沙门氏菌肠炎亚种（Salmonella enteritidis）疫苗中新免疫原性抗原的鉴定及其保护效果特性研究

《Poultry Science》：Identification and protective efficacy characterization of novel immunogenic antigens for Salmonella enteritidis vaccines

　　赵玉英|李国辉|李宇安|李全|史慧英
中国江苏省扬州市扬州大学兽医学院，邮编225009

**摘要**
全球家禽产业因沙门氏菌肠炎血清型（S. Enteritidis）而遭受重大经济损失，这凸显了开发能够应对不断变化的病原体多样性的交叉保护性疫苗的紧迫性。采用综合疫苗学方法，我们系统筛选了具有免疫反应性的蛋白质，以识别新的亚单位疫苗候选物。八种候选蛋白，包括III型分泌系统成分（SipA、SopE2、SipB、SipC）、膜相关蛋白（TolA、TolC、LamB）和毒力因子MipA，均表现出显著的抗原性和免疫原性。进一步研究表明，SipC和TolC能够诱导平衡的Th1/Th2反应和IL-17A分泌，从而增强多方面的免疫力。调理吞噬实验表明，针对SipC和TolC的抗体显著增强了中性粒细胞对同源和异源菌株的杀伤作用。值得注意的是，针对SipC的抗体在促进中性粒细胞杀伤异源UK-1菌株方面表现出更强的效果。在挑战实验中，SipC对同源菌株提供了66.7%的保护作用，并对UK-1菌株表现出50%的交叉保护作用，因此其效果优于其他候选抗原。这两种抗原均显著降低了感染后内脏器官中的细菌负荷。本研究确定了SipC（以及在较小程度上的TolC）作为潜在的广谱亚单位疫苗抗原，为下一代家禽沙门氏菌病疫苗的开发奠定了基础。

**引言**
沙门氏菌肠炎血清型是一种主要的动物源性疾病病原体，持续威胁着全球家禽的健康和生产力（Ashraf等人，2025；Kering等人，2025；Shaji等人，2023；Tolooe等人，2025）。除了对家禽群体的影响外，S. Enteritidis还是与受污染家禽产品相关的食源性疾病的主要原因，给人类健康和经济带来了巨大负担（Crouch等人，2020；Curtiss，2024；Uribe-Diaz等人，2025）。更糟糕的是，抗生素在畜牧业和人类医疗保健中的广泛且无节制的使用加速了沙门氏菌菌株中抗菌素耐药性的快速出现和传播（Liu等人，2024；Tilahun和Efa，2026）。这一发展大大复杂化了疾病管理，突显了开发替代干预措施的关键必要性。尽管疫苗接种仍然是主要控制措施，但现有的商业减毒活疫苗针对S. Enteritidis或S. Typhimurium存在显著局限性（Siddique等人，2024）。这些局限性包括固有的生物安全问题，如潜在的毒力恢复风险，以及仅针对特定表面抗原（如O抗原和H抗原）诱导免疫力的倾向。因此，这种方法在跨不同血清型之间的交叉保护效果有限（Li等人，2025b；Mastroeni等人，2026；Shang等人，2025）。鉴于超过2600种沙门氏菌血清型的广泛多样性及其持续的流行病学演变，开发能够诱导广泛交叉保护的新疫苗已成为当务之急（Barrow，2007；Galán，2021；Mastroeni等人，2001）。亚单位疫苗因其避免了活病原体相关的风险而具有巨大潜力。然而，其开发受到难以识别能够诱导强烈且持久免疫反应的抗原的制约（Acevedo-Villanueva等人，2021；Curtiss，2024；Helmy等人，2023；Micoli和MacLennan，2020；Sáenz等人，2022）。当代的抗原发现方法利用反向疫苗学和蛋白质组学技术，识别出如PstS和VC5等候选抗原（Jiang等人，2023；Sharma等人，2023；Zheng等人，2023）。此外，针对保守结构（如大肠杆菌J5突变体）的方法已显示出诱导交叉反应的能力（Baliban等人，2025）。平台技术的进步，包括细菌幽灵和理性减毒菌株（如RAST002），旨在提高免疫原性（Halder等人，2023；Zhou等人，2025）。传统的减毒活疫苗在一定程度上减少了异源血清型在家禽中的肠道定植和系统传播（Monson等人，2024）。尽管取得了这些进展，但在系统识别和验证针对S. Enteritidis的特异性抗原以开发交叉保护性疫苗方面仍存在显著差距。大多数现有平台并非专门针对S. Enteritidis设计，且缺乏对该血清型内保守抗原的广泛实证验证。因此，利用综合方法系统识别和验证来自S. Enteritidis的保护性抗原对于开发下一代广谱家禽沙门氏菌病疫苗至关重要。

