在添加植酸酶的情况下重新评估肉鸡对锰的需求

《Poultry Science》：Reevaluating Manganese requirements of broiler chickens under phytase supplementation

　　W.E. Altevogt | S.L. Vieira | D.D.B. Maria | R.M. Horn | Y.J. Olabarriaga | L.A. Cunha
南里奥格兰德联邦大学动物科学系，Av. Bento Gon?alves, 7712, Porto Alegre, RS, 巴西, 91540-000

**摘要**
锰（Mn）通常被添加到肉鸡日粮中，以防止缺乏并维持最佳性能，而植酸酶被认为可以增强玉米-大豆粕（SBM）饲料中微量矿物质的可用性。本研究评估了在不同日粮中添加不同水平锰的效果，这些日粮中有的含有植酸酶，有的不含植酸酶。共有640只1日龄的Cobb × Cobb 500雄性雏鸡被分配到2×5因子设计实验中（是否含有植酸酶×五种不同水平的锰）。雏鸡被安置在80个笼子里，每个笼子有8只雏鸡。从放置到第7天，所有雏鸡都摄入不含植酸酶的缺锰日粮（分析锰含量为14.58 ± 0.74 mg/kg）。从第7天到第28天，雏鸡被喂食含有植酸酶（4,000 FYT/kg，分析值为4,680 ± 420 FYT/kg）的玉米-SBM日粮，并添加MnSO?·H?O形式的锰，以达到19.64 ± 1.5、44.08 ± 0.67、73.80 ± 1.26、105.08 ± 2.76和129.97 ± 1.59 mg/kg的分析锰含量。未检测到植酸酶和锰之间的交互作用（P > 0.05）。植酸酶显著提高了生长性能、干物质和锰的保留率（P < 0.001），以及表观代谢能（AME）（P < 0.05）。在第28天时，增加日粮中的锰含量对生长性能、运动参数或胫骨形态没有影响（P > 0.05），而锰的排泄量和保留量随着日粮中锰含量的增加而线性增加（P < 0.001）。胫骨和肝脏中的组织锰浓度以及心脏中的锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性呈二次方关系，估计的最大值分别为124.2、180.6和105.8 mg/kg（P < 0.05）。这些结果表明，当前商业肉鸡日粮中的锰补充实践可能超过了当生长性能为主要评价标准时的需求。与其它微量矿物质的研究结果一致，植酸酶带来的改善是显著的。然而，Mn-SOD的反应表明，支持抗氧化防御和减轻氧化应激所需的日粮锰含量可能高于优化传统性能指标所需的含量。

**引言**
锰（Mn）在动物代谢中起着重要作用。McHargue（1926）首次证明锰对大鼠是必需的，其他研究者也发现雏鸡（Wilgus等人，1936年）和猪（Miller等人，1940年；Greenberg等人，1943年）缺乏锰。锰的主要功能是作为多种酶的辅因子，包括线粒体超氧化物歧化酶（MnSOD）、丙酮酸羧化酶和精氨酸酶，这些酶参与抗氧化防御、能量代谢和蛋白多糖合成（Suttle，2010年；Tufarelli等人，2017年）。雏鸡在肝脏、肾脏和骨骼中储存大量锰（Carvalho等人，2021年）。肉鸡缺锰主要表现为骨骼异常，这是由于依赖锰的酶活性受损，导致蛋白多糖合成减少和软骨及骨骼形成受损（Luo等人，1992年；Lu等人，2006年）。这种情况被称为骨软化症，其特征是关节变形和肌腱移位（Wilgus等人，1936年）。缺锰还会导致生产性能下降和抗氧化系统受损（Lu等人，2006年；Carvalho等人，2021年）。另一方面，过量摄入锰会导致毒性、生长减缓以及粪便中锰排泄量增加，从而增加环境中的锰负荷（Oberleas，1999年；Tufarelli，2017年）。然而，只有当饲料中锰含量异常高（1,500 mg/kg或更高）时才会出现锰毒性（Miles等人，2003年；Sunder等人，2006年）。目前关于肉鸡微量矿物质补充的商业建议差异很大。例如，NRC（1994年）、Rostagno等人（2024年）、Cobb（2024年）和Aviagen（2022年）建议的锰含量分别为60、70、100和120 mg/kg饲料。由于实验因素（如评估标准、饲料组成以及肉鸡遗传差异），营养研究中的需求可能会有所不同（Sakomura和Rostagno，2007年）。然而，关于在含有植酸酶的情况下评估代谢反应和生长的锰需求的研究很少。在禽类营养中，硫酸锰一水合物（MnSO?·H?O）因其低成本和合理的生物利用率而被广泛使用（NRC，1994年）。

