细粒石灰石与粗粒石灰石比例对洛曼布朗产蛋鸡在产蛋高峰期及产蛋后期性能、鸡蛋品质、骨骼特征以及肾脏中CYP27B1蛋白含量的影响

《Poultry Science》：Effects of fine-to-coarse limestone ratio on performance, egg quality, bone traits, and renal CYP27B1 protein abundance in peak and aged Lohmann Brown laying hens

　　赫洛伊莎·帕格努萨特（Heloísa Pagnussatt）| 卡洛斯·恩里克·德·奥利维拉（Carlos Henrique de Oliveira）| 让·凯克·瓦伦蒂姆（Jean Kaique Valentim）| 里卡多·维亚纳·努内斯（Ricardo Vianna Nunes）| 费尔南多·德·卡斯特罗·塔韦拉里（Fernando de Castro Tavernari）| 乔瓦娜·利马·维埃拉（Giovanna Lima Vieira）| 贝亚特丽兹·阿尔瓦雷斯·德·奥诺里奥（Beatriz Alvarez de Honório）| 阿雷莱·阿林多·卡尔德拉诺（Arele Arlindo Calderano）
巴西维索萨联邦大学（Universidade Federal de Vi?osa）动物科学系

**摘要**
本研究进行了两项试验，旨在评估在不同生产阶段饲喂不同细粒与粗粒石灰石比例（FL:CL）的产蛋鸡的生产性能、蛋品质、血液和骨骼特征以及肾脏1α-羟化酶（CYP27B1）蛋白的含量。试验1共有180只26周龄的洛曼布朗鸡（Lohmann Brown），试验2共有96只66周龄的洛曼布朗鸡。分别将它们分配到60:40、50:50和30:70的FL:CL比例组中。两项试验均表明，饮食中的FL:CL比例对生产性能、蛋品质或血液参数没有影响。在试验1中，30:70的FL:CL比例降低了胫骨相对重量和胫骨抗折强度（p < 0.05）；而在试验2中，50:50比例组的肾脏CYP27B1蛋白含量降低了约20%（p < 0.05）。此外，30:70比例组增加了饲料摄入量（p < 0.05）并降低了胫骨中的钙含量（p < 0.05），其他变量则未受影响。总体而言，改变FL:CL比例对蛋壳品质没有显著影响，对生产性能的影响也有限，但较高比例的粗粒石灰石对某些骨骼特征有负面影响。中间比例50:50与较低的肾脏CYP27B1蛋白含量相关，这可能与维生素D3活性的需求减少有关，可能表明钙稳态更为稳定。

**引言**
在产蛋鸡中，蛋壳的形成每天都在子宫内进行，是已知最快的生物矿化过程之一。为了沉积约6克碳酸钙（CaCO3）的蛋壳，鸡每天需要排出约2.4克的钙，这几乎占其总钙含量的10%（Nys等人，2022年）。尽管饮食中的钙来源提供了大约三分之二的钙需求，但钙的摄入主要发生在白天，而蛋壳的形成主要发生在夜间，这种时间上的不匹配导致了骨骼中钙的动员（Nys，2017年；Nys等人，2022年）。

研究表明，使用不同粒度的石灰石可以有效改善蛋壳厚度和强度（Hervo等人，2022年，2023年）、蛋的内部品质（Khosht等人，2020年）以及骨骼的矿物质含量和强度（Molnár等人，2017年）。这些有益效果归因于粗粒石灰石相比细粒石灰石能够更缓慢、更渐进地释放可溶性钙，从而减少了钙供需之间的不匹配（Bueno等人，2016年；Hervo等人，2022年）。这些变化也可能影响与钙调节相关的生理机制，包括受钙稳态调节的肾脏1α-羟化酶（CYP27B1）的活性。然而，关于最佳细粒与粗粒石灰石比例（FL:CL）尚未达成共识，不同研究的结果也不一致。

在禽类肾脏中，CYP27B1酶催化25-羟基胆钙化醇的活化，生成1α,25-二羟基胆钙化醇（Nys等人，2022年）。这种活性形式的维生素D?通过促进肠道对钙的吸收在钙稳态中起关键作用（Pizauro Junior等人，2017年）。然而，据我们所知，此前尚未有研究评估饮食中的FL:CL比例对产蛋鸡肾脏CYP27B1蛋白含量的影响。这是一个重要的知识空白，因为钙供应动态的变化可能会改变钙代谢的内分泌调节。使用FL:CL比例反映了常见的饲养实践，并允许在保持恒定饮食钙水平的情况下评估颗粒大小分布的影响，从而评估钙释放动力学对生理调节的作用。

