《Nature Microbiology》：Bridging continuous and discrete evolution through a controllable, hypermutagenic phage-bacteria system
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定向进化方法面临离散方法的控制性与现代连续系统的通量之间的权衡。在此，研究人员设计了一种名为裂解选择与进化（Lytic Selection and Evolution, LySE）的方法，用于在保持离散检查点的同时对细菌基因簇进行近连续进化。研究人员开发了一种
定向进化方法面临离散方法的控制性与现代连续系统的通量之间的权衡。在此，研究人员设计了一种名为裂解选择与进化（Lytic Selection and Evolution, LySE）的方法，用于在保持离散检查点的同时对细菌基因簇进行近连续进化。研究人员开发了一种超突变T7 DNA聚合酶（T7 DNAP）变体，其融合了双腺嘌呤-胞嘧啶脱氨酶，能够以相似频率引入所有可能的转换突变。通过解除维持基因组保真度的压力，研究人员获得了每碱基3.82?×?10?5的突变率。出于生物封闭（Biocontainment）考虑，T7 DNA聚合酶编码于附属质粒（Accessory Plasmid, AP）上，而目标基因簇则编码于缺乏T7 DNA聚合酶的T7噬菌粒（T7 Phagemid）上。裂解与转导的交替循环使得目标基因的选择性复制和诱变成为可能，同时非靶向基因组突变被丢弃。LySE在5个循环中将tetA编码的替加环素（Tigecycline）耐药性提高了25倍，并将利用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）单体乙二醇（Ethylene Glycol, EG）作为唯一碳源的细菌菌株的终点生物量提高了50.9%。该方法平衡了细菌定向进化的速度与控制。
本研究聚焦于合成生物学与蛋白质工程领域的核心挑战，即如何平衡定向进化过程中“速度与控制”的矛盾。传统的离散进化方法虽具可控性但耗时费力，而新兴的连续进化系统虽速度快却牺牲了对进化轨迹的控制并易产生非靶向突变。为此，来自丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的研究团队在《Nature Microbiology》发表研究，开发了名为裂解选择与进化（Lytic Selection and Evolution, LySE）的新型平台，成功桥接了连续与离散进化范式，实现了对大型细菌基因簇的高效、可控进化。
为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，构建了缺失T7 DNA聚合酶（T7 DNAP）基因的T7噬菌体（T7?DNAP）及相应的T7噬菌粒（Phagemid）系统，实现生物封闭；其次，通过同源重组与细胞自由转录翻译系统（TXTL）重启噬菌体基因组；第三，利用波动分析（Fluctuation Assay）和Illumina二代测序（NGS）对突变率和突变谱进行定量表征；最后，结合噬菌体感染动力学测定与适应性实验室进化（ALE）作为对照，验证了LySE在单基因和大基因簇进化上的性能。
研究结果
通过裂解周期进行进化
研究人员利用T7噬菌体裂解周期短（约17分钟）和爆发尺寸大（约180个子代）的特性，设计了LySE的工作流程。该系统利用携带超突变T7 DNAP的附属质粒（AP）和携带目标基因簇（GCOI）的T7噬菌粒。在高感染复数（MOI）下，系统进入裂解期，噬菌粒发生易错复制并被包装；在低MOI下进行转导，将突变后的噬菌粒导入新鲜宿主进行基于生长的筛选。这一过程创建了介于离散与连续进化之间的混合系统，通过宿主刷新有效防止了“作弊突变”（Cheater mutations）的积累。
工程化超突变T7 DNA聚合酶
为了驱动靶向诱变，研究人员对T7 DNAP进行了理性设计与改造。通过结合拇指结构域（Thumb domain）、手指结构域（Fingers domain）的修饰（如T523R）、外切酶结构域（Exonuclease domain）的失活（D5A, E7A）以及与TadA-8e或TadDE脱氨酶的融合，构建了多种变体。其中，变体v8（T7 DNAP v4融合TadA-8e）达到了3.82?×?10?5替换/碱基/代（s.p.b.）的超高突变率，约为大肠杆菌基因组突变率的160,000倍。测序分析表明，v8能均衡地引入所有类型的转换（Transition）突变。
通过 multiplicity 调控实现可控裂解
研究发现，随着T7 DNAP突变率的增加，噬菌体的裂解能力变得高度依赖于MOI。野生型T7 DNAP能在低MOI下高效裂解细胞，而携带超突变酶的变体（如v9）则需要高MOI才能引发有效裂解。这种特性使得研究人员可以通过调节MOI来精确控制LySE循环的裂解阶段与转导阶段，确保了即使在极高的突变负荷下，噬菌粒仍能被有效包装和转导。
基因与基因簇的加速进化
在功能验证方面，研究人员首先对四环素抗性基因tetA进行了进化。经过5轮LySE循环，获得的菌株对替加环素的耐受性提高了25倍（达到2.5?μg?ml?1），且抗性表型可稳定遗传至新鲜宿主。相比之下，传统ALE进化产生的抗性主要源于基因组突变而非tetA本身，在转导后抗性几乎完全丢失。随后，研究人员对长达9.7 kb的乙二醇（EG）同化代谢通路（包含5个基因）进行了进化。在仅5个循环后，LySE进化株的最终生物量比野生型提高了50.9%，且测序证实突变均发生在噬菌粒的基因簇内，证明了LySE在复杂代谢通路优化中的强大能力。
讨论
本研究提出的LySE系统通过利用T7噬菌体作为基因穿梭载体，解决了现有连续进化工具在基因簇容量上的限制（理论上可达40 kb），远超PACE等系统约8 kb的上限。与正交复制系统相比，LySE的裂解周期彻底消除了宿主细胞，从而在每一轮循环中清除宿主基因组的非靶向突变，解决了“搭便车突变”带来的表型归因难题。此外，LySE不依赖病毒适应性耦合，而是直接将目标基因簇的功能与细胞适应性挂钩，这使得其能够应用于生长偶联的代谢工程，并能通过流式细胞术等手段进行物理筛选。该研究提供了一种通用性强、操作相对简便且可自动化的加速进化方法，为工程化大型代谢通路和蛋白质复合物提供了强有力的新工具。
