BR信号通路通过整合活性氧（ROS）的稳态调控与铜的转运机制，减轻了铜对水稻的毒性作用

《Plant Science》：BR signaling mitigates Cu toxicity in rice by integrating ROS homeostasis with Copper Translocation

　　华英杜|孙露露|沈全雷|潘敬林|毕静|廖子深|林贤辉|陈东梅|曾仁森|宋圆圆
中国农业与林业生物安全国家重点实验室，教育部作物遗传、育种与多用途利用重点实验室，福建农林大学农学院，福州，中国

**摘要**
土壤中铜（Cu）的过量积累会引发植物毒性反应，严重阻碍作物生长和产量。植物根部吸收的铜通过根到茎的转运分配到各种组织中。尽管已有大量研究表明植物激素在调节植物对重金属胁迫的反应中起作用，但油菜素内酯（BRs）在调控水稻铜耐受性中的作用仍不清楚。本研究发现，铜胁迫会上调水稻中BR生物合成基因的表达，外源BR可以减少铜胁迫下的活性氧（ROS）积累和木质素沉积。通过对一系列BR相关遗传材料的表型和生理分析发现，像OsBZR1过表达株系这样的增强BR信号传导的植物，在铜胁迫下表现出更好的茎和根生长，并通过增强ROS清除酶的活性来减轻ROS积累。有趣的是，在正常条件下BR能够促进根系对铜的吸收和根到茎的转运，但在铜胁迫下，具有增强BR信号传导能力的植物表现出较低的铜积累和根系吸收能力，从而缓解了生长抑制。OsBZR1作为关键的下游枢纽，介导了BR依赖性的铜耐受性。此外，BR还通过转录调控与铜转运相关的基因OsCOPT6、OsNPF6.5和OsYSL16来调节铜胁迫下的根系铜吸收和根到茎的转运。总之，我们的研究结果表明，BR信号传导通过整合ROS平衡和铜转运蛋白的转录调控，减轻了铜的毒性，从而在胁迫条件下改善了植物生长，突显了多个BR信号传导组分在调节水稻对铜胁迫反应中的功能作用。

**引言**
铜（Cu）是植物必需的营养元素。然而，近年来化学制造活动的扩张和过量施肥导致土壤中铜的积累，成为重金属污染的重要来源（Huang等人，2016；Fang等人，2017；Mir等人，2021）。作为一种氧化还原活性的过渡金属，铜在植物体内主要以离子（Cu2?和Cu?）的形式存在，而不是氧化物（Printz等人，2016）。铜参与多种生理过程，包括光合作用、呼吸作用、乙烯信号传导、碳和氮代谢、金属硫蛋白的氧化以及细胞壁的形成。此外，铜还与参与电子传递和氧化还原反应的蛋白质结合（Burkhead等人，2009）。虽然适量的铜可以促进植物生长，但其积累超过一定阈值时会产生毒性效应，抑制作物发育并降低产量（Burkhead等人，2009；Printz等人，2016）。过量的铜吸收会扰乱生理代谢，导致种子发芽率降低、生长受阻、根系发育不良、叶片黄化，并妨碍其他养分的吸收和运输（Srivastava等人，2017）。为了应对土壤中的铜胁迫，植物采用了隔离和排出机制（Shi等人，2020）。例如，根际微生物分泌的有机酸可以与铜离子形成螯合物，改变铜的化学形态，通过形成稳定的复合物促进其沉淀或在土壤中通过氧化还原反应促进其溶解（Seshadri等人，2015；Brunetto等人，2016）。或者，植物将铜从细胞质中排出。细胞壁作为防止重金属离子进入植物的主要屏障，有助于维持细胞形态并促进物质运输。它还通过储存铜来增强对重金属胁迫的抵抗力（Wang等人，2016）。植物细胞壁由果胶、半纤维素、纤维素、多糖和糖蛋白组成的复杂网络构成，在过量铜的刺激下会发生结构变化。这些变化促进Cu2?与细胞壁多糖和蛋白质的结合，从而降低铜的生物活性，减轻铜胁迫下的毒性（Xia等人，2018）。

