《Plant Science》：The Cysteine Protease Gene MdCP37 Negatively Regulates Drought Tolerance in Apple
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赵文哲|龚星尧|文彬彬|徐素瑞|陈秀德|肖伟|李玲山东农业大学园艺科学与工程学院，泰安，271018，中国摘要干旱威胁着苹果（Malus domestica）的生长和产量，常常导致不可逆的经济损失。C1-木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶是植物应对非生物胁迫的关键酶，但它们在干旱条件
赵文哲|龚星尧|文彬彬|徐素瑞|陈秀德|肖伟|李玲
山东农业大学园艺科学与工程学院，泰安，271018，中国
摘要
干旱威胁着苹果（Malus domestica）的生长和产量，常常导致不可逆的经济损失。C1-木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶是植物应对非生物胁迫的关键酶，但它们在干旱条件下的具体作用在苹果中仍很大程度上尚未被研究清楚。序列分析确定MdCP37属于C1-木瓜蛋白酶家族。在本研究中，我们发现过表达MdCP37（OE）会提高苹果的干旱敏感性，而通过RNAi沉默MdCP37则能增强其耐旱性。在干旱胁迫下，MdCP37-OE品系的抗氧化酶活性降低，干旱响应基因的表达受到抑制，而RNAi处理后的品系则表现出相反的趋势。此外，在干旱条件下，MdCP37加速了叶绿素和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的降解，并促进了叶片衰老。总体而言，我们的研究结果表明MdCP37是苹果耐旱性的负调控因子，为提高苹果育种过程中的耐旱性提供了理论支持，特别是在干旱地区。
引言
苹果（Malus × domestica）属于蔷薇科，在中国广泛种植，是中国最大的苹果生产区。然而，中国大多数苹果园位于水资源有限的丘陵或山区，这使得干旱成为可持续产业发展的关键障碍（Liu等人，2025年）。干旱会损害光合作用和呼吸作用，扰乱生理和代谢过程，最终导致生长受阻、产量下降或植物死亡（Gupta等人，2020年）。为了在干旱中生存，植物会启动涉及众多基因和生化途径的复杂响应。蛋白质周转是这些适应响应的重要组成部分，部分由蛋白酶调节（Zhang等人，2008年）。其中，半胱氨酸蛋白酶（CPs）起着核心作用（Grudkowska和Zagdańska，2004年）。
半胱氨酸蛋白酶（CPs）是一类存在于植物、动物和微生物中的蛋白质水解酶。它们利用活性位点的半胱氨酸残基水解肽键，通常由相邻的组氨酸激活（Rawlings等人，2010年）。在植物中，CPs被分为几个家族：C1（类似木瓜蛋白酶）、C2（类似钙依赖性钙蛋白酶）、C12（类似泛素C末端水解酶）、C13（类似豆蔻蛋白酶）和C14（类似天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）（Rawlings和Barrett，1994年）。CPs通常在应对干旱等非生物胁迫时积累（Zhang等人，2008年）。它们的作用已在多种植物物种中得到研究。例如，在拟南芥中，RD21A参与脱落酸（ABA）介导的气孔关闭，并正向调节干旱诱导的免疫响应（Liu等人，2020年）。在辣椒中，CaCP在盐胁迫和渗透胁迫下负调控叶片衰老（Xiao等人，2014年）。在Salal中过表达SMCP可以提高耐盐性（Zheng等人，2018年），而在拟南芥中表达甜薯SPCP3则会增加干旱敏感性（Chen等人，2013年）。
