用于糖尿病诊断的血液采集系统的分析前特性比较

《Practical Laboratory Medicine》：Comparison of pre-analytical properties of blood collection systems for the diagnosis of diabetes mellitus

　　朱莉安·弗林特（Juliane Flindt）| 迈克尔·拉齐维茨（Michael Radziewitz）| 安德烈亚斯·穆勒（Andreas Müller）| 索菲·哈纳克（Sofie Harnack）| 安特耶·施瓦茨（Antje Schwarz）
西梅克伦堡MVZ实验室，实验室医学系，Ellerried 7，19061，施韦林，德国

**摘要**
血液样本的适当预分析处理对于可靠的葡萄糖测量以及糖尿病的准确诊断和监测至关重要。本研究旨在比较血清、肝素锂（Li-Heparin）、氟化钠柠檬酸盐（NaF-Citrate）和氟化钠（NaF）血浆中的葡萄糖浓度。

**方法**
从45名健康志愿者中收集血液样本，分别放入肝素锂、氟化钠柠檬酸盐和血清管中。血清在室温（RT）下储存最多30分钟，肝素锂全血在冰水混合物中储存，氟化钠柠檬酸盐和肝素锂全血在室温下储存最多10分钟。使用Cobas 8000 c701分析仪测量葡萄糖浓度。此外，还分析了2015年从使用氟化钠管改为使用氟化钠柠檬酸盐管后的内部常规实验室数据（n > 85,000）。

**结果**
与两种参考条件相比，氟化钠柠檬酸盐血浆显示出最高的正偏差，高达3.11%。室温下的肝素锂血浆比冰上肝素锂血浆高1.17%。血清葡萄糖与冰上肝素锂血浆无显著差异。在常规数据中，2016年引入氟化钠柠檬酸盐管后，测得的葡萄糖浓度平均增加了10.5%。

**结论**
血液采集后30分钟内测得的氟化钠柠檬酸盐血浆和肝素锂血浆（冰上或室温）中的葡萄糖浓度不可比较。根据ADA和WHO的诊断标准，改用氟化钠柠檬酸盐管后，空腹血糖受损患者的比例增加了16.9%，糖耐量受损患者的比例增加了8.8%。当无法确保立即离心和血浆分离时，建议使用氟化钠柠檬酸盐管。

**1. 引言**
血液样本的正确预分析处理对于可靠的葡萄糖测量以及糖尿病的诊断和监测至关重要。血液样本采集后，会发生体外糖酵解，这可能导致血糖浓度在1小时内下降5-7% [1]。2023年4月，德国联邦医学协会首次要求仅使用具有适当糖酵解抑制作用的血液采集管来测量血浆葡萄糖水平，并宣布血清不适合用于此目的 [2]。十多年来，德国糖尿病协会（DDG）[3]、美国糖尿病协会（ADA）和临床生物化学国家学院（NACB）[4]一直强调，含有氟化钠柠檬酸盐（NaF-Citrate）的血液采集系统对于糖尿病的诊断是必要的。不建议使用含有氟化钠（NaF）的血液采集系统，因为NaF在血液采集后3-4小时内无法完全抑制糖酵解，从而导致血浆葡萄糖值偏低 [1]。为了完全抑制体外糖酵解，应使用含有氟化钠柠檬酸盐添加剂的血液采集管。柠檬酸盐的添加会将血液样本的pH值降至5.3-5.9，从而使己糖激酶和磷酸果糖激酶无法正常工作，从而立即抑制血细胞中的糖酵解 [5]。或者，如果能在血液采集后15分钟内进行血浆分离，也可以使用不含糖酵解抑制剂的全血 [2,6]。ADA和美国临床化学协会（AACC）建议将全血样本在冰水混合物中储存15至30分钟，然后进行离心作为糖酵解抑制的替代方法 [7]。糖尿病协会推荐多种预分析措施来抑制糖酵解，并采用相同的评估标准进行糖尿病诊断。然而，在实际操作中，既无法立即离心全血样本，也无法将其在冰水混合物中储存最多30分钟后再进行离心和血浆分离，因此使用含有氟化钠柠檬酸盐的血液采集管更为合适。问题在于，不同预分析条件下的葡萄糖浓度及其糖酵解抑制效果是否具有可比性。如果不可比，这些不同条件是否会导致结果评估和解释的差异。由于每个测量结果都可能具有治疗意义，因此这个问题对患者来说非常重要。本研究的目的是探讨这些不同预分析条件对血浆葡萄糖测量的影响。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究程序**
这项比较研究由西梅克伦堡MVZ实验室完成。从45名非空腹健康受试者（16名男性和29名女性，年龄在22至59岁之间）的上肢通过静脉穿刺采集了三份血液样本，每次采集时间不超过30秒。受试者来自实验室工作人员，并签署了书面知情同意书。血液按以下顺序分别放入三种不同的血液采集管中：
1. 血清S-Monovette管，7.5毫升（Sarstedt 01.1601）
2. 肝素锂S-Monovette管，7.5毫升（Sarstedt 01.1604.001）
3. GlucoEXACT S-Monovette管，含氟化钠柠檬酸盐+ EDTA，3.1毫升（Sarstedt 05.1074.001）
根据制造商说明，立即旋转氟化钠柠檬酸盐管三次，然后在室温下储存10分钟后再进行离心。采集后立即从每支肝素锂管中取2毫升全血，移入二次管（Sarstedt, REF 55.475），并在冰水混合物中储存30分钟（肝素锂冰），随后离心并分离血浆（图1）。剩余的全血留在肝素锂管中，与氟化钠柠檬酸盐管一起在血液采集后10分钟内以2900×g离心（离心机：Rotofix 32a，Hettich）。血清管在室温下储存30分钟后再进行离心。离心后，将肝素锂、氟化钠柠檬酸盐血浆和血清移入二次管中，样品在-20°C下储存最多50天直至分析。使用罗氏公司的Cobas 8000 c701分析仪（GLUC3，参考编号05168791190）通过己糖激酶反应测量样品中的葡萄糖浓度（内部质量控制品的CV ≤1.25%）。在本研究中，同一受试者的所有样本类型都在同一批次中进行分析。所有三个批次的测量结果均使用同一批试剂进行。在评估氟化钠柠檬酸盐管的测量结果时，考虑了1.16的稀释因子。根据制造商的建议，排除了7份具有黄疸、脂血和溶血血液样本。