为了填补这一空白，我们将反向疫苗学与免疫蛋白质组学相结合。虽然反向疫苗学可以通过计算方法进行全基因组预测，但它可能会忽略实际感染过程中活跃的功能性表位（Albutti等人，2025；Habiba等人，2025）。免疫蛋白质组学直接分析感染后的宿主抗体反应，实证识别自然触发免疫反应的膜蛋白和分泌蛋白（Hu等人，2012；Ludolf等人，2023；Zhang等人，2025b）。将计算预测与实验免疫分析相结合，可以识别更具生物学意义的保护性抗原。通过这种综合方法，我们从S. Enteritidis中识别出八种潜在抗原：SipA、SipB、SipC、TolA、TolC、MipA、LamB和SopE2。它们的免疫原性、保护效果及相关免疫反应在体外和体内进行了系统评估。本研究有两个新颖目标：提供经过验证的抗原候选物和交叉保护性亚单位疫苗的理论支持，以及为未来的重组疫苗（包括使用减毒S. Enteritidis作为载体的疫苗）创建抗原库。因此，我们的研究将基础抗原识别与转化应用联系起来，为应对沙门氏菌血清型多样性提供了有针对性的策略。

**材料与方法**
**动物和伦理声明**
无特定病原体（SPF）鸡胚从南京生物医学工厂获得，并在实验室内培养。两个月大的新西兰白兔从上海松莲实验动物场获得。动物在标准条件下饲养，提供无限量的食物和水，并每天监测健康状况。所有动物实验方案均获得江苏省实验动物管理委员会的批准（许可号SYXK(SU) 2021-0026、SYXK(SU) 2017-0044和SYXK(SU) 2021-0027）。所有程序均在扬州大学进行，并严格遵守省级动物伦理指南和适用的国际标准。

**细菌菌株和生长条件**
大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)（Rosetta）分别用于基因克隆和蛋白质表达。目标基因被插入含有N端His标签的pET-28a(+)载体中。转染了重组质粒的细菌菌株在Lysogeny Broth（LB）或含有50 μg/mL卡那霉素的1.5%琼脂平板上培养。用于挑战实验的S. Enteritidis血清型CMCC(B)50041和CVCC3949菌株来自中国兽药控制研究所，而S. Enteritidis血清型Typhimurium菌株UK-1来自内部实验室库存。除非另有说明，所有菌株均为商业采购。

**间接ELISA**
血清抗体水平通过间接ELISA测定（Chen等人，2025）。平板在4°C下过夜包被S. Enteritidis菌株CMCC(B)50041的全细胞或分泌蛋白提取物（碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）。用5%脱脂奶封闭后，加入血清样本的系列稀释液。通过HRP结合的山羊抗兔IgG（1:5,000）进行检测，随后用TMB底物显色。反应以H?SO?终止，并在450 nm处测量光密度。如果最低稀释度的OD???比PBS阴性对照孔高2.1倍，则认为样本呈阳性。

**从S. Enteritidis中分离蛋白质**
从S. Enteritidis菌株CMCC(B)50041中提取全细胞蛋白、分泌蛋白和膜蛋白，方法略有修改（Li等人，2024）。分泌蛋白通过在4°C下用10%（v/v）三氯乙酸沉淀0.45 μm过滤的上清液后离心获得。全细胞蛋白通过将细菌沉淀重悬在PBS中、在冰上超声裂解细胞并离心澄清裂解液获得。膜蛋白使用Triton X-114相分离方法提取。简要来说，细菌悬浮液在含有2% Triton X-114的缓冲液中制备，进行温度诱导的相分离，然后从水相和洗涤剂富集相中用乙醇沉淀蛋白质。所有蛋白质制剂均使用BCA法进行定量，随后分装并在-80°C下储存以备进一步分析。