植酸酶的添加在动物饲料中已被广泛采用，主要是为了提高与植酸结合的磷（P）和钙（Ca）的可用性。然而，最近的研究表明，植酸酶还可以提高铁（Fe）（Feijo等人，2023年）、锌（Zn）（Maria等人，2024年）和铜（Cu）（Soster等人，2023年）等金属阳离子的利用率。当前锰补充建议的广泛差异以及忽视植酸酶对微量矿物质可用性的积极作用，强调了重新评估含植酸酶饲料中微量矿物质需求的必要性。此外，降低生产成本和减少环境废物积累的需求也加强了这一观点。本研究的目的是使用玉米-大豆饲料和分级增加锰含量来评估肉鸡的锰需求。植酸酶被过量添加到饲料中，以使植酸能够被充分快速地降解，从而释放出最多的微量矿物质。评估基于生产性能和其他对锰特别敏感的指标。

**材料与方法**
本研究中使用的所有程序均得到了南里奥格兰德联邦大学伦理和研究委员会的批准。

**鸟类饲养和日粮处理**
共有640只1日龄的Cobb × Cobb 500雄性雏鸡被随机分配到80个0.9 × 0.4 m2的铁丝笼中。每个笼子配备了一个食槽和一个饮水器，并提供自由饮水和粉状饲料。放置时的温度为32°C，整个研究期间每天调整以保持雏鸡的舒适度。第一周提供24小时连续光照，之后改为16:8的光照-黑暗周期，直到实验结束。雏鸡在前7天被喂食普通的缺锰日粮（总锰含量为14.58 ± 0.74 mg/kg，见表1）。第8天，雏鸡被随机分配到含有或不含植酸酶的2×5因子日粮组中，每组含有五个不同水平的锰补充量。每种处理重复8次，共10组，每组8只雏鸡。日粮按照商业配方中的能量和营养成分配制，以优化生长性能。第一周日粮的能量和营养成分分别为2,975 kcal/kg AME和23% CP；实验阶段为3,000 kcal/kg AME、22% CP、1.10% 可利用磷（P）和0.41% 可消化磷（P）。

**表1. 含有植酸酶和分级增加锰的日粮的成分和营养成分**
| 成分 | 千克/吨 | 缺锰日粮（1-7天） | 实验日粮（8-28天） |
| --- | --- | --- | --- |
| 玉米 | 7.8% | 65.29 | 51.97 |
| 大豆粕 | 45% | 5.38 | 37.68 |
| 大豆蛋白浓缩物 | 66% | 23.20 | - |
| 大豆油 | 0.54 | 4.15 | - |
| 碳酸钙 | 12.70 | 2.15 | - |
| 磷酸 | 85% | 1.50 | 1.34 |
| 普通盐 | 0.40 | 0.54 | - |
| DL-甲硫氨酸 | 0.28 | 0.34 | - |
| L-赖氨酸 | 0.15 | 0.24 | - |
| L-苏氨酸 | 0.07 | 0.11 | - |
| 胆碱氯化物 | 0.28 | 0.23 | - |
| 维生素和矿物质混合物 | 20.25 | 0.25 | - |
| Celite | 3-1.00 | - | - |
| 总计 | 100.00 | 100.00 | - |

**计算营养成分（%）**
| 成分 | 除非另有说明 | 缺锰日粮（1-7天） | 实验日粮（8-28天） |
| --- | --- | --- | --- |
| AMEn（千卡/千克） | 2,975 | 3,000 | |
| CP（%） | 23.0 (23.3 ± 0.78) | 21.7 (22.02 ± 0.43) | |
| 钙 | 1.10 (1.09 ± 0.02) | 0.90 (1.02 ± 0.03) | |
| 可利用磷 | 0.50 | 0.45 | |
| 可消化磷 | 0.44 | 0.41 | |
| 总磷 | 0.63 (0.64 ± 0.03) | 0.67 (0.68 ± 0.02) | |
| 总植酸 | 50.23 | 0.22 | |
| 钠 | 0.18 | 0.23 | |
| 胆碱（毫克/千克） | 2,500 | 2,500 | |
| 氨基酸（毫克/千克） | 2,500 | 2,500 | |