随着鸡年龄的增长，钙的吸收效率下降，它们对骨骼来源的钙依赖性增加，以维持适当的蛋壳形成。在这种情况下，增加粗粒石灰石的比例可能是一种营养策略，可以改善钙的时间可用性，因为粗粒石灰石在砂囊中的停留时间更长，溶解过程更渐进。这种持续的钙释放有助于减少对骨骼中钙的动员，特别是在较老的鸡中。因此，本研究旨在评估产蛋鸡在早期生产阶段（26至41周龄）和晚期生产阶段（66至81周龄）的生产性能、蛋的内部和外部品质、血液参数、骨骼特征以及肾脏CYP27B1蛋白的含量。

**材料与方法**
两项试验在巴西米纳斯吉拉斯州维索萨市的维索萨联邦大学（UFV）动物科学系进行。所有程序均符合巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）制定的指南，并获得了UFV生产动物使用伦理委员会（CEUAP-UFV）的批准（协议编号133/2023）。试验评估了生产周期的不同阶段。在适用的情况下，实验程序和分析方法按照文献中描述的先前协议和既定方法进行。

试验1和试验2采用完全随机设计。处理组随机分配到实验单元中，笼子位置在设施内均匀分布，以最小化潜在的位置效应。两项试验均持续102天，并使用独立的鸡群同时进行。试验2中的鸡在实验开始前按照洛曼（Lohmann，2020年）的管理指南和Rostagno等人（2024年）的营养建议，在标准商业条件下饲养至66周龄。在两项试验中，根据平均体重（BW）和产蛋率选择鸡只，以确保实验组之间的初始一致性。

试验1中，共有180只26周龄的洛曼布朗产蛋鸡，平均体重为1.81公斤，产蛋率为98.37%，被分配到三个处理组，每组十个重复单元，每个实验单元六只鸡。试验2中，共有96只66周龄的洛曼布朗产蛋鸡，平均体重为1.86公斤，产蛋率为89.66%，被分配到两个处理组，每组八个重复单元，每个实验单元六只鸡。每个实验单元由三个笼子组成，每个笼子两只鸡。所有笼子都配备了槽式喂食器和乳头式饮水器，允许自由采食和饮水。

实验饲料根据Rostagno等人（2024年）的建议配制，以满足26至33周龄和34至41周龄（试验1）以及66至81周龄（试验2）产蛋鸡的营养需求（表1和表2）。在每个试验中，所有饲料的能量和氮含量相同，仅FL:CL比例不同。饲料处理基于两种不同粒度的石灰石的不同添加比例，这两种石灰石来自同一来源，化学成分相同，但经过处理以获得不同的粒度：细粒石灰石（FL）的几何平均直径为0.200毫米，几何标准差为2.58毫米；粗粒石灰石（CL）的几何平均直径为3.166毫米，几何标准差为1.59毫米。因此，试验1的处理组比例为60:40、50:50和30:70（表1），试验2的处理组比例为50:50和30:70（表2）。

**表1. 试验1中实验饲料的成分和计算组成（g/kg）**
| 时期 | 组别 | FL:CL比例 |
|------------|-------------|-------------|
| 26至33周 | 60:40 | 50:50 | 30:70 |
| 34至41周 | 60:40 | 50:50 | 30:70 |
| 66至81周 | 50:50 | 30:70 | 60:40 | 50:50 |

**表2. 试验2中实验饲料的成分和计算组成（g/kg）**
| 时期 | 组别 | FL:CL比例 |
|------------|-------------|-------------|
| 66至81周 | 50:50 | 30:70 | |

**试验设计与实施**
两项试验在巴西米纳斯吉拉斯州维索萨市的维索萨联邦大学动物科学系进行。所有程序均符合巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）制定的指南，并获得了UFV生产动物使用伦理委员会（CEUAP-UFV）的批准（协议编号133/2023）。试验评估了生产周期的不同阶段。实验程序和分析方法均按照文献中描述的先前协议和既定方法进行。

