ClRbx1作为SCF复合体中的一个组分，在‘香水’柠檬的自交不亲和性和盐胁迫响应调节中发挥作用

《Plant Science》：ClRbx1 as a component of the SCF complex in the regulation of self-incompatibility and salt stress response in ‘Xiangshui’ lemon

　　李宇泽|张月星|罗聪|杨天|兰茂英|魏菊梅|李明青|吴文婷|彭龙辉|黄桂香|何新华
中国广西大学农学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁，广西530004

**摘要**
RING盒蛋白1（Rbx1）是一种RING结构域蛋白，作为SKP1-Cullin1-F-box（SCF）泛素连接酶复合物的催化核心。它参与了植物自交不亲和、生长和非生物胁迫反应中的泛素化过程。在‘香水’柠檬的基因组中发现了两个拟南芥Rbx1同源基因，分别命名为ClRbx1-1和ClRbx1-2。这两个ClRbx1基因在花粉中高表达，并且与异花授粉相比，自花授粉条件下其表达水平普遍上调。此外，在模拟盐胁迫下，叶片中ClRbx1的表达也有所增加。酵母双杂交实验表明，ClRbx1-1能够与多个与自交不亲和和胁迫反应相关的蛋白质相互作用，包括Cullin1-2、S1-RNase、S3-RNase、Ubc12、AP1M2和Peroxidase25。酵母三杂交实验进一步证实，ClRbx1-1可以与Cullin1-2和SKP1-6/SKP1-14相互作用，组装出典型的SCF复合物。值得注意的是，Ubc12在花粉中高表达，并且自花授粉时的表达水平高于异花授粉。这表明ClRbx1-1可能与Ubc12合作，通过RUB（与泛素相关）修饰途径调节自交不亲和反应。在拟南芥中过表达ClRbx1会导致矮化现象，并显著提高盐胁迫耐受性。通过农杆菌根瘤诱导的‘香水’柠檬转基因技术过表达ClRbx1后，其盐胁迫耐受性也显著提高。总之，本研究阐明了ClRbx1在‘香水’柠檬自交不亲和和盐胁迫反应中的关键作用，为进一步解析SCF复合物在植物中调节自交不亲和和非生物胁迫的分子机制奠定了坚实基础。

**引言**
自交不亲和（SI）是指可育种子植物在自花授粉后无法产生合子的现象。作为被子植物中普遍存在的异交机制，它有助于防止近亲繁殖，并在促进种群多样性方面发挥积极作用（Peer和Mir，2025）。在同型自交不亲和中，根据遗传控制方式将其分为孢子体自交不亲和（SSI）和配子体自交不亲和（GSI）。基于S-RNase的GSI是最常见的类型，存在于茄科、蔷薇科和芸香科等植物中（Zhao等人，2022）。S位点（自交不亲和位点）被认为是控制自交不亲和的关键位点。现有模型认为该位点至少包含两个独立基因，分别特异性表达在雌蕊和花粉中：一个雌性决定因子和一个雄性决定因子（Meng等人，2014；Shi等人，2019；Cui等人，2020）。在基于S-RNase的配子体自交不亲和中，雌性决定因子是S-位点核糖核酸酶（S-RNase），雄性决定因子是S-位点F-box（SLF）。在花粉管生长过程中，来自柱头的S-RNase被运输到花粉管中。自花授粉时，花粉管中的SLF无法识别自身的S-RNase，导致花粉管内的RNA被自身S-RNase降解，细胞骨架解体，最终阻碍花粉管正常延伸至子房进行受精。而在异花授粉过程中，SLF作为SCF E3泛素连接酶复合物的底物适配亚基，特异性结合非自身来源的S-RNase（Tyers等人，1999），随后S-RNase被泛素化并通过26S蛋白酶体降解（Hua等人，2006；Meng等人，2011）。泛素/26S蛋白酶体系统在植物和动物中选择性降解蛋白质，从而调节细胞内蛋白质稳态和多种生物过程。泛素（Ub）与底物蛋白的结合通过一个ATP依赖的反应级联完成，涉及泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）和泛素-蛋白连接酶（E3s）的依次作用。附加的泛素修饰类型提供了关键的结构信息，扩展了泛素的功能多样性（Ban等人，2021）。这一编码最终决定了被泛素化蛋白质的不同命运。26S蛋白酶体降解底物的同时释放出附加的泛素以供再利用。作为泛素-蛋白酶体系统的核心组成部分，泛素-蛋白连接酶（E3）介导泛素向目标蛋白的特异性转移，从而决定其后续的降解或调控修饰（Baek等人，2021）。SCF是一个典型的E3连接酶复合物。首个结构被阐明的SCF复合物是SCFSkp2，其组成包括Cul1（Cullin1）、Rbx1、Skp1（S期激酶相关蛋白1）和Skp2（含有F-box结构域）（Zheng等人，2002）。在拟南芥中，Western blot分析证实AtRbx1是SCF复合物的成员（Gray等人，2002）。在整叶矮牵牛中，对表达S2-SLF1和PiSSK1的转基因植物的花粉提取物进行Co-IP-MS分析，确认了PiCUL1-P和PiRBX1存在于SCFSLF复合物中（Li等人，2014）。在‘五指柑’（Citrus reticulata）中，CrSKP1-e蛋白与花粉特异性F-box蛋白（CrFBX）和CrCUL1A相互作用，提示CrSKP1-e可能通过将CrFBX蛋白连接到CrCUL1来促进‘五指柑’中SCF复合物的组装（Ren等人，2020）。在柚子（Citrus grandis）中，雄蕊特异性高表达蛋白CgSSK1与S6-SLF7a和CgCUL1相互作用，它们可能共同组装成参与柑橘自交不亲和反应的SCF复合物（Cao等人，2024）。