**注：**
1. 表1中的数据为日粮成分和营养成分的计算值。
2. 植酸酶添加量为7-4,000 FYT/kg（分析值为4,680 ± 420 FYT/kg）。
3. 碳酸钙和磷酸为实验室级，保证不含其他矿物质。
4. 每千克饲料中的营养成分：维生素A 12,000 IU；维生素D 3,000 IU；维生素C 50 mg；维生素E 100 IU；维生素K 3,6 mg；维生素B12 35 μg；硫胺素 3 mg；核黄素 15 mg；维生素B6 6 mg；烟酸 40 mg；泛酸 25 mg；叶酸 4 mg；生物素 0.3 mg；锌 100 mg；铜 15 mg；铁 40 mg；硒 0.45 mg；碘 2 mg。
5. 植酸值使用NIRS分析，考虑玉米中的0.18%、大豆粕中的0.38%和大豆蛋白浓缩物中的0.45%，并根据日粮成分进行比例调整。
6. 配制的锰含量分别为17.48、47.48、77.48、107.48和137.48 mg/kg；含植酸酶和不含植酸酶的日粮中分析的锰含量分别为19.64 ± 1.5、44.08 ± 0.67、73.80 ± 1.26、105.08 ± 2.76、129.97 ± 1.59 mg/kg。
7. 使用的植酸酶产品为HiPhorius 40,000 FYT/g（诺维信公司，丹麦）。
8. 日粮配方旨在在第一周内尽量减少总锰含量，同时保持与商业饲料一致的营养成分。第8天至第28天，实验日粮中的锰仅来自玉米和大豆粕。
9. 在一半的实验日粮中添加了商业植酸酶（HiPhorius；40,000 FYT/g；诺维信公司，丹麦），剂量为100 g/吨饲料，以提供4,000 FYT/kg（分析值为4,680 ± 420 FYT/kg）。该剂量高于标准商业推荐值（1,000 FYT/kg），以促进玉米-大豆粕基日粮中植酸的快速降解。植酸酶的添加不计入钙或磷的成分中，并通过1千克预混料与研磨的大豆粕混合。
10. 实验日粮中添加了实验室级硫酸锰一水合物（MnSO?·H?O），以达到0、30、60、90和120 mg/kg的补充水平。与耗尽日粮一样，碳酸钙和磷酸也为实验室级，以减少锰的贡献。
11. 实验日粮中分析的植酸酶活性范围为4,015至4,457 FYT/kg。含植酸酶和不含植酸酶的日粮中分析的锰含量分别为19.64 ± 1.5、44.08 ± 0.67、73.80 ± 1.26、105.08 ± 2.76和129.97 ± 1.59 mg/kg。Celite（Celite公司，Lompoc，CA）作为不可消化标记物添加了1%。日粮的平均几何直径为1.118 μm ± 1.72。植酸酶活性以FYT单位表示，对应于在pH 5.5和37°C下5.0 mM磷酸钠每分钟释放1 μmol无机磷酸。

**生长性能、总排泄物和回肠内容物**
生长性能基于体重增重（BWG）、饲料摄入量（FI）和饲料转化率（FCR）进行评估，同时校正了死亡雏鸡的重量。第24至27天每天两次收集排泄物，按笼子汇总，混合后储存于-20°C。第28天，通过电击（45 V持续3秒）对雏鸡实施安乐死，并从梅克尔憩室到回盲部附近约2厘米的肠段收集回肠内容物。内容物用蒸馏水冲洗后放入塑料容器中，按笼子汇总，快速冷冻在液氮中，然后储存于-20°C待分析。样品随后进行冻干（Christ Alpha 2-4 LD Freeze Dryer，Newtown，英国），并将饲料和干燥的回肠内容物通过实验室研磨机（Tecnal TE-631/2，圣保罗，巴西）研磨至通过0.5毫米筛子。