试验1和试验2采用完全随机设计。处理组随机分配到实验单元中，笼子位置在设施内均匀分布，以最小化潜在的位置效应。两项试验均持续102天，并使用独立的鸡群同时进行。试验2中的鸡在实验开始前按照洛曼（2020年）的管理指南和Rostagno等人（2024年）的营养建议饲养至66周龄。在两项试验中，根据平均体重和产蛋率选择鸡只，以确保实验组之间的初始一致性。

在试验1中，180只26周龄的洛曼布朗产蛋鸡被分为三个处理组，每组十个重复单元，每个实验单元六只鸡。在试验2中，96只66周龄的洛曼布朗产蛋鸡被分为两个处理组，每组八个重复单元，每个实验单元六只鸡。每个实验单元由三个笼子组成，每个笼子两只鸡。所有笼子都配备了槽式喂食器和乳头式饮水器，允许自由采食和饮水。

实验饲料根据Rostagno等人（2024年）的建议配制，以满足26至33周龄和34至41周龄（试验1）以及66至81周龄（试验2）产蛋鸡的营养需求。在每个试验中，所有饲料的能量和氮含量相同，仅FL:CL比例不同。饲料处理基于两种不同粒度的石灰石的不同添加比例，这两种石灰石来自同一来源，化学成分相同，但经过处理以获得不同的粒度。

**结果分析**
总体而言，改变FL:CL比例对蛋壳品质没有显著影响，对生产性能的影响也有限，但较高比例的粗粒石灰石对某些骨骼特征有负面影响。中间比例50:50与较低的肾脏CYP27B1蛋白含量相关，这可能与维生素D3活性的需求减少有关，可能表明钙稳态更为稳定。

**结论**
本研究表明，调整细粒与粗粒石灰石的比例可能对产蛋鸡的钙稳态产生积极影响，从而改善蛋壳和骨骼品质，尤其是在钙吸收效率较低的老年鸡中效果更为明显。因此，本研究的目的是评估产蛋鸡在早期生产阶段（26至41周龄）和晚期生产阶段（66至81周龄）的生产性能、蛋的内部和外部品质、血液参数、骨骼特征以及肾脏CYP27B1蛋白的含量。右侧胫骨的抗折强度（kgf）是通过纹理分析仪测定的，而左侧胫骨则用于测定钙（Ca）、磷（P）和灰分含量。胫骨通过压力机手动破碎，然后用索氏提取器（Soxhlet，1879年）脱脂，并在球磨机中研磨以供分析。对于灰分的测定，将2克风干样品在550°C的马弗炉中燃烧4小时。完全燃烧后，将坩埚放入干燥器中30分钟，称重并记录结果（AOAC International，2016年）。为了测定钙和磷的百分比，进行了硝酸-高氯酸消化法（Sarruge和Haag，1974年），其中0.5克研磨样品与10毫升硝酸和高氯酸溶液以4:1的比例在通风橱中进行处理。消化过程从80°C开始，逐渐升温至200°C，直到获得清澈透明的提取物。冷却后，用去离子水将体积调整至25毫升。钙和磷的浓度通过电感耦合等离子体光发射光谱法（ICP-OES – Nolte，2003年；Perkin Elmer Optima 8300 DV仪器）进行定量，该方法之前已使用与样品相同基质的多元素溶液进行校准。此外，相对胫骨重量（RTW，%）是通过胫骨重量（g）与体重（BW）的比率计算得出的，而Seedor指数（SI）则是根据Seedor（1993年）的方法，通过骨质量（mg）除以骨长度（mm）计算得出的。还收集了肾脏样本以评估CYP27B1蛋白的丰度。组织匀浆物是通过将肾脏碎片用0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤并在0.3克组织对1.5毫升PBS的比例下进行匀浆制备的。匀浆物在12,500 x g的离心力下离心10分钟，得到的上清液储存在-20°C下待进一步分析。CYP27B1的水平是通过商业ELISA试剂盒（Chicken 25-羟基维生素D-1α羟化酶ELISA Kit；MyBioSource，加利福尼亚州圣地亚哥）测定的，该试剂盒基于双抗体夹心技术。该测定法专门用于检测鸡的CYP27B1蛋白，使用的是由制造商验证的抗体。测定过程包括将样品在预先涂有抗CYP27B1单克隆抗体的96孔板上孵育，然后依次加入生物素化多克隆抗体、酶-亲和素-过氧化物酶结合物和显色底物（TMB）。使用微孔板分光光度计（MultiskanTM Go，Thermo Fisher Scientific Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆）在450 nm处读取光密度。样品浓度是根据制造商提供的标准曲线用已知浓度的CYP27B1制备的。所有样品都进行了两次重复测定，平均值用于后续分析。为了最小化分析变异性，所有样品都在同一测定过程中处理。结果根据ELISA试剂盒的输出以U/mg表示，未进行总蛋白含量的归一化。数据使用SAS软件（版本9.4；SAS Institute Inc.，北卡罗来纳州卡里）的GLM程序进行单因素方差分析（ANOVA），固定效应为FL:CL比率。模型中没有包括随机效应。实验单元由三个笼子（六只母鸡）组成。性能变量以实验单元作为统计单位进行分析。鸡蛋质量测量基于每个实验单元收集的鸡蛋的平均值。血液和骨骼变量以及肾脏CYP27B1蛋白的丰度是每只母鸡的数据。正态性和方差同质性的假设分别使用Shapiro-Wilk检验和Hartley检验进行评估。数据在5%的显著性水平下进行方差分析，当检测到显著效应时，使用Tukey检验比较处理组平均值。