Rbx1最初被鉴定为VHL复合物和SCFCdc4复合物的亚基（Kamura等人，1999）。在植物中，人类（Homo sapiens）Rbx1的两个同源基因首次在拟南芥中被发现（Gray等人，2002）。随后，在多种植物物种中都报道了Rbx1基因的存在，包括整叶矮牵牛（Petunia integrifolia）、水稻（Oryza sativa）、花生（Arachis hypogaea）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays）、‘五指柑’和油菜（Brassica napus）（Hua等人，2006；Xue等人，2008；Lakshmi等人，2010；Tian等人，2013；Wu等人，2014；Tang等人，2017；Xiang等人，2023）。Rbx1在植物中广泛表达，其在花和果实中的表达水平最高。在‘五指柑’中，自花授粉时的Rbx1表达量是异花授粉的六倍，重组蛋白显著抑制了花粉萌发，表明其参与自交不亲和（Tang等人，2017）。在拟南芥中，涉及E1异二聚体AXR1-ECR1和E2酶RCE1（Ubc12的同源蛋白）的RUB1（与泛素1相关，也称为NEDD8）修饰途径对于SCFTIR1活性至关重要。Rbx1可能作为E3参与这一修饰过程。然而，Rbx1过表达会导致CUL1过度修饰，进而影响SCFTIR1介导的Aux/IAA底物的降解，从而导致生长素反应缺陷，如矮化和植株丛生（Gray等人，2002；Wei等人，2023）。在玉米中，Zm-Rbx1在泛素化实验中表现出E3连接酶活性（Wu等人，2014）。在烟草中异源过表达AhRbx1后，转基因植物的根系比野生型更发达。此外，在PEG和NaCl诱导的胁迫下，转基因植株表现出更高的叶绿素稳定性和较低的电解质泄漏（Lakshmi等人，2010）。在油菜中，Rbx1被鉴定为一个多效基因（Xiang等人，2023）。‘香水’柠檬（Citrus limon cv. ‘Rosso’）是一种无籽品种，其重要的无籽特性由配子体自交不亲和（GSI）控制（Zhang等人，2012）。在SCF复合物中，F-box蛋白作为底物识别亚基，通过与目标蛋白的特异性结合启动泛素化过程，从而决定SCF复合物参与的生物过程（Varshney等人，2026）。F-box蛋白在自交不亲和、植物发育和抗逆性等领域的功能已被广泛报道，这也说明了泛素/26S蛋白酶体系统参与多种生物过程的能力（Xu等人，2002；Moon等人，2007；Kim等人，2017；Lim等人，2019；Xue等人，2025）。相比之下，作为催化核心的Rbx1是SCF复合物的组成成分，可以与其他SCF复合物结合发挥作用，因此具有参与不同生物过程的潜力。先前的研究表明，SCF复合物（特别是Cullin1-2-SKP1-6-F-box1）可能通过泛素化S3-RNase来调节这一过程（Li等人，2025）。基于这一模型，我们的研究证实Rbx1是该SCF复合物中不可或缺的RING手指蛋白成分，负责招募E2泛素结合酶以促进泛素化。这一发现强调了Rbx1的广泛功能，不仅限于自交不亲和，还涉及植物的一般发育和胁迫响应。