有毒重金属主要通过根系吸收进入植物并在根组织中积累（Ali等人，2020）。铜被根系吸收后，通过根到茎的转运机制分配到各种组织和器官（Palmer & Guerinot，2009）。为了维持铜的平衡，植物不仅分泌有机酸，还利用一系列特定的转运蛋白来负责铜的吸收、运输和分配（Pilon，2011）。这些转运蛋白包括铜转运蛋白（COPT）家族、重金属ATP酶（HMA）、ATP结合盒（ABC）转运蛋白、黄条状蛋白（YSL）多药和有毒化合物排出（MATE）蛋白以及磷酸转运蛋白（PHT）等（Panda等人，2025）。在水稻中，已鉴定出7种COPT成员，这些蛋白具有三个保守的跨膜结构域和一个富含甲硫氨酸和组氨酸的N端金属结合结构域，主要负责根部的铜吸收（Puig & Thiele，2002）。过量的铜会通过减少NO??的吸收和抑制根部的硝酸还原酶（NR）活性来损害硝酸盐代谢，同时导致低亲和力硝酸盐转运蛋白OsNPF6.5、OsNPF2.2和OsNPF2.4的转录水平下降（Huo等人，2020）。P型重金属ATP酶（HMAs）识别跨膜金属结合位点，促进各种重金属离子的运输（Kuhlbrandt，2004）。在拟南芥中，HAM5参与木质部中的铜排出（Kobayashi等人，2008），HAM7参与铜向乙烯受体的运输（Hirayama等人，1999），而HAM6参与光合电子的运输。HMA6和HMA8与蓝细菌中的PacS转运蛋白具有结构相似性，介导铜向叶绿体和类囊体腔的运输，用于叶绿素原的合成（Shikanai等人，2003；Zheng等人，2012）。HMA1与HMA2和HMA4具有氨基酸序列相似性，在锌过量条件下通过降低锌浓度来缓解锌的毒性（Kim等人，2009）。在水稻中，已鉴定出9种P1B型ATP酶（OsHMA）基因。其中，OsHMA9的表达受过量铜的诱导，参与木质部和韧皮部中的铜装载/卸载以及铜的解毒（Lee等人，2007）。OsHMA5主要在根部表达，是一种Cu?/Ag?转运蛋白，在营养生长期和生殖生长期都参与铜向木质部的运输（Deng等人，2013）。OsHMA2在根尖维管韧皮部表达，优先将锌和镉运输到发育中的组织（Yamaji等人，2013）。在低镉积累的品种中，其同源基因OsHMA3将镉隔离在根液泡中，从而限制镉向茎部的转运，而不影响铁和锌的水平。值得注意的是，尽管当前研究已经详细阐明了根系对金属过量的响应机制，但茎部在铜过量条件下的响应和转运动态仍相对较少被了解。

铜和铁（Fe）都存在于不同的价态，并作为许多植物生理过程的辅因子，在呼吸作用和光合作用的电子传递链中发挥重要作用（Nouet等人，2011）。近年来，铜和铁之间的相互作用被广泛报道为有助于铜的平衡。铜过量或铁缺乏都会导致水稻叶片黄化并降低茎部的铁浓度（Waters等人，2012；Liu, J等人，2015）。转录组分析发现了几种共同调节铜和铁平衡的基因。铜过量会触发铁缺乏反应，上调12个参与铁吸收和根到茎转运的基因，从而增强铁的吸收并缓解铜毒性或铁缺乏引起的黄化。然而，在铁缺乏条件下，自由铁的水平不足以引发铜的毒性（Garcia-Molina等人，2020；Gong等人，2023）。在矮牵牛花瓣中，铜胁迫会改变铁缺乏响应基因和光合作用相关基因的转录水平，而铁缺乏则不会影响这些基因的蛋白质表达（Wu等人，2021）。铁平衡的关键调节因子，如FER-LIKE铁缺乏诱导转录因子（FIT）和bHLH Ib成员，在低铁条件下通过上调铜吸收相关基因（包括COPT2、FRO4和FRO5）来促进铜的积累。铁螯合还原酶3（FRO3）在铁缺乏和铜缺乏条件下都会被诱导（Mukherjee等人，2006；Cai等人，2021）。然而，铁和铜信号网络之间相互作用的分子机制仍大部分不清楚。