除了应对胁迫外，CPs还参与程序性细胞死亡（PCD）、发育和衰老（Beers等人，2000年）。在拟南芥中，CEP1通过降解细胞内物质参与PCD，并在木质部发育过程中参与次生壁增厚（Han等人，2019年）。在玉米中，花粉外层的半胱氨酸蛋白酶ZmPCP介导绒毛尿囊细胞的降解（Li等人，2012年）。另一种拟南芥 CP SAG12参与种子充填相关叶片衰老过程中的Rubisco降解，并对根部氮的再利用至关重要（James等人，2018a）。Medicago truncatula的CP77调节根茎的衰老和活性氧（ROS）积累（Deng等人，2019年），而Lilium longiflorum的CP LlCYP通过翻译后修饰过程参与花瓣衰老（Battelli等人，2014年）。尽管在其他物种中已证明其重要性，但CP基因在苹果非生物胁迫下的功能仍不清楚。先前的研究人员从苹果基因组中鉴定出51个MdCP基因，并将其命名为MdCP1–MdCP51。其中，26个MdCP基因（50.98%）含有干旱响应元件。对14个同时含有干旱和ABA顺式作用元件的MdCP基因进行了模拟干旱处理，结果显示MdCP37的表达显著增加（Gong等人，2022年）。因此，我们选择MdCP37作为耐旱性研究的候选基因并进行了进一步研究。
在本研究中，我们生成了过表达MdCP37和通过RNAi沉默MdCP37的转基因苹果品系，以研究该基因在干旱胁迫响应中的作用。结果表明MdCP37是耐旱性的负调控因子。过表达会提高干旱敏感性，而沉默则增强耐旱性。我们还发现MdCP37通过加速叶绿素和Rubisco的降解促进干旱诱导的叶片衰老。这些发现扩展了我们对苹果中CP功能的理解，并为提高苹果育种过程中的耐旱性提供了分子基础。
章节片段
植物材料和处理
为了进行表达分析，我们从10年生的‘GL3’（Malus domestica Borkh. cv. Gala 3）苹果树上采集了多种组织，包括根、茎、幼叶、成熟叶、衰老叶、花和果实。首先将组织培养的‘GL3’和转基因MdCP37苹果品系转移到添加了0.2 mg·L?1 IAA的半浓度MS培养基中以促进生根。培养条件为25°C、16小时光照和8小时黑暗。在营养盆中适应30天后，
苹果中MdCP37的进化关系
为了探索MdCP37的进化背景，进行了BLAST搜索和系统发育分析。所得的系统发育树显示，MdCP37与Malus baccata的TQE10696.1和Pyrus bretschneideri的XP009359945具有最密切的同源性（图1 A）。所有这些同源物都含有C1A半胱氨酸蛋白酶家族特有的ERFNIN和GCNGG基序（图1 B）。
苹果中MdCP37的时空表达分析
为了研究MdCP37的潜在生物学作用，我们评估了其在不同组织中的表达情况
讨论
干旱是限制苹果产量的主要环境因素，通过生物技术培育耐旱品种对于苹果产业的可持续发展至关重要。在本研究中，我们确定MdCP37是苹果耐旱性的负调控因子，其作用机制涉及调节ROS清除和干旱响应基因的表达。生物信息学分析将MdCP37归类为类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）（图1）。
结论
总之，MdCP37通过减少渗透调节物质和抗氧化酶的积累、增加膜损伤和ROS积累以及抑制干旱响应基因的表达，从而作为苹果耐旱性的负调控因子（图8）。此外，MdCP37通过增加半胱氨酸蛋白酶的水平、促进Rubisco和叶绿素的降解以及上调与衰老相关的基因来促进干旱诱导的叶片衰老。这些发现提供了新的见解
CRediT作者贡献声明
陈秀德：资源、方法论。肖伟：写作——审稿与编辑、资源、资金获取。文彬彬：写作——审稿与编辑、资源、方法论。徐素瑞：可视化、方法论。李玲：写作——审稿与编辑、资源、资金获取。赵文哲：写作——初稿撰写、可视化、资源、数据分析、数据管理。龚星尧：可视化、方法论、研究、数据管理。
利益冲突声明
所有作者声明在此论文中不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了山东省果树产业技术体系-栽培与土壤施肥项目（SDAIT-06-04）、山东省重点研发计划（重大科技创新项目）（2021LZGC021）以及山东省重点研发计划（竞争性创新平台）（2022CXPT017）的支持