**分析与计算**
回肠内容物、排泄物和饲料样品使用苯甲酸作为标准物的量热计（IKA Werke，Parr Instruments，Staufen，德国）进行总能量（GE）分析。随后计算了回肠可消化能量（IDE）和表观代谢能（AME）。粗蛋白（CP，N × 6.25）通过燃烧法测定（方法968.06；AOAC International，2016）。酸不溶性灰分、回肠样品和排泄物按照Vogtmann等人（1975年）和Choct及Annison（1992年）的方法测定。表观回肠消化率、总肠段保留率和AME使用Kong和Adeola（2014年）的公式计算：
- 消化率（%）= [1 - (Mi / Mo) × (Eo / Ei)] × 100
- IDE和AME（千卡/千克）= GEi - [GE × (Mi / Mo)]
其中，Mi表示日粮中酸不溶性灰分的浓度（克/千克干物质）；Mo表示排泄物和回肠内容物中酸不溶性灰分的浓度（克/千克干物质）；Ei表示日粮、PB、GE、Mn的浓度（克/千克干物质）；Eo表示排泄物和回肠内容物中DM、PB、GE、Mn的浓度（克/千克干物质）。锰的保留率（Zhang等人，2018年）按以下公式计算：
镁保留率（毫克/只）= [饲料摄入量（克/只）× 饲料中锰含量（毫克/千克） - [粪便排出量（克/只）× 粪便中锰含量（毫克/千克）]。本研究中对锰（Mn）的所有分析均采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（5800 ICP-OES，Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行，该方法符合美国官方分析化学家协会（AOAC）的规定（方法968.08；AOAC，2016年）。

**运动参数和胫骨评估**
在14天和28天时，对所有处于解剖位置的鸟类的胫骨-跖关节处的外翻、内翻以及胫骨旋转偏差进行了评估，由三个独立小组进行评分，根据是否存在每种偏差对其进行分类。外翻偏差表现为胫骨向外角度偏移，而内翻偏差则为向内角度偏移。胫骨旋转超过90°被视为异常，表明胫跗关节发生扭转，导致跖骨向外侧偏移，形成马蹄状腿型。评分结果按照Santiago等人（2020年）描述的方法进行了平均处理，以便进行统计分析。

**步态评分**
步态评分在实验的第14天和第28天进行，采用Garner等人（2002年）描述的方法，该方法将肉鸡的运动能力从0（正常行走）到5（无法行走）进行分级。三名经过培训的评估人员在不了解处理组的情况下，独立地对肉鸡在一米直线路径上的运动情况进行评分。

**样本采集与分析**
所有鸟类的左侧胫骨被收集，并移除周围的肌肉组织后冷冻以待分析。胫骨的抗断裂强度使用纹理分析仪（TA.XTPlus，Texture Technologies，美国马萨诸塞州汉密尔顿）进行测定，方法依据Shim等人（2012年）提出的方案。胫骨的形态测量使用千分尺（Model IP65，Mitutoyo Corp.，日本川崎）进行，测量长度、骨干部分、尾区和颅区数据，这些数值用于统计分析（Maria，2024年）。随后对胫骨进行脱脂并灰化，以分析其中的锰含量。

**组织采样与分析**
所有鸟类的肝脏在28天时被采集并立即称重，然后储存在塑料袋中，置于-20°C条件下保存。肝脏样本经过冻干处理（Christ Alpha 1-8 LD Freeze Dryer，英国纽敦），随后灰化并分析其中的锰含量。此外，还使用乙醚对部分肝脏样本进行脱脂以测定脂肪含量。

**心脏样本分析**
心脏样本在PBS缓冲液（pH 7.4）中通过超声处理进行匀浆，然后在4°C下以4,000 rpm离心3分钟后收集上清液。上清液中的MnSOD活性使用Chicken Superoxide Dismutase 2（线粒体型）ELISA试剂盒（参考编号MBS742418，My Bio Source，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行检测。上清液中的蛋白质浓度使用Bradford法测定，以BSA作为标准品。MnSOD活性以ng/mg蛋白质表示。

**统计分析**
在统计分析之前，首先对数据的同方差性和正态性进行了检验（Shapiro和Wilk，1965年）。对于非正态分布的数据，经过反正弦变换后进行分析，但表中呈现的是实际均值。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）来检测自变量（植酸酶和饲料中的锰）对因变量的影响。分析使用SAS软件（SAS，2012版）的GLM程序进行，显著性标准为P ≤ 0.05。当模型效应显著时，使用Tukey多重范围检验进行均值分离（Tukey，1991年）。对总饲料中锰的最大响应值使用线性回归和二次回归模型进行估算。