**多克隆抗体的制备和纯化**
针对S. Enteritidis全细胞或分泌蛋白的多克隆抗体在新西兰白兔中产生（每个抗原组3只，2个月大）。每只兔子初次皮下注射500 μg的抗原，混悬在Freund完全佐剂中，随后在第14天、21天和28天分别注射三次相同抗原剂量的Freund不完全佐剂。每周从边缘耳静脉采集血液样本，并通过间接ELISA评估血清抗体滴度（见第2.4节）。一旦抗体滴度超过1:12,800，收集最终血清。随后将血清通过结合缓冲液透析，并根据制造商的方案使用Protein A/G柱进行亲和纯化（Solarbio，北京，中国）。

**免疫沉淀（IP）**
免疫沉淀使用Protein A/G Plus Agarose珠（Solarbio，北京，中国）进行，略有协议调整（Li等人，2023）。简要来说，珠子先洗涤，然后与纯化的IgG孵育。经过额外的洗涤步骤后，珠子在4°C下连续旋转与S. Enteritidis蛋白片段孵育过夜。结合的抗原通过煮沸洗脱，收集的上清液通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。为了蛋白质鉴定，免疫沉淀样本在GeneCreate蛋白质组学平台（武汉，中国）进行凝胶内消化和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。

**生物信息学分析**
通过LC-MS/MS分析鉴定的蛋白质使用一系列计算机评估作为潜在疫苗候选物。首先使用VaxiJen v2.0服务器（https://www.ddg-pharmfac.net/VaxiJen/）在革兰氏阴性细菌模型下预测抗原性，得分>0.4表示具有潜在的抗原性。随后利用ExPASy服务器上的ProtParam工具计算必要的物理化学参数，包括不稳定性指数和平均疏水性（GRAVY）。此外，通过SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service/SignalP-5.0/）预测信号肽，并使用TMHMM Server v2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service/TMHMM-2.0/）鉴定跨膜螺旋。

**重组抗原的表达和纯化**
根据S. Enteritidis CMCC(B)50041基因组设计基因特异性引物，扩增SipA、SipB、SipC、TolA、TolC、MipA、LamB和SopE2基因（表1）。每个扩增子被克隆到pET-28a(+)载体中，然后转入E. coli BL21(DE3) Rosetta细胞。重组菌株在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中培养至对数中期（OD??? ≈ 0.6），此时用0.5 mM IPTG诱导4小时蛋白质表达。诱导后，细胞通过超声裂解，裂解液离心以分离可溶性蛋白和包涵体。蛋白质溶解度通过SDS-PAGE评估，His标记的蛋白根据既定方案使用Ni-NTA亲和层析纯化。

**表1. 引物信息**
| 引物名称 | 序列（5′–3′） |
|-----------------|----------------------|鸟类在感染后被观察了三周，每天记录死亡情况以计算LD??值。LD??是使用Reed-Muench方法（REED和MUENCH，1938）计算得出的。细菌挑战本研究使用了一种经过轻微修改的肌肉内挑战模型（Li等人，2022年）。最后一次免疫两周后，阳性对照组和疫苗组的鸡在胸肌内接受了含有10×LD??量的S. Enteritidis菌株CMCC(B)50041悬浮液（每只鸡8.5×101? CFU）的注射。阴性对照组的鸡接受了等体积的无菌PBS。在挑战后观察了14天，以监测临床症状和死亡率，并使用单独的群体构建了生存曲线（每组六只鸡）。在挑战后第7天，每组选取三只鸡进行安乐死，并无菌采集肝脏、脾脏和盲肠组织。组织样本（1克）在PBS中匀浆，然后进行系列稀释，并接种在添加了萘啶酸的琼脂板上。组织中的细菌负荷以log?? CFU/g表示。

淋巴细胞增殖测定在加强免疫后14天，使用CCK-8测定法评估外周血样本中的淋巴细胞增殖，该方法改编自之前的方法（Sun等人，2025年）。分离外周血单核细胞（PBMCs）使用鸡特异性试剂盒（Solarbio，北京，中国），然后接种到96孔板中（每孔2×10?个细胞）。随后用候选抗原蛋白或作为阳性的ConA刺激细胞48小时；仅使用培养基作为阴性对照。在加入10 μL CCK-8试剂（Solarbio，北京，中国）孵育2小时后，测量450 nm处的吸光度。每组的刺激指数计算如下：OD???（实验组）/ OD???（空白对照组）。