**结果**

在试验1中，改变FL:CL比率对性能、鸡蛋质量或所有评估的血液参数没有显著影响（p > 0.05）（表3）。骨骼质量、砂囊重量、SI以及胫骨中的钙、磷和灰分含量也未受到FL:CL比率的影响（p > 0.05）（表3）。然而，最高的CL比例（30:70）导致相对胫骨重量（RTW）降低（p = 0.050）和胫骨抗折强度降低（p < 0.001）（表3）。此外，喂食50:50 FL:CL比率的母鸡的肾脏CYP27B1蛋白丰度比喂食60:40和30:70比率的母鸡低约20%（p = 0.018）（表4）。

**表3. 26至41周龄不同细粒-粗粒石灰石比例喂养的产蛋母鸡的性能、鸡蛋质量、血液参数和骨骼质量（试验1）**

| 细粒-粗粒比率 | SE | p值 |
| --- | --- | --- |
| 60:40 | 0.19 | 0.18 |
| 50:50 | 0.18 | 0.18 |
| 30:70 | 0.00 | 0.67 |
| 饲料摄入量（g/母鸡/天） | 116.2 | 113.1 | 116.4 | 0.70 |
| 产蛋率（%） | 98.30 | 98.27 | 97.9 | 0.15 |
| 非商业鸡蛋百分比（%） | 0.59 | 0.67 | 0.64 | 0.09 |
| 饲料转化率（g/g） | 1.41 | 1.38 | 1.42 | 0.01 |
| 鸡蛋质量（g/母鸡/天） | 58.54 | 57.55 | 58.25 | 0.33 |
| 鸡蛋重量（g） | 59.79 | 58.44 | 59.42 | 0.29 |
| 蛋黄指数 | 0.423 | 0.426 | 0.422 | 0.001 |
| 蛋黄颜色 | 5.73 | 5.84 | 5.89 | 0.035 |
| 蛋黄百分比（%） | 25.28 | 24.78 | 25.12 | 0.12 |
| 蛋白百分比（%） | 64.69 | 65.32 | 64.97 | 0.13 |
| 蛋壳百分比（%） | 9.98 | 9.93 | 9.92 | 0.03 |
| 蛋壳重量/表面积（mg/cm2） | 83.55 | 82.87 | 82.96 | 0.24 |
| 蛋壳厚度（mm） | 0.379 | 0.376 | 0.372 | 0.001 |
| 蛋壳抗折强度（kgf） | 5.15 | 5.01 | 5.05 | 0.03 | 0.285 |
| Haugh单位 | 80.57 | 82.27 | 80.56 | 0.41 |
| 血清钙（mg/dL） | 27.82 | 27.74 | 28.44 | 0.40 |
| 血清磷（mg/dL） | 5.92 | 5.53 | 5.56 | 0.21 |
| 血清碱性磷酸酶（U/L） | 440.13 | 43.73 | 71.05 | 3.50 |
| 相对胫骨重量（%） | 0.564 | ab | 0.583 | a | 0.520 | b |
| 0.01 |
| Seedor指数（mg/mm） | 98.98 | 100.79 | 3.18 | 1.40 | 0.065 |
| 胫骨抗折强度（kgf） | 23.11 | a | 26.93 | a | 16.57 | b | 1.140 | <0.001 |
| 胫骨钙含量（%） | 22.26 | 20.74 | 20.53 | 0.34 |
| 胫骨磷含量（%） | 8.22 | 8.47 | 8.19 | 0.14 |
| 胫骨灰分含量（%） | 58.72 | 57.77 | 57.23 | 0.32 |
| 砂囊重量（g） | 21.64 | 21.75 | 22.94 | 0.36 |
| 肾脏1α-羟化酶（U/mg） | 220.6 | a | 176.3 | b | 221.7 | a | 7.75 | 0.018 |
| a-b | 同一行内不同字母表示根据Tukey检验有显著差异（p ≤ 0.05）。SEM：均值的标准误差。 |