**材料与生长条件**
**组织表达分析**：从广西大学标本园的六株健康的八岁‘香水’柠檬植株上采集花朵。解剖组织（柱头、花柱、子房、花药、花丝、花瓣、花托、叶片），每种组织至少分为三个生物学重复样本。
**时空表达分析**：去雄花朵进行自花授粉（‘香水’柠檬S3S3 ♀ × ‘香水’柠檬S3S3 ♂）或异花授粉（‘香水’柠檬S3S3 ♀ × 白花柠檬S1S2 ♂）。

**‘香水’柠檬中Rbx1的序列分析与系统发育分析**
在‘香水’柠檬基因组中发现了两个Rbx1基因，分别命名为ClRbx1-1和ClRbx1-2。ClRbx1-1位于第5号染色体上，编码一个118个氨基酸的蛋白质（13.23 kDa，pI 6.17），而ClRbx1-2位于第6号染色体上，编码一个107个氨基酸的蛋白质（12.44 kDa，pI 8.06）。详细的蛋白质特征总结在表S3中。
**使用MEME进行保守基序分析**，在ClRbx1蛋白中鉴定出五个基序，其中基序5仅存在于ClRbx1-1中（图1A）。

**‘香水’柠檬中两个Rbx1同源基因的鉴定与比较分析**
Rbx1蛋白包含超过100个氨基酸，其结构特征是一个C端H2型RING手指结构域，这对它的泛素连接酶活性至关重要（Liu等人，2014；Gingerich等人，2021）。本研究从‘香水’柠檬基因组中鉴定出两个Rbx1同源基因，分别命名为ClRbx1-1和ClRbx1-2。外显子-内含子结构分析显示，两个ClRbx1基因都包含五个外显子和四个内含子。值得注意的是，ClRbx1-1的第三个内含子较长。

**结论**
总之，本研究表明ClRbx1-1是柑橘中多种生物过程的关键多功能RING结构域成分。它在花粉中的高表达及其与Cullin1-2的相互作用证实了其在SCFSLF复合物中的作用。与Ubc12一起，ClRbx1-1促进了Cullin1的NEDD8修饰，这一过程对于维持自交不亲和反应中的SCF复合物活性至关重要。此外，在过表达ClRbx1的拟南芥中观察到的矮化表型也进一步支持了这一作用。

**未引用的参考文献**
（Ban和Estelle，2021；Clough和Bent，1998；Hua和Kao，2006；Kamuar等人，1999；Poverennaya和Roytberg，2020；Sun和Kao，2018；Tang和Wu，2017；Tyers和Willems，1999；Yu等人，2016）

**作者贡献声明**
莫英兰：研究、概念化。
杨天：研究、数据管理。
罗聪：写作-审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学。
张月星：验证、研究、数据管理。
吴文婷：软件、研究。
李明青：软件、研究、正式分析。
李宇泽：写作-审稿与编辑、软件、方法学、研究、概念化。
何新华：写作。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号31960585）、广西科技基地与人才项目（Guike AD25069107）和广西科技先锋专项行动项目（项目编号202604）的资助。