六倍体甘薯中的IbGBSS1纯合基因敲除技术实现了无直链淀粉的淀粉生产，且不会影响产量

《Plant Science》：Homozygous IbGBSS1 Knockouts in Hexaploid Sweet Potato Enable Amylose-Free Starch Without a Yield Trade-Off

　　

聂浩珍|郑振英|范伟娟|闫梦晓|邵文|孟英辉|董安|赵珊珊|袁玲|杨军|王红霞

上海植物功能基因组学与资源重点实验室，上海辰山植物园，中国上海201602

摘要

甘薯（Ipomoea batatas）是一种重要的农作物，也是工业淀粉的重要来源；然而，其六倍体基因组阻碍了完全基因敲除的研究。由于直链淀粉与支链淀粉的比例决定了淀粉的特性，因此生产无直链淀粉（蜡质）淀粉在食品、制药和工业应用中具有很大的潜力。本研究假设，如果完全敲除编码颗粒结合型淀粉合成酶I的IbGBSS1的所有六个等位基因，将不会影响植物的生长或产量。我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术结合Hi-Tom高通量突变检测平台，成功生成了所有等位基因均发生突变的纯合Ibgbss1突变体。这些突变体中的直链淀粉含量低于1%，在温室和田间条件下均表现出正常的生长和产量。物理化学分析表明，无直链淀粉的淀粉具有较大的颗粒结构、改变的支链淀粉链长分布（DP 6-12降低而DP 36以上增加），以及大量的表面孔隙。差示扫描量热法显示其糊化起始温度和峰值温度升高，糊化焓也有所增加。转录组分析显示，淀粉和蔗糖的代谢发生了广泛的重编程，储存根中葡萄糖、果糖和蔗糖的积累量也有所增加。这些结果证明IbGBSS1对直链淀粉的合成至关重要，并为六倍体甘薯中生成多等位基因敲除体提供了策略。获得的无直链淀粉种质没有产量损失，具有潜在的食品和工业应用价值。

引言

甘薯是全球最重要的根茎作物之一，在中国广泛种植（Guo等人，2019年；Zhou等人，2015a年）。淀粉是甘薯根的主要储存成分，是食品加工和多种工业应用的宝贵原料（Lyu等人，2021年）。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，两者的比例显著影响其物理化学性质（Lyu等人，2021年）。在野生型甘薯中，直链淀粉通常占总淀粉的20-30%（Takeda等人，1986年）。直链淀粉含量非常低的淀粉（< 10%）被称为蜡质淀粉（Tao，1990年；Wang等人，2019年），适用于乳化剂、薄膜涂层、填料、聚合物复合材料和纳米颗粒等应用（?árka和Dvo?á?ek，2017年）。因此，通过遗传工程降低甘薯中的直链淀粉含量在食品和工业领域具有重大价值。

淀粉的生物合成涉及五类核心酶，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBEs）、淀粉解分支酶（DBEs）和颗粒结合型淀粉合成酶I（GBSSI）（Wang等人，2019年；Huang等人，2021年）。GBSS1是储存组织中直链淀粉形成的关键酶，其在多种作物中的关键作用已被证实，包括水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum L.）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）和玉米（Zea mays L.）（Crofts等人，2018年；Liu等人，2021年；Toinga-Villafuerte等人，2022年；Xu等人，2021年；Zhong等人，2020年）。在甘薯中，通过RNAi抑制IbGBSS1可以降低直链淀粉含量（Zhou等人，2015a年）。然而，由于甘薯的六倍体基因组，尚未实现所有六个IbGBSS1等位基因的完全敲除。因此，GBSS1的完整功能及其对淀粉物理化学性质和农艺性状的影响仍不清楚。

在之前的研究中，我们使用CRISPR/Cas9技术在淀粉型品种Xu22和富含类胡萝卜素的品种Tai6中生成了Ibgbss1突变体（Wang等人，2019年）。尽管检测到了突变，但尚不清楚是否所有六个等位基因都同时被破坏，而这正是生成无直链淀粉甘薯的关键。在所有等位基因上实现完全纯合敲除在技术上具有挑战性，但对明确GBSS1的功能和开发蜡质甘薯种质至关重要。为了克服这一限制，Hi-Tom高通量突变检测平台（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）为多倍体作物提供了高效的等位基因分型方法（Liu等人，2019年；Sun等人，2024年）。在本研究中，我们使用Hi-Tom平台精确识别了所有六个IbGBSS1等位基因均发生突变的品系。鉴于GBSS1在直链淀粉合成中的关键作用，我们假设在六倍体甘薯中完全破坏所有六个IbGBSS1拷贝将消除直链淀粉的生成，同时保持正常的植物生长、储存根的发育和淀粉产量。此外，我们认为GBSS1功能的丧失会触发淀粉和蔗糖代谢的补偿性重编程，从而导致淀粉物理化学性质的改变。

为了验证这一假设，我们在两个品种中识别了纯合Ibgbss1突变体，并系统地检测了它们的淀粉组成、物理化学特性、糖代谢和农艺表现。

章节片段

IbGBSS1纯合敲除系的鉴定

此前，我们在Xushu 22（Xu22）和Taizhong 6（Tai6）品种中获得了表达针对IbGBSS1基因的sgRNAs的转基因甘薯品系（Wang等人，2019年）。为了鉴定携带纯合突变的品系，从19株转基因植物和2株野生型对照中提取了基因组DNA。使用引物对sgRNA1 F/R和sgRNA2 F/R扩增了sgRNA靶位点周围的区域（引物序列见方法部分）。PCR产物经过下一代测序技术处理

讨论

甘薯是一种全球重要的作物，不仅因其营养价值而受到重视，还因其丰富的淀粉储备而成为食品和工业应用的原料。直链淀粉与支链淀粉的比例是决定淀粉特性的关键因素，低直链淀粉（蜡质）淀粉具有独特的物理化学性质，非常适合用于乳化剂、涂层、生物塑料和特种食品的加工。

植物材料和生长条件

之前已有报道使用CRISPR/Cas9编辑Ibgbss1的品系（Wang等人，2019年），这些品系是在Xushu 22（Xu22）和Taizhong 6（Tai6）品种中生成的。在Xu22背景下的编辑品系被命名为Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-001, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-003, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-004, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-005, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-006, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-007, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-008, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-009, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-010, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-011, Xu22-IbGBSS1-sgRNA12-012

资金来源

本项目得到了上海市绿化和市容环境卫生管理局（G232405, G252407, G242407, G222413, 和 G222411）、上海市科学技术委员会（22JC1401300）以及国家自然科学基金（32472220 和 32300207）的支持。

作者贡献

W.H.和Y.J.提出了研究思路；W.H.、Y.J.和N.H.设计了实验；N.H.、Z.Z.、F.W.、Y.M.、S.W.、M.Y.、A.D.和Z.S.完成了所有实验并分析了数据；N.H.起草了原始手稿；W.H.、Y.J.和L.Y.对手稿进行了审阅和编辑。

作者声明没有利益冲突。

孟英辉：方法学研究。邵文：方法学研究。赵珊珊：项目管理。董安：软件开发。杨军：写作 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。袁玲：写作 – 审稿与编辑。聂浩珍：写作 – 初稿撰写、数据可视化、验证、方法学研究、资金获取、数据分析。王红霞：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。范伟娟：方法学研究。

作者声明没有利益冲突。