最近的研究强调了植物激素与重金属胁迫之间的相互作用。植物通过调节包括赤霉素（GA）、生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）和油菜素内酯（BR）等激素的水平来介导重金属（如砷、镉、铬、汞和铅）的解毒机制（Dai等人，2023）。在金属胁迫下，BR、GA和SA可以增强生长素的积累（Ronzan等人，2018）。相反，像砷和镉这样的金属污染物通过降低根部的生长素水平来抑制植物发育，部分原因是通过下调参与生长素外排的PIN家族基因（Wang等人，2021）。外源BR的应用与生长素和GA协同作用，以应对铁缺乏胁迫（Sun等人，2022）。同时，镉胁迫促进BR的生物合成，激活BR信号通路、生长素和细胞分裂素的合成，有助于适应胁迫（Kanwar等人，2015；Nazir等人，2021）。

油菜素内酯（BRs）是一类多羟基甾醇化合物，能被细胞外受体激酶识别，激活下游信号级联反应，调节BR响应基因的表达（Yin等人，2025）。在水稻中，BR的生物合成由多个关键酶编码基因共同控制。其中，OsD2和OsD11编码负责C-23羟基化和C-3还原的细胞色素P450单加氧酶。OsDWF4催化限速的C-22羟基化步骤，而OsBRD1参与C-6氧化。另一方面，OsBRD2介导24-甲基胆固醇向香叶醇的转化（Zhang等人，2014；Wei和Li，2020）。在BR信号传导增强或外源BR处理下，包括OsDWF4、OsD2和OsD11在内的多个BR生物合成基因的转录水平显著降低，从而通过负反馈调节来减少BR的生物合成速率，维持BR的平衡（Ren等人，2020；Tian等人，2021）。在高浓度下，BR与受体激酶BR INSENSITIVE1（BRI1）结合，诱导自磷酸化和激活。随后与共受体激酶BRI1-ASSOCIATED KINASEs（BAKs）形成复合物，BR信号通过一系列磷酸化和去磷酸化级联反应传递（Nolan等人，2020）。水稻中的核心信号通路与拟南芥基本一致。OsBRI1-OsBAKs（OsSERKs）复合体传递BR信号并激活OsBSKs，后者与含有Kelch结构域的蛋白磷酸酶（OsPPKLs）相互作用，促进信号转导。OsPPKLs去磷酸化并调节GSK3/SHAGGY-LIKE KINASEs（OsGSK3s）的活性，这是BR信号传导的关键下游负调节因子。OsGSK3s最终磷酸化主要的BR响应转录因子BRASSINAZOLE RESISTANT1（OsBZR1），调节其活性和下游靶基因的表达（Zhang等人，2023）。此外，作为BR信号通路中的关键转录因子，OsBZR1不仅作为正调节因子促进下游基因的表达以促进生长，还在负反馈回路中作为抑制剂，直接抑制BR生物合成基因和上游信号组分的转录（Du等人，2023；Zhang等人，2014）。最近的研究表明，BR通过抑制ROS爆发和改善光合作用性能（包括叶绿素含量、光合作用同化效率、PSII系统活性和光合作用速率）来增强对重金属胁迫的耐受性，从而增强碳同化能力（Dai等人，2023）。例如，向豇豆施用24-表油菜素内酯（eBL）可以减少镉的积累并增加其他必需元素的含量（Santos等人，2018）。由于胁迫会诱导BR的生物合成，有助于维持渗透平衡并降低ROS水平，从而减轻膜和氧化损伤，并提高芸苔属植物和小麦对砷的耐受性（Kanwar等人，2015；Maghsoudi等人，2020）。BR的应用还能显著抑制镉和ROS的积累，以JA信号依赖的方式提高水稻的镉耐受性（Zhang等人，2024）。同样，eBL的补充可以降低水稻中的铅含量，提高养分浓度，改善光合作用能力，并减轻铅和铬胁迫引起的氧化损伤（Sharma等人，2016；Guedes等人，2021）。作为主要的非生物胁迫，重金属污染显著影响作物的生长、发育、产量和品质。然而，水稻中BR介导的对铜胁迫的生理机制仍不清楚。