**表4. 66至81周龄不同细粒-粗粒石灰石比例喂养的产蛋母鸡的性能、鸡蛋质量、血液参数和骨骼质量（试验2）**

| 细粒-粗粒比率 | SE | p值 |
| --- | --- | --- |
| 50:50 | 0.10 | 0.13 |
| 30:70 | 0.13 | 0.21 |
| 饲料摄入量（g/母鸡/天） | 107.2 | b | 111.2 | a | 0.90 |
| 产蛋率（%） | 93.02 | 93.98 | 0.54 |
| 非商业鸡蛋百分比（%） | 0.69 | 0.54 | 0.11 | 0.54 |
| 饲料转化率（g/g） | 1.39 | 1.42 | 0.01 | 0.22 |
| 鸡蛋质量（g/母鸡/天） | 56.03 | 56.27 | 0.55 |
| 鸡蛋重量（g） | 60.20 | 59.76 | 0.52 |
| 蛋黄指数 | 0.41 | 0.41 | 0.00 | 0.90 |
| 蛋黄颜色 | 5.90 | 56.03 | 30.04 | 0.17 |
| 蛋黄百分比（%） | 25.84 | 26.33 | 0.13 | 0.06 |
| 蛋白百分比（%） | 64.46 | 63.91 | 0.17 | 0.12 |
| 蛋壳百分比（%） | 9.67 | 9.75 | 0.08 | 0.62 |
| 蛋壳重量/表面积（mg/cm2） | 81.15 | 81.76 | 0.61 | 0.63 |
| 蛋壳厚度（mm） | 0.36 | 0.36 | 0.00 | 0.87 |
| 蛋壳抗折强度（kgf） | 4.38 | 4.41 | 0.05 | 0.81 |
| Haugh单位 | 78.99 | 76.82 | 0.96 | 0.27 |
| 血清钙（mg/dL） | 29.92 | 29.42 | 0.32 |
| 血清磷（mg/dL） | 5.88 | 6.05 | 0.20 |
| 血清碱性磷酸酶（U/L） | 178.6 | 181.11 | 7.00 | 0.94 |
| 相对胫骨重量（%） | 0.55 | 0.57 | 0.01 | 0.39 |
| Seedor指数（mg/mm） | 94.58 | 101.82 | 2.29 | 0.11 |
| 胫骨抗折强度（kgf） | 17.50 | 21.03 | 1.82 | 0.35 |
| 胫骨钙含量（%） | 21.38 | a | 20.05 | b |
| 0.24 |
| 胫骨磷含量（%） | 8.55 | 0.84 | 0.09 |
| 0.46 |
| 胫骨灰分含量（%） | 60.37 | 57.77 | 57.23 | 0.32 |
| 砂囊重量（g） | 21.64 | 21.75 | 22.94 | 0.36 |
| 肾脏1α-羟化酶（U/mg） | 220.6 | a | 176.3 | b | 221.7 | a | 7.75 | 0.018 |
| a-b | 同一行内不同字母表示根据F检验有显著差异（p ≤ 0.05）。SEM：均值的标准误差。 |