细胞因子转录本定量细胞因子mRNA转录本的定量（IFN-γ、IL-4、IL-17A）按照Zhang等人（2023年）的方法进行。PBMCs（每孔1×10?个细胞）用抗原或ConA刺激48小时。随后提取总RNA，逆转录为cDNA，并使用SYBR Green和表1中列出的引物进行qPCR分析。基因表达水平相对于β-actin进行标准化，并使用2^-ΔΔCt方法进行定量。

调理吞噬作用测定（OPA）OPA的测定按照之前的方法（Li等人，2025a）进行。简要来说，加强免疫后获得的针对SipC和TolC的抗体在PBS中过滤并连续稀释两倍。然后将这些稀释的抗体与1×10? CFU的S. Enteritidis CMCC(B)50041、CVCC3949或S. Typhimurium UK-1混合。在37°C下孵育30分钟后，加入每孔1×10?个细胞的鸡外周血中性粒细胞。在37°C下共同孵育90分钟后，从每个孔中取100 μL样品进行细菌菌落计数，然后将数据汇总。调理效价定义为与无血清对照孔相比，细菌存活率降低50%或更多的最高血清稀释度。

交叉保护效力研究为了评估交叉保护效力，一天大的SPF鸡被随机分配到阴性对照组（给予PBS-佐剂，未接受挑战）、挑战对照组（给予PBS-佐剂，并接受S. Enteritidis CVCC3949或S. Typhimurium UK-1的挑战），或亚单位疫苗组（接种SipC或TolC疫苗，随后接受相应菌株的挑战）。疫苗制备和免疫遵循“鸡免疫”部分中的协议。加强免疫两周后，鸡在肌肉内接受了10×LD??量的指示菌株（S. Enteritidis CVCC3949为1.4×101? CFU，S. Typhimurium UK-1为4.8×10? CFU）的注射，阴性对照组接受PBS注射。在挑战后第3、7、14和21天，从每个亚组中取样三只鸡。无菌采集肝脏、脾脏和盲肠组织以量化细菌负荷（以CFU/g表示，遵循“细菌挑战”部分中的方法）。对于挑战后第7天的组织病理学检查，组织样本被固定、包埋、切片，并使用标准程序（10%中性缓冲福尔马林固定，3 μm切片）进行H&E染色。所有组织标本均采用表5中概述的评分标准进行盲法评估。

所有实验至少包括三个独立重复，数据以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism中的Mann–Whitney U检验评估统计显著性，并在图中表示为：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

通过免疫沉淀鉴定免疫原性蛋白通过结合免疫蛋白质组学和反向疫苗学方法鉴定了S. Enteritidis的潜在免疫原性抗原（图1）。用提取的全细胞和分泌蛋白免疫兔子产生多克隆抗体（图2A），然后使用Protein A/G亲和层析法纯化这些抗体（图2B，C）。这些纯化的抗体分别用于免疫沉淀S. Enteritidis的膜部分和分泌组（图2D，E）。所得的免疫沉淀物经过LC-MS/MS分析，鉴定出1,069种S. Enteritidis特异性蛋白，包括232种分泌蛋白、233种膜相关蛋白和604种同时存在于两个部分的蛋白（图3A）。

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图1. Salmonella enteritidis疫苗抗原的发现和验证流程。S. Enteritidis疫苗抗原筛选流程包括：分离全细胞蛋白质组和分泌组；兔子免疫和抗体纯化以获得目标特异性多克隆抗体；免疫沉淀分泌组和膜部分；通过LC-MS/MS鉴定免疫原性蛋白；在计算机上评估候选物（抗原性、不稳定性指数、GRAVY、跨膜拓扑结构、亚细胞定位）；以及最终的免疫原性和保护效力实验评估。
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图2. S. Enteritidis的蛋白质提取、兔抗Salmonella抗体的纯化以及免疫沉淀分析。（A）对S. Enteritidis的全细胞、膜和分泌蛋白部分等体积（10 μL）进行SDS-PAGE分析。（B，C）用Protein A/G亲和层析法纯化针对全细胞或分泌蛋白产生的多克隆抗体。泳道1：未纯化的血清；泳道2：流穿液；泳道3–7：含有纯化抗体的洗脱液。（D）免疫沉淀程序的洗脱液（每泳道5 μL）进行SDS-PAGE分析。

