，2021；He等，2022；Liu等，2022；Khan等，2023；Sharma等，2020）。例如，在一项研究中，外源性褪黑素处理提高了甜菜幼苗在干旱胁迫下的生长表现，降低了膜脂质过氧化程度，增强了抗氧化酶活性和叶相对含水量，并促进了叶绿素合成（He等，2022）；在盐胁迫下，可溶性糖和甜菜碱浓度显著增加（Liu等，2022）。外源性褪黑素还降低了番茄幼苗中的ROS和MDA水平，增加了脯氨酸含量及耐盐相关基因的表达（Hu等，2021）。另有研究显示，经褪黑素处理的干旱胁迫番茄植株中H2S含量增加，线粒体酶（如丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶）活性增强，热休克蛋白HSP17.6和HSP70的转录水平上升（Khan等，2024）。此外，褪黑素促进了番茄成熟，并通过积累镉（Cd）减轻了镉的毒性，同时提高了H+-ATP酶活性和谷胱甘肽及植物螯合素的含量（Hasan等，2015；Sun等，2015；Li等，2016b）。褪黑素还作为信号分子，通过增强抗氧化酶活性和应激响应基因的转录来维持氧化还原平衡。尽管对植物中褪黑素生物合成的认识不断深入，但其内在作用仍不甚清楚（Zhang等，2024）。

**褪黑素生物合成途径**
L-色氨酸脱羧酶（TDC）是褪黑素生物合成中的第一个酶，属于芳香族L-氨基酸脱羧酶家族，催化色氨酸向色胺的转化（Kang等，2007a）。该反应需要辅因子吡哆醛磷酸（PLP）。研究表明，草本牡丹（Paeonia lactiflora Pall.）在干旱胁迫下TDC基因上调，褪黑素积累增加；烟草植物中过表达P. lactiflora的TDC基因可降低自由基水平，提高褪黑素含量，从而增强耐盐性和耐旱性（Zhao等，2019）。Zhang等（2024）从黄瓜基因组中鉴定出CsTDC1和CsTDC2基因，并探讨了它们在黄瓜生长、发育和胁迫响应中的潜在作用。色胺5-羟化酶（T5H）属于细胞色素P450超家族，是色胺向血清素转化的第二个关键酶（Lewis等，1998；Kang等，2007b）。T5H酶活性与根部分中血清素含量升高相关（Kang等，2007b）。血清素N-乙酰转移酶（SNAT）是褪黑素生物合成中的最后一个酶，将血清素转化为N-乙酰血清素（Byeon等，2013）。葡萄属植物（Vitis vinifera）的SNAT1基因在叶片中高表达，与盐胁迫相关；转基因拟南芥表达VvSNAT1后，生长增强，发芽率、鲜重和根长增加，氧化损伤减轻（Wu等，2021）。相比之下，大豆中的SNAT基因对生物和非生物胁迫无反应，但在胚胎发育阶段表达显著增强（Kumar等，2022）。ASMT是褪黑素生物合成中的最终酶，将N-乙酰血清素转化为褪黑素（Park等，2013；Zuo等，2014）。苹果叶片在干旱胁迫下MzASMT1基因上调，与褪黑素积累正相关；拟南芥中过表达MzASMT1后，褪黑素水平显著升高，ROS水平降低（Zuo等，2014）。

**盐胁迫与植物适应性**
土壤盐分是严重的环境问题，会导致耕地丧失、沙漠化及作物产量下降。盐胁迫引发渗透压胁迫、离子胁迫和氧化胁迫，降低光合作用、养分吸收和酶活性（Guo等，2018）。尽管已开发出多种耐盐植物品系，但多数在盐胁迫下仍表现减产（Rahman等，2021）。盐生植物具有较高的盐适应潜力，能在高达200 mM的NaCl浓度下存活（Flowers和Colmer，2008）。它们具有不同于甘氨酸植物的适应机制，包括抗氧化酶活性、离子稳态及盐胁迫相关基因的激活（Seckin等，2010；Véry等，2014；Tran等，2023）。关于盐生植物的研究较少。例如，经盐胁迫（300 mM）和褪黑素（5 μM）处理的Limonium bicolor植物叶片面积和鲜重增加，光合速率和水分利用效率提高（Li等，2022）；抗氧化酶（如SOD、CAT、POD和APX）活性增强，而H2O2、O2•?和MDA浓度降低（Li等，2022）。小麦（Triticum aestivum L.）具有中等耐盐性，不同品种对褪黑素的响应取决于其耐非生物胁迫能力。耐盐品种（SM15和ZM18）经褪黑素处理后，发芽率、侧根生长、脯氨酸含量和SOD酶活性提高（Zhang等，2022）。新证据表明，褪黑素生物合成途径可能协调或调节盐生植物的多种胁迫适应过程。调节褪黑素生物合成有助于通过清除ROS、维持光合作用和调控离子转运及应激相关途径来保持细胞稳态。十字花科植物中有18种盐生植物，具有多种盐胁迫适应机制（Santos等，2016）。其中，盐芥（Eutrema salsugineum）能在盐碱土中生长，分布于北美、中亚和中国（Koch和German，2013）。作为非生物胁迫研究模型，盐芥基因组小、生命周期短（Bressan等，2001）。基于盐生植物的研究可为培育耐盐作物品种提供重要信息（Moinoddini等，2023）。

**本研究**
本研究首次鉴定了盐芥中的褪黑素生物合成相关基因（TDC、T5H、SNAT和ASMT），并利用生物信息学方法分析了它们的物理化学性质、系统发育关系、亚细胞定位、保守基序及启动子区域顺式元件。同时，研究了盐胁迫下叶片和根部的基因转录水平。研究结果有助于理解这些基因在盐芥中的作用。

**作者贡献**
SY设计了研究方案，进行生物信息学分析，撰写并编辑了手稿；AMK和AJ分析了RNA-seq数据并构建了基因表达热图；IT对手稿进行了最终修订。所有作者均阅读并批准了最终版本。

**致谢**
Seher Yolcu：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学、调查、数据分析、概念化；
Amin Mirshamsi Kakhki：方法学、调查；
Ahmad Jalilian：方法学、调查、撰写、审稿与编辑。

**资金声明**
作者声明在撰写本手稿过程中未获得任何资助或支持。

**未引用参考文献**
Yeong Byeon等，2015