在试验2中，石灰石颗粒大小比率对产蛋母鸡的饲料摄入量（FI）、体重增长（BWG）、饲料转化率（FCR）、产蛋率（EPR）和非商业鸡蛋百分比（%）没有显著影响（p > 0.05）。然而，喂食30:70 FL:CL比率的母鸡的砂囊重量较高（p = 0.050），而胫骨抗折强度较低（p < 0.001）。此外，喂食50:50 FL:CL比率的母鸡的肾脏CYP27B1蛋白丰度比喂食60:40和30:70比率的母鸡低约20%（表4）。

**讨论**

鉴于大约三分之二的沉积在蛋壳中的钙直接来自饮食，而剩余的三分之一是由于日间喂食和夜间蛋壳钙化之间的时间差从骨骼中动员来的（Nys等人，2022年），因此关于石灰石颗粒大小的研究对产蛋母鸡尤为重要。值得注意的是，一项包含40篇出版物中251个观察结果的荟萃分析报告称，石灰石颗粒大小或其与母鸡年龄的交互作用对鸡蛋产量或鸡蛋重量没有显著影响（Hervo等人，2022年）。作者将这些发现归因于所有纳入荟萃分析的实验中，母鸡都获得了足够的能量和营养以满足其需求。我们的发现与这些结果一致，因为在两个生产阶段都没有观察到产蛋母鸡的生产性能差异。同样，其他研究也报告称石灰石的物理形态不影响产蛋性能（?wi?tkiewicz等人，2015年；Hervo等人，2023年）。Guo和Kim（2012年）之前曾提出，饮食中的钙水平和遗传品系可能会影响鸡蛋产量。在本研究中，实验饮食被配制为完全满足母鸡的营养需求。此外，不同饮食中的钙水平没有差异，并且使用了相同的遗传品系。因此，在这些条件下，石灰石颗粒大小似乎不影响产蛋性能。尽管在早期阶段（22-41周龄）饲料摄入量没有受到影响，但在较老的母鸡（66-81周龄）中，饮食中较高的粗粒比例增加了饲料摄入量。先前的研究表明，较大的石灰石颗粒大小或钙来源的混合物可能会增加饲料摄入量，因为细磨的石灰石在砂囊中提供的机械刺激有限，可能会损害胃肠道功能（Guo和Kim，2012年；Saki等人，2019年）。此外，随着粗粒比例的增加，钙的即时可用性降低，可能导致肠道吸收减少。这种效应在较老的母鸡中尤为明显，因为它们的钙吸收效率降低。根据Gloux等人（2020年）的研究，较老的产蛋母鸡在空肠中TRPV2和TRPM7通道的表达减少，以及维生素D受体的表达减少，这限制了钙的吸收效率，从而导致饲料摄入量增加作为补偿机制。这种反应与试验2中观察到的较低胫骨钙含量一致，支持了在高粗粒比例下钙有效可用性降低的假设。需要注意的是，本研究中没有直接测量砂囊滞留时间和钙的溶解度，因此所提出的机制仍然是推论性的。然而，尽管饲料摄入量增加了，但并未观察到蛋壳特性的改善。这可能是因为本研究中使用的钙水平足以满足母鸡形成蛋壳的需求。在这些条件下，钙的供应没有限制，因此预计增加饲料摄入量不会进一步提高蛋壳质量。最近的一项使用回归模型的荟萃分析报告称，增加饮食中的石灰石颗粒大小可以改善鸡蛋的比重先前的研究与我们发现一致，表明石灰石的物理形态不会影响蛋壳质量，即使是在高龄产蛋鸡中也是如此（?wi?tkiewicz等人，2015年；Lima等人，2024年）。总体而言，这些结果表明，只要确保最低的钙摄入量以及钙的溶解度和在胃肠道中的停留时间之间的适当平衡，就可以维持蛋壳质量。因此，目前的结果应在适当的或略高的膳食钙供应、使用现代商业品种（Lohmann Brown）以及受控的实验条件下进行解读，这可能会限制其推广到其他生产系统。内部蛋质已被证明对膳食钙水平和石灰石颗粒大小不太敏感（Pizzolante等人，2009年；Cordeiro等人，2017年），这与我们的发现一致，因为用石灰石替代氟化钙并未影响蛋黄或蛋白的质量。根据Wilson和Duff（1990年）的研究，内部蛋质与鸡的生理状态和蛋的储存时间关系更为密切，而不是与饮食中的矿物质组成有关。此外，Van de Velde等人（1984年）报告称，在整个产蛋周期中，髓质骨细胞的活动调节钙的动员用于蛋壳的形成，而不直接影响内部蛋的成分。在这个背景下，目前的研究结果表明，尽管膳食中氟化钙与石灰石的比例发生了变化，但在评估期间钙的供应足以维持蛋的内部质量。