在这项研究中，我们通过BR的应用和一系列BR信号通路中的关键调控基因的遗传材料，探讨了BR对水稻铜胁迫响应的影响。外源BR减轻了铜引起的生长抑制并减少了ROS的积累。进一步分析BR负调控因子OsPPKL1和OsGSK3以及BR正调控因子OsBZR1的遗传材料发现，在OsPPKL1和OsGSK3基因编辑株系以及OsBZR1过表达株系中，根系的生长表现出对铜（Cu）胁迫的增强耐受性，并且根系对铜的吸收能力降低。这些发现揭示了BR信号通路在赋予铜耐受性方面的积极作用，以及转录因子OsBZR1作为介导这一过程的核心下游枢纽的作用。在铜胁迫下，BR激活了ROS清除系统，同时通过调控关键转运基因（包括OsCOPT6、OsNPF6.5和OsYSL16）的表达来调节铜的吸收和从根向茎部的转运。这项研究加深了我们对植物适应铜胁迫过程中BR通路的理解，并为通过操纵BR信号通路成分培育耐铜水稻品种提供了潜在的遗传靶点。

**材料**
本研究使用了Oryza sativa L. cv. Zhonghua11（ZH11）。使用了之前从ZH11背景中开发的遗传材料（Gao等人，2019年；Du等人，2023年），包括OsPPKL1（OE-OsPPKL1）、OsGSK3（OE-OsGSK3）和OsBZR1（OE-OsBZR1）的过表达株系，以及OsPPKL1（cr-osppkl1）、OsGSK3（cr-osgsk3）和OsBZR1（cr-osbzr1）的CRISPR/Cas9基因编辑株系。水稻幼苗在培养箱中以28℃（白天）和25℃（夜晚）的循环条件下培养。

**铜胁迫下BR合成基因和信号基因的表达模式**
为了研究铜胁迫对BR合成和信号传导的影响，我们分析了几个BR合成基因（OsDWF4、OsD11、OsD2、OsBRD1、OsBRD2）以及BR信号通路核心成分的转录水平。OsDWF4的表达在施铜后12小时达到峰值，并在48小时时仍显著高于未处理对照组（图1A）。OsD11在铜胁迫6小时后表达显著增强，而OsD2在铜胁迫24小时后显著上调。

**讨论**
在重金属胁迫下，植物通过涉及ROS、一氧化氮和植物激素的信号感知和转导机制激活应答反应。这一过程会导致细胞间隙中ROS水平（包括H2O2、O2?和OH?）急剧升高，从而引发氧化应激，导致脂质过氧化、氧化损伤和生物分子降解（Islam等人，2015年；Panda等人，2025年）。铜作为一种氧化还原活性金属，会催化O2?的形成并生成H2O2。

**结论**
我们的研究表明，BR信号通路在水稻对铜胁迫的响应中起着积极作用。我们发现BR通过其下游转录因子OsBZR1增强了铜耐受性。这些发现表明，增强的BR信号传导不仅通过激活活性氧清除系统减轻了氧化损伤，还显著抑制了胁迫引起的过量木质素沉积，从而有效缓解了根系生长抑制。

**资助信息**
本工作得到了中国福建省自然科学基金（2024J01383）、国家自然科学基金（32371588、32271617、32401402、32471656）、福建省农林大学科技创新专项基金（KFB25060A）的支持。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。

**作者贡献声明**
Lulu Sun：可视化、验证、方法学、研究。
Huaying Du：写作——审阅与编辑、写作——初稿、验证、资源、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Quanlei Shentu：可视化、验证、资源、研究。
Rensen Zeng：写作——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、概念化。
Dongmei Chen：可视化、研究。
Yuanyuan Song：作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。