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图3. S. Enteritidis疫苗候选物的筛选和验证。（A）免疫原性膜蛋白和分泌蛋白的质谱鉴定。（B）将八个选定的候选物克隆到pET-28a表达载体中。（C）八个纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析。（D）使用兔多克隆抗体通过Western blot确认抗原性。

候选抗原的筛选为了鉴定高质量的亚单位疫苗候选物，使用与表面暴露和强免疫原性相关的生物信息学标准筛选免疫沉淀的蛋白，特别是高抗原性、亲水性和稳定性。具有最高肽谱匹配置信度的30种蛋白在计算机上进行分析：使用VaxiJen v2.0预测抗原性（阈值>0.4），使用SignalP-5.0预测信号肽，使用TMHMM预测跨膜螺旋，使用ProtScale Kyte–Doolittle指数预测亲水性，使用ProtParam不稳定性指数预测稳定性。十七种蛋白符合所有标准（表2，3）。为了优先考虑新目标，排除了广泛研究的外膜蛋白（由于缺乏新颖性）和鞭毛蛋白（提供的保护有限）（Saxena等人，2017；Zhao，2025），最终选择了八个候选物作为进一步评估的保护性抗原。

表2. 潜在疫苗蛋白的理化性质。
GenBank ID | 蛋白质 | 分子量（kDa） | 不稳定性指数 | 脂肪族指数 | GRAVY
ALV168 | 1.1 | 40.4 | 69 | 38.2 | 87 | 2.7 | -0.6 | 15
ALV188 | 47.1 | 23.3 | 59 | 3.4 | -0.05 | 1
ALV180 | 15.1 | 30.1 | 84.3 | 4.3 | -0.36 | 3
ALV204 | 43.1 | 37.5 | 129 | 29 | 76.6 | -0.36 | 3
ALV176 | 41.1 | 39.6 | 96 | 4.5 | -0.46 | 5
ALV183 | 42.1 | 37.9 | 163.7 | 6 | -0.55 | 3
ALV174 | 63.1 | 31.1 | 22.9 | 58 | 21.1 | 27 | 4.1 | -0.02 | 3
ALV200 | 72.1 | 50.5 | 43 | 15.8 | 64.1 | -0.54 | 2
ALV170 | 89.1 | 40.1 | 106 | 15.5 | 66 | 4.8 | -0.54 | 8
ALV169 | 67.1 | 84.1 | 16.1 | 96 | 3.3 | -0.29 | 4
ALV191 | 43.1 | TolC | 53.3 | 82 | 9.2 | 38 | 6.5 | -0.43 | 4
ALV179 | 14.1 | MipA | 27.9 | 92 | 1.0 | 27 | 1.57 | -0.44 | 8
ALV172 | 30.1 | FliD | 49.9 | 51 | 58 | 38 | 5.7 | -0.40 | 9
ALV188 | 46.1 | SipC | 42.9 | 83 | 1.3 | 18 | 6.4 | -0.30 | 8
ALV180 | 14.1 | FlgL | 34.1 | 62 | 4.2 | 97 | 8.2 | -0.36 | 9
ALV188 | 44.1 | SipA | 73.9 | 73 | 1.5 | 67 | 8.5 | -0.50 | 4
ALV173 | 28.1 | SopE | 226.7 | 82 | 35.5 | 17 | 8.9 | -0.38 | 3