在本研究中，血液参数也没有受到膳食处理的影响，这表明在不同的石灰石颗粒大小下，矿物质稳态和成骨细胞活性得到了有效维持。这些发现与?wi?tkiewicz等人（2015年）的报告一致，他们观察到石灰石颗粒大小从0.2–0.6毫米到1.0–1.4毫米之间并未影响25至70周龄产蛋鸡的血清钙、磷或碱性磷酸酶（ALP）浓度。人们原本预计石灰石可以提高骨骼质量，因为较大的颗粒在砂囊中停留时间更长，从而更缓慢地提供钙，从而减少钙供应与生理需求之间的不同步（Bueno等人，2016年；Hervo等人，2022年）。这种延迟的钙释放被认为可以增强小肠中的钙吸收，从而减少骨骼中钙的动员需求（Wistedt等人，2019年）。然而，在本研究中并未观察到这种效果。与最初的假设相反，最高的石灰石比例（30:70）与特定的骨骼指标的负面影响相关，包括试验1中胫骨断裂强度和RTW的降低，以及试验2中胫骨钙含量的降低，尽管其他骨骼参数没有显著变化。这些发现表明，较高的石灰石比例可能会根据生产阶段的不同而对骨骼质量的各个方面产生负面影响。总体而言，骨骼状况的一般指标，如Seedor指数和胫骨灰分含量得到了维持。这些发现还表明，在较高比例的石灰石下，维持足够的钙供应以形成蛋壳与保护胫骨中的钙储备之间可能存在权衡。虽然从粗颗粒中逐渐释放钙可能支持蛋壳的钙化，但在高膳食钙供应条件下，这可能不会最佳地维持骨骼矿化。

增加石灰石的比例可能会改变钙的可用性时间模式，这对骨骼重塑来说并不理想，尤其是在钙供应已经足够或过量的情况下。在这种情况下，调节钙稳态的生理系统可能对钙释放动力学的变化反应较弱，可能导致钙在骨骼矿化中的利用不理想。与这些发现一致，Pelicia等人（2010年）报告了膳食钙水平和石灰石颗粒大小对35周龄产蛋鸡胫骨钙含量的影响，表明膳食钙浓度和石灰石比例的增加都导致了胫骨钙沉积的减少。Jardim Filho等人（2005年）也报告了石灰石粒径对骨骼矿化的影响不一。当使用石灰石来源1时，喂食较粗颗粒的鸡在53周和61周龄时表现出较高的胫骨钙含量。相反，当使用石灰石来源2时，较粗的颗粒降低了相同年龄鸡的胫骨钙含量。尽管两种石灰石的几何平均直径相似，但这些差异归因于石灰石来源的不同，导致了不同的钙溶解度和可用性。这些发现表明，石灰石的溶解度或微观结构特征的不同可能会影响钙的可用性，即较粗的颗粒并不一定意味着更好的骨骼矿化沉积。