**2.2. 内部实验室常规数据的葡萄糖浓度评估**
我们比较了实验室常规数据中的葡萄糖测量结果。将含有氟化钠（NaF，S-Monovette Fluoride/EDTA FE Sarstedt 04.1918）的样本与含有氟化钠柠檬酸盐（NaF-Citrate；GlucoEXACT，Sarstedt 05.1074.001）的样本进行了对比。分析了2014年1月至2014年12月的91150个测量值（NaF）和2016年1月至2016年12月的88032个测量值（NaF-Citrate）。仅使用来自全科医生的样本进行评估。葡萄糖浓度在血液采集当天使用罗氏公司的Cobas 8000 c701分析仪（GLUC3，参考编号05168791190）通过己糖激酶反应进行测量（内部质量控制品的CV ≤2.17%）。对于氟化钠柠檬酸盐管的结果，考虑了1.16的稀释因子。

**2.3. 统计分析**
根据材料及预分析条件对测量数据进行分组，并使用Kolmogorov-Smirnow检验检测其是否呈正态分布。由于测量数据不符合正态分布，使用配对Wilcoxon检验确定了四种不同条件对测量结果及其可比性的影响。显著性水平设定为α = 0.05。

**3. 结果**
肝素锂和氟化钠柠檬酸盐血浆以及血清中的葡萄糖浓度中位数与冰上肝素锂血浆（符合ADA指南）和室温下肝素锂血浆（符合Rili-BAEK指南）的葡萄糖浓度进行了比较。冰上肝素锂血浆和室温下肝素锂血浆的葡萄糖浓度被视为参考值（表1和图2）。氟化钠柠檬酸盐血浆中的葡萄糖浓度与参考值相比有最大的正偏差，高达3.11%，并且与冰上肝素锂血浆和室温下肝素锂血浆相比具有统计学上的显著差异。冰上肝素锂血浆和室温下肝素锂血浆之间的葡萄糖浓度也有显著差异：室温下肝素锂血浆的葡萄糖浓度比冰上肝素锂血浆高1.17%。血清中的葡萄糖浓度比参考值低4.04%，但与冰上肝素锂血浆无显著差异，而与室温下肝素锂血浆的测量值有显著差异。

**表1. 不同血液采集管中的葡萄糖血浆浓度**
| 管类型 | 葡萄糖血浆浓度 [mmol/L] 中位数 (n = 38) (95% CI) | 偏差 [%] | 冰上肝素锂 | 偏差 [%] | 室温下肝素锂 | p值 | 冰上肝素锂 | p值 | 室温下肝素锂 |
| --- | ---------------------- | -------------- | -------------- | -------------- | --------- | --------- | -------------- | --------- | -------------- |
| 氟化钠柠檬酸盐 | 5.30 (5.29 – 6.07) | 3.11 | 1.92 | <0.001 | <0.001 | | | |
| 室温下肝素锂 | 5.20 (5.08 – 5.91) | 1.17 | – | <0.001 | – | | |
| 血清 | 4.99 (4.89 – 5.70) | –2.92 | –4.04 | >0.05 | <0.001 | | |

**图2. 不同管类型中的葡萄糖浓度**
图示了中位数、四分位数范围及第5至95百分位数。标有?的表示与冰上肝素锂血浆有统计学显著差异（p < 0.001），标有***的表示与室温下肝素锂血浆有统计学显著差异（p < 0.001）。

**2016年，我们实验室将用于葡萄糖测量的试管从氟化钠改为氟化钠柠檬酸盐后，观察到氟化钠柠檬酸盐血浆中的平均葡萄糖浓度增加了10.5%（图3 A）。根据DDG指南的决策限5.6 - 6.99 mmol/l，空腹血糖受损患者的比例从26.0%增加到42.9%。糖耐量受损患者的比例（血糖水平高于7.0 mmol/l）从23.5%增加到32.3%（图3 B）[6]。**