表3. 潜在疫苗蛋白的SPI、TMHs、抗原性和亚细胞定位。
GenBank ID | 蛋白质 | 信号肽（Sec/SPI） | TMHs | 抗原性 | 定位
ALV168 | 1.1 | TolA | 0 | 1 | 细胞内膜
ALV188 | 47.1 | SipB | 0 | 2 | 0.4 | 5 | 细胞内膜
ALV180 | 20.1 | FlgF | 0 | 0.6 | 2 | 9 | 细胞内膜
ALV204 | 43.1 | OmpA | 10 | 0.6 | 6 | 8 | 1 | 细胞外膜
ALV176 | 41.1 | OmpD | 10 | 0.6 | 9 | 9 | 细胞外膜
ALV183 | 42.1 | OmpC | 10 | 0.7 | 3 | 7 | 细胞外膜
ALV174 | 63.1 | OmpW | 10 | 0.7 | 3 | 6 | 1 | 细胞外膜
ALV200 | 72.1 | LamB | 10 | 0.7 | 32 | 7 | 细胞外膜
ALV170 | 89.1 | OmpF | 10 | 0.7 | 9 | 8 | 2 | 细胞外膜
ALV169 | 67.1 | OmpX | 11 | 0.6 | 7 | 13 | 细胞外膜
ALV191 | 43.1 | TolC | 10 | 0.5 | 3 | 1 | 细胞外膜
ALV179 | 14.1 | MipA | 10 | 0.5 | 9 | 6 | 6 | 细胞外膜
ALV172 | 30.1 | FliD | 0 | 0 | 0.6 | 6 | 1 | 细胞外
ALV188 | 46.1 | SipC | 0 | 0 | 7 | 9 | 9 | 细胞外
ALV180 | 14.1 | FlgL | 0 | 0 | 5 | 0 | 7 | 6 | 细胞外
ALV188 | 44.1 | SipA | 0 | 0 | 6 | 5 | 6 | 7 | 细胞外
ALV173 | 28.1 | SopE | 20 | 0 | 0 | 4 | 9 | 细胞外

序列保守性和重组蛋白生产分析了八种候选蛋白（SipA、SipB、SipC、TolA、TolC、MipA、LamB、SopE2）在20种Salmonella菌株中的序列保守性（表4）。其中七种蛋白表现出高保守性（>98%的氨基酸同一性），而SopE2的平均同一性较低，为67.14%。为了进行免疫学评估，每个基因都被克隆到pET-28a（+）载体中并在E. coli BL21(DE3)中表达。His标记的蛋白通过Ni-NTA层析法纯化（图3），并通过SDS-PAGE确认预期大小：SipA（约73.9 kDa），SipB（约62.4 kDa），SipC（约42.9 kDa），TolA（约40.4 kDa），TolC（约55.3 kDa），MipA（约27.9 kDa），LamB（约50.5 kDa）和SopE2（约26.7 kDa）。

表4. 不同菌株中筛选出的免疫原性蛋白的同源性。
菌株 | SipA | SipB | SipC | TolA | TolC | MipA | LamB | SopE2
LT2 | 99.9% | 100% | 100% | 99.2% | 99.6% | 100% | 100% | 66.2%
ST4 | 99.9% | 100% | 100% | 99.2% | 99.6% | 100% | 100% | 66.2%
607 | 307 | - | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 65.8%
SL13 | 44 | 99.9% | 100% | 100% | 99.2% | 99.8% | 72.2% | 99.3% | 66.2%
SD3 | 24 | 61 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 99.6% | 99.6%
P12 | 51 | 109 | 100% | 100% | 100% | 99.6% | 100% | 100% | 65.8%
NCTC 30 | 46 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 65.8%
NCTC 69 | 47 | 99.6% | 100% | 100% | 99.5% | 99.6% | 100% | 99.6% | 66.这些结果共同表明，两位候选抗原都能诱导出能够识别不同血清型中共有表位的抗体，而SipC则能引发更强的针对异源菌株的免疫反应。下载：下载高分辨率图片（316KB）下载：下载全尺寸图片图6. 杀菌实验。在外源性调理条件下，外周血中性粒细胞对细菌的杀伤作用。在接种SipC或TolC蛋白两周后，对CMCC(B)50041、CVCC3949和UK-1菌株的血清OPA滴度进行了检测。滴度通过连续2倍稀释单个血清样本来确定。误差条表示鸡之间的差异。统计分析使用Mann–Whitney U检验进行；显著性表示为***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、ns（p > 0.05）；误差条表示平均值±标准差。