评估不同石灰石颗粒比例对肾脏CYP27B1蛋白丰度的影响是本研究的一个新颖贡献。血浆钙浓度通过涉及甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）和维生素D?的反馈机制在狭窄的生理范围内受到严格调控，这些机制协调小肠、骨骼和肾脏之间的钙流动（Pizauro Junior等人，2017年）。在禽类肾脏中，CYP27B1酶催化将无活性的维生素D?形式（25-羟基胆钙化醇）转化为具有激素活性的形式（1α,25-二羟基胆钙化醇）（Nys等人，2022年）。活性维生素D?通过基因组和非基因组机制增强肠道钙吸收，在钙稳态中起关键作用（Pizauro Junior等人，2017年）。当血浆钙浓度下降时，钙感应受体会刺激PTH的合成。PTH反过来激活肾脏中的CYP27B1，增加活性维生素D?的产生，从而增强肠道钙吸收。一旦血浆钙浓度恢复，PTH的表达通过负反馈下调，维持稳态（Pizauro Junior等人，2017年）。在本研究中，喂食50:50氟化钙与石灰石比例的鸡表现出较低的肾脏CYP27B1蛋白丰度，而喂食60:40或30:70比例的鸡则没有这种差异，表明维生素D?代谢的激活减少。这一发现表明，中间比例可能提供更平衡和持续的钙供应，减少钙可用性的波动，从而减少对维生素D?激活的生理需求。这一反应与在50:50比例下未观察到骨骼指标的负面影响一致，而在30:70比例下则观察到了胫骨断裂强度和胫骨钙含量的降低。这些发现共同支持这样的解释：50:50比例与更稳定的钙稳态一致，减少了维生素D?激活的生理需求，同时保持了骨骼的完整性。这表明50:50的氟化钙与石灰石比例可能在高膳食钙条件下提供更生理平衡的钙释放曲线，从而减少PTH–维生素D调节轴的刺激。这种模式还表明，较高比例的氟化钙或石灰石可能导致钙可用性的不同步，无论是由于快速钙释放（细颗粒）还是延迟钙释放（粗颗粒），从而增加了对CYP27B1介导的调节的生理需求。这种U形反应表明，存在一种控制钙稳态的生物调节机制，在钙供应不足或过量的情况下，这种机制可能会刺激PTH–维生素D轴的补偿性激活。

总之，在本研究的条件下，当膳食钙水平超过当前推荐值时，氟化钙与石灰石的比例并未影响产蛋性能、血液参数或蛋的内部和外部质量。蛋壳特征没有显著影响可能与其提供的足够钙供应有关，这可能掩盖了石灰石颗粒大小的潜在影响。因此，在钙供应不受限制的情况下，增加石灰石的比例并不一定会改善蛋壳质量。然而，在生产早期阶段，较高比例的粗石灰石（30:70氟化钙与石灰石）降低了胫骨断裂强度和RTW，在后期阶段降低了胫骨钙含量，表明对某些骨骼特征有轻微但不利的影响。此外，中间的50:50氟化钙与石灰石比例与较低的肾脏CYP27B1蛋白丰度相关，这与更稳定的钙稳态和对维生素D激活的需求减少一致，尽管这种解释基于间接证据。总体而言，在膳食钙充足或超过当前推荐值的情况下，改变氟化钙与石灰石的比例并不会改善蛋壳质量，并且在较高比例的石灰石下可能会对特定骨骼参数产生负面影响。未来的研究应在钙供应不足的情况下评估氟化钙与石灰石的比例，并包括直接测量钙的溶解度和在砂囊中的停留时间，以更好地确定最佳的粒径策略。

**CRediT作者贡献声明：**
Heloisa Pagnussatt：概念化；数据管理；研究；可视化；撰写 - 原始草稿。
Carlos Henrique de Oliveira：研究；撰写 - 审稿与编辑。
Jean Kaique Valentim：数据管理；监督；可视化；撰写 - 原始草稿。
Ricardo Vianna Nunes：撰写 - 审稿与编辑。
Fernando de Castro Tavernari：概念化；方法学。
Giovanna Lima Vieira：研究；数据管理。
Beatriz Alvarez de Honório：研究；数据管理。
Arele Arlindo Calderano：概念化；形式分析；资金获取；方法学；项目管理；监督；撰写 - 审稿与编辑。

**数据可用性声明：**
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**AI技术使用声明：**
作者声明未使用任何AI技术来制作本手稿。

**未引用的参考文献：**
Pelicía等人，2011年

**CRediT作者贡献声明：**
Heloísa Pagnussatt：撰写 – 原始草稿，可视化，研究，数据管理，概念化。
Carlos Henrique de Oliveira：撰写 – 审稿与编辑，研究。
Jean Kaique Valentim：撰写 – 原始草稿，可视化，监督，数据管理。
Ricardo Vianna Nunes：撰写 – 审稿与编辑。
Fernando de Castro Tavernari：方法学，概念化。
Giovanna Lima Vieira：研究，数据管理。
Beatriz Alvarez de Honório：研究，数据管理。
Arele Arlindo Calderano：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，方法学，资金获取，形式分析，概念化。