**4. 讨论**
2015年，我们实验室决定仅使用含有氟化钠柠檬酸盐的血液管来测量血浆葡萄糖水平。将2014年（使用氟化钠管）和2016年（使用氟化钠柠檬酸盐管）的数据集进行比较，发现葡萄糖水平增加了10.5%。其他研究也观察到，在24小时后氟化钠血浆中的葡萄糖浓度下降了约10% [8,9]。引入含氟化钠柠檬酸盐的试管后，空腹血糖受损（血糖≥5.6 mmol/l）患者的比例从26.0%增加到42.9%，糖耐量受损（血糖≥7.0 mmol/l）患者的比例从23.5%增加到32.3% [6]。根据Pasqualetti和Panteghini的研究结果，预计空腹血糖水平≥5.6 mmol/l的患者比例将从25%增加到45% [10]。根据Rili-BAEK [2]和ADA指南 [7]的建议，不同的预分析条件未能同样有效地抑制体外糖酵解。本研究的数据表明，NaF-Citrate血浆中的葡萄糖浓度显著高于在室温（RT）下储存10分钟的Li-Heparin血浆、在冰水中储存30分钟的Li-Heparin血浆以及在室温下储存30分钟的血清中的葡萄糖浓度。在室温下储存的Li-Heparin血浆中的葡萄糖浓度平均值高于在冰水混合物中储存的Li-Heparin血浆中的葡萄糖浓度，这表明在冰水中储存时糖酵解的抑制作用并不完全。进一步的研究也表明，在冰水混合物中储存的Li-Heparin血浆中的糖酵解无法被完全抑制[11,12]。在van der Berg等人的研究中，样品在冰水中储存15分钟后进行离心处理以进行比较。他们分析了Li-Heparin试管在冰水中储存过程中不同时间的温度和葡萄糖浓度。浓度下降最明显的是在最初的15分钟内。此外，Li-Heparin血液在15分钟后才达到0°C的温度，这可以解释糖酵解抑制作用的延迟。另外，在冰水混合物中储存的Li-Heparin血浆中的葡萄糖浓度在120分钟内进一步下降，这一下降幅度与NaF-EDTA和NaF-Oxalate血浆中的下降幅度相当。然而，NaF-Citrate血浆中的葡萄糖浓度始终保持稳定，并且在所有时间点（30分钟、60分钟、120分钟）都与冰水中的Li-Heparin血浆有显著差异[11]。Saracevic等人的研究结果也表明，尽管在指南中这两种血浆被同等接受，但在冰水混合物中储存15分钟的Li-Heparin血浆和NaF-Citrate血浆中的葡萄糖浓度是不可比的[12]。不建议测量血清中的葡萄糖浓度，因为由于血液凝固过程，无法在血液采集后立即快速处理血清样本，因此无法及时抑制糖酵解[13,14]。这些研究数据表明，血清中的葡萄糖浓度平均低于Li-Heparin血浆（冰镇和室温）中的参考浓度，但与冰镇Li-Heparin血浆的偏差在统计上并不显著。这一观察结果支持这样的假设：在血液采集后将Li-Heparin试管放在冰水中储存最多30分钟并不能有效抑制糖酵解[11]。需要考虑这项研究结果的几个局限性。尽管葡萄糖浓度是在高度标准化的条件下测量的，但由于参与者数量较少（仅45名健康受试者），结果的有效性受到限制。此外，测量值仅涵盖了处于糖尿病判定范围内的健康患者的葡萄糖浓度。如果能够包括葡萄糖耐受性受损或葡萄糖值极端的受试者，将会有更多的参考价值。虽然批处理样本时可能会出现一些变异，但由于所有来自同一受试者的样本类型都使用相同的试剂批次在同一批次中进行分析，因此检测间的偏差很小。根据本研究的数据，如果不能保证在血液采集后立即进行离心和血浆分离，建议使用含有NaF-Citrate的血液采集管。通过对2015年我们实验室血浆葡萄糖测量系统更换（从使用NaF改为使用含有NaF-Citrate的血液采集管）后的内部数据进行评估，发现添加NaF-Citrate缓冲液后葡萄糖浓度趋于稳定。这突显了遵守糖尿病诊断严格的前分析要求的必要性[5,8,[11],[12],[13],[15]]。目前用于糖尿病诊断的评估标准是基于之前使用含有NaF的血液采集管的研究数据建立的[16]。随着前分析和血浆葡萄糖测定分析质量的提高[2]，应该重新评估和调整糖尿病诊断和治疗的判定标准。

**作者贡献声明：**
Juliane Flindt：撰写——初稿撰写、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目规划、方法学设计、数据分析、概念构建。
Michael Radziewitz：撰写——审稿与编辑、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。
Andreas Müller：方法学设计、实验研究、数据分析。
Sofie Harnack：实验研究、数据分析。
Antje Schwarz：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目规划、概念构建。