SipC和TolC亚单位疫苗的交叉保护效力
在加强免疫两周后，鸡被暴露于S. Enteritidis CVCC3949或S. Typhimurium UK-1菌株，剂量为10×LD??。在同源CVCC3949感染后，SipC和TolC疫苗组的存活率均为66.7%。而在异源UK-1感染后，SipC疫苗的存活率为50%，TolC疫苗的存活率为33.3%（图7A、B）。与PBS对照组相比，这两种疫苗显著降低了肝脏、脾脏和盲肠中的细菌负荷（图7C-H）。在同源感染后的第21天，这些器官中的细菌负荷降至101-102 CFU。在异源感染后，SipC在所有器官中始终显示出较低的细菌计数，尤其是在感染高峰期（第14-21天），这表明其具有更强的控制细菌复制和传播的能力。对照组的组织病理学分析显示严重的感染诱导损伤，包括肝脏结构破坏、脾脏实质坏死以及盲肠黏膜出血和隐窝变形（图8A）。接种SipC或TolC疫苗显著减少了组织损伤，这一点通过组织病理学评分得到证实（图8B、C）。因此，SipC和TolC不仅减少了细菌定植，还减轻了感染引起的组织损伤，证实了它们作为多价沙门氏菌疫苗开发中的交叉保护抗原的潜力。

下载：下载高分辨率图片（538KB）下载：下载全尺寸图片图7. SipC或TolC亚单位疫苗对同源和异源沙门氏菌的交叉保护效力。(A, B) 在接种S. Enteritidis CVCC3949（1.4×101? CFU/鸡）或S. Typhimurium UK-1（4.8×10? CFU/鸡）两周后，以10×LD??剂量进行肌肉注射后的21天监测存活率。(C-H) 肝脏（C, D）、脾脏（E, F）和盲肠（G, H）中的细菌定植水平（log?? CFU/g）。统计分析使用Mann–Whitney U检验进行；显著性表示为***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、ns（p > 0.05）；误差条表示平均值±标准差。

下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片图8. 同源或异源沙门氏菌感染后肝脏、脾脏和盲肠的组织病理学变化。(A) 肝脏、脾脏和盲肠切片的显微镜检查（200×）。(B, C) 感染S. Enteritidis CVCC3949（B）或S. Typhimurium UK-1（C）的鸡的肝脏、脾脏和盲肠组织的组织病理学评分。注释：黑色箭头表示淋巴细胞浸润；蓝色圆圈表示坏死区域；绿色箭头表示出血。病理评分以平均值±标准差表示。统计分析使用Mann–Whitney U检验进行；显著性表示为***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、ns（p > 0.05）；误差条表示平均值±标准差。

讨论
由多种沙门氏菌血清型引起的持续威胁凸显了迫切需要能够提供广泛和交叉保护免疫力的疫苗（Chakraborty等人，2025；Uribe-Diaz, Santamaria, Hargis, Kwon, Vuong和Erf，2025；Zhu等人，2025）。尽管亚单位疫苗是活减毒疫苗的安全且明确的替代品，但其开发面临两个核心挑战：高效识别高保护性抗原以及单个抗原提供的保护范围有限（Li等人，2020；Mekonnen等人，2022；Nazir等人，2025；Zizza等人，2024）。为了解决这些挑战，本研究旨在发现具有交叉保护潜力的新抗原。通过结合免疫蛋白质组学和反向疫苗学的创新策略，我们成功地从大量候选蛋白中识别出了SipC和TolC这两种非常有前景的抗原。我们的工作不仅为疫苗开发提供了具体的候选分子，还为抗原筛选方法和交叉保护机制提供了新的见解。

一个关键的发现挑战了疫苗学中的一个长期假设：高序列保守性并不保证保护效力。MipA就是一个明显的例子，尽管其在不同菌株间的氨基酸同一性超过98%，但在体内没有提供任何保护作用。相比之下，由于具有不可或缺的生物学功能而保守的SipC和TolC却引发了强烈的跨血清型保护。SipC是III型分泌系统（T3SS）转运蛋白的核心结构成分，直接介导细菌侵入宿主细胞，而TolC是多药外排泵的重要外膜通道，对细菌在压力下的生存至关重要。它们的功能不可或缺性使其成为免疫干预的易攻击目标（Allgood等人，2025；Hester等人，2022；Lu等人，2025；Yuan等人，2023；Zhu等人，2024）。这表明，功能保守性而非单纯序列保守性是有效、广谱疫苗保护的关键决定因素，从而为未来的抗原筛选确立了重要指导原则。