**结果与讨论**
配制的饲料被认为适合实验目的，因为检测到的植酸酶和锰含量与预期配方非常接近。植酸酶活性平均为4,680 ± 420 FTY/kg，而检测到的锰浓度随着配方的增加而升高，分别为19.64 ± 1.5、44.08 ± 0.67、73.80 ± 1.26、105.08 ± 2.76和129.97 ± 1.59 mg/kg（表1）。在整个研究过程中，植酸酶和锰之间未观察到交互作用；因此，结果和讨论基于主要效应进行呈现。先前已有研究表明，植酸酶对铜（Soster等人，2023年）、铁（Feijo等人，2023年）和锌（Maria等人，2024年）等金属阳离子的膳食水平没有交互作用。

在本研究中，添加植酸酶后，8至28天龄期间肉鸡的体重增长（BWG）和饲料转化率（FCR）显著提高（P < 0.05）（表2）。这些积极效果强调了植酸酶在降解植酸方面的作用，因为植酸已被证明会限制微量元素的利用（Soster等人，2023年；Feijo等人，2023年；Maria等人，2024年）。然而，由于植酸酶是在不考虑饲料中这些营养素基础值的情况下添加的，因此本研究未预期到钙（Ca）和磷（P）的利用率会有所改善。另一方面，增加饲料中的锰并未对肉鸡的活体表现产生显著影响（P > 0.05）。

**结论**
虽然添加植酸酶和逐渐增加的锰含量对某些指标有积极影响，但总体而言，这些效果并不显著。此外，植酸酶对金属阳离子膳食水平的交互作用也未被观察到。研究结果表明，心脏中的MnSOD对饮食中锰（Mn）的敏感性在饲料中锰含量为105.8毫克/千克时达到最大响应。这种行为与该酶的生理机制一致，因为该酶的活性直接依赖于锰作为辅因子的参与。因此，与生长和运动反应缺乏响应不同，似乎需要增加饮食中的锰含量来支持心脏线粒体的抗氧化保护作用。然而，目前的研究未能检测到这种影响的商业意义。

表7. 28天时肝脏中锰的含量及心脏组织中MnSOD的活性。

| 项目 | 肝脏 | 心脏 |
|------------|-----------|-----------|
| 重量（克） | 39.2 | 31.7 |
| 锰含量（毫克/千克） | 7.1 | 40.4 |
| 脂肪百分比 | 2.3 | 5.5 |
| MnSOD活性（ng/mg蛋白质） | 210.52 | 107.52 |
| 植酸酶活性（FYT/kg） | 38.9 | 8.6 |

28天时肝脏和心脏中锰含量的回归分析：
- 肝脏中锰含量：Y = 5.183 + 0.02013x - 0.000055722x2，R2 = 0.773，P < 0.0001；
- 心脏中MnSOD活性：Y = 10.19649230 + 0.31432684x - 0.00148597×2，R2 = 0.1377，P < 0.0183；
- x = 饲料中的锰含量。

所使用的植酸酶产品为HiPhorius 40,000 FYT/g，来自丹麦Bagsvaerd的Novozymes A/S公司。
配方中的锰含量分别为：17.48、47.48、77.48、107.48和137.48毫克/千克；分析了添加和未添加植酸酶的饲料中的锰含量，结果分别为：19.64 ± 1.5、44.08 ± 0.67、73.80 ± 1.26、105.08 ± 2.76、129.97 ± 1.59毫克/千克。

本研究的结果表明，在玉米-大豆粕饲料中添加锰并不能提高肉鸡的生产性能或骨骼健康状况。然而，心脏中的MnSOD活性对饮食中锰含量的增加有积极反应，这表明酶学和代谢功能可能是比传统生产性能指标更敏感的锰充足性指标。考虑到在高锰摄入水平下锰的保留效率较低，补充策略应旨在平衡生理需求与过量摄入，避免过量摄入带来的生产效益损失以及可能的环境污染。这些发现强调了在评估锰需求时考虑MnSOD和其他依赖锰的酶学反应的重要性。进一步的研究应通过多种组织来研究这些生物标志物，以提供更准确的饮食建议。

未引用的参考文献：Adeola和Cowieson，2011年

作者贡献声明：
W.E. Altevogt：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、监督、项目管理、方法学设计、实验设计、数据分析；
S.L. Vieira：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、资源协调、资金筹集、概念构思；
D.D.B. Maria：撰写 – 审稿与编辑、数据验证、实验设计、数据分析；
R.M. Horn：撰写 – 审稿与编辑、数据验证、实验设计、数据分析；
Y.J. Olabarriaga：撰写 – 审稿与编辑、数据验证、实验设计、数据分析；
L.A. Cunha：撰写 – 审稿与编辑、数据验证、实验设计、数据分析。