观察到的交叉保护从根本上源于所诱导的免疫反应的质量和广度（Chappell等人，2009；Troha和Ayres，2022）。机制上，针对SipC和TolC的抗体显著增强了针对同源和异源菌株的调理吞噬作用。SipC抗体的更强异源杀菌活性与其更高的体内交叉保护率直接相关，突显了抗体依赖的细胞效应功能作为关键机制。此外，这两种抗原都诱导了Th1、Th2和Th17细胞的平衡细胞因子反应（IFN-γ、IL-4、IL-17A）。这种协同反应促进了细胞内细菌的清除，促进了高亲和力抗体的产生，并增强了黏膜屏障（Troha和Ayres，2022）。这种综合的体液和细胞免疫作用解释了接种疫苗后的鸡体内细菌负荷显著减少的现象。

从结构-功能的角度来看，SipC的卓越效果得到了进一步解释。T3SS在毒力因子的合成和输出中起着核心调节作用（Zhou等人，2022）。作为T3SS转运蛋白的核心孔形成单元，SipC直接负责将效应蛋白注入宿主细胞。针对SipC的抗体可能通过空间阻碍这一过程来抑制它，从而在病原体入侵的初始阶段就中和这一关键步骤（Darwin和Miller，1999；Foley等人，2013；Tolooe, Alizadeh, Blake, Doost和Sharif，2025；Zhou和Galán，2001）。同样，针对TolC会破坏底物输出的核心枢纽，可能影响细菌的解毒、毒力因子分泌和代谢平衡。SipC的更强异源保护可能源于其在多蛋白T3SS复合体中的极端结构和功能保守性（Hu等人，2022；Hussain等人，2024；Platz等人，2010）。这种保守性提供了更广泛的表面暴露的B细胞表位，这些表位可以在不同血清型中被识别。加上其刺激Th1/Th17型免疫反应的强大能力，有助于增强其保护效果。

需要认识到本研究中使用的挑战模型的局限性。肌肉注射模型主要评估的是直接血液接种后的全身感染保护。虽然该模型适用于评估疫苗诱导的对致命败血症的全身免疫，但它不能完全模拟自然口腔感染。因此，这里观察到的肌肉注射保护效果不应直接外推到自然条件下的肠道定植或粪便排毒。未来需要使用口服挑战模型来验证疫苗控制自然感染和传播的潜力。本研究支持了一种基于功能保守性的抗原发现方法。尽管单一抗原未能实现完全保护，这是亚单位策略的一个公认限制，但这一发现明确了改进的方向。未来的研究应优先绘制关键保护性表位，探索SipC和TolC与其他有前景的抗原（如LamB）的协同组合，并创新佐剂和递送平台（包括基于纳米粒子和细菌载体系统），以提高免疫反应的效力和持久性。总之，本研究提供了一种系统的抗原识别和验证流程，得到了两种具有证明的交叉保护效力的高价值候选抗原。通过将重点从单纯的序列保守性转移到基本生物功能上，这项工作为开发针对沙门氏菌和其他抗原多样性病原体的下一代疫苗提供了精细的蓝图。将这种理性筛选策略与先进的免疫原设计相结合，为实现对禽沙门氏菌和其他重要人畜共患病的高度和持久保护提供了重要前景。

结论
本研究确定了SipC和TolC作为新型亚单位疫苗抗原，能够提供针对沙门氏菌的跨血清型保护。它们的效力源于针对进化上保守且功能上必需的细菌蛋白（如T3SS和外排泵成分），建立了基于生物功能的抗原筛选策略。这两种抗原都引发了平衡的Th1/Th2/Th17反应和调理抗体。这些发现为开发广谱禽类疫苗提供了经过验证的平台和有希望的候选抗原。未来的工作应专注于表位优化和多抗原配方，以增强保护效果。

作者贡献声明
赵玉英：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
李国辉：调查。
李宇安：撰写——初稿、概念化。
李全：撰写——审稿与编辑、概念化。
史惠英：撰写——审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取。