用于改善泰国本土公鸡精液品质的基因组选择与关联分析

《Poultry Science》：Genomic selection and association analyses for improving semen traits in Thai native roosters

　　吉拉蓬·朱伊普塔（Jiraporn Juiputta）、维拉亚·通蒂亚萨瓦萨迪库尔（Veeraya Tuntiyasawasdikul）、维邦蒂塔·昌基蒂萨库尔（Vibuntita Chankitisakul）和武提格雷·布恩库姆（Wuttigrai Boonkum）
泰国孔敬大学（Khon Kaen University）农业学院动物科学系，孔敬市，40002

**摘要**
精液质量是家禽生产系统中繁殖效率的主要决定因素。在泰国本土鸡中，由于雄性与雌性的配对比例相对较低，个体公鸡的繁殖重要性增加，因此精液质量特性对于维持鸡群的生育能力至关重要。泰国本土鸡是一种重要的遗传资源，具有适应热带环境的高适应性和独特的遗传多样性，但与商业品种相比，其研究仍相对不足。因此，为了支持有效的育种计划，需要准确估计遗传参数并明确理解精液特性的遗传结构。然而，尽管这些特性很重要，但在基因组水平上对泰国本土鸡的精液质量特性的研究仍然有限，且利用基因组评估方法来改善这些特性的效果也尚未得到充分探索。本研究估计了遗传参数，描述了精液特性的遗传结构，并评估了基因组信息对预测准确性的影响。我们使用三种遗传评估模型来评估精子质量特性的预测性能：基于系谱的最佳线性无偏预测（PBLUP）、单步基因组BLUP（ssGBLUP）和加权ssGBLUP（WssGBLUP）。质量移动性、精液体积和精子浓度的遗传力估计值较低（分别为0.149、0.165和0.060），表明这些特性的加性遗传变异有限。结合基因组信息可以提高预测准确性，与PBLUP相比，ssGBLUP和WssGBLUP分别将准确性提高了5.88%和7.49%。观察到质量移动性与精子浓度之间存在强烈的正遗传相关性（0.977），这表明选择提高质量移动性可能会产生有利于精子浓度的遗传响应。此外，WssGWAS在6号、11号、19号和22号染色体上鉴定出与精子结构和代谢过程相关的14个候选基因。这些发现表明，鉴定出的基因组区域可能通过影响精子膜完整性、能量代谢和细胞调节的生物学途径来影响精液质量。我们的结果展示了基因组信息，特别是WssGBLUP方法，在改善泰国本土鸡精液质量特性方面的实用性。这些发现为可持续遗传改良计划的发展提供了生物学上的见解。

**引言**
优化繁殖效率对于满足不断增长的雏鸡需求至关重要。虽然雌雄双方都对繁殖性能有所贡献，但由于育种鸡群中雄性比例较低，公鸡的影响更为显著（Sun等人，2019年）。因此，个体公鸡的繁殖能力在决定鸡群生育能力方面起着关键作用。精液质量特性（包括精液体积、精子活动性和精子浓度）是受精率、孵化率和胚胎存活率的关键决定因素，通常被用作育种计划中的选择标准（Tesfay等人，2020年；Musa等人，2023年；Juiputta等人，2025年）。然而，基于单个精液特性的评估可能无法完全反映繁殖性能，因为这些特性之间存在生物学上的关联。先前的研究表明，多变量方法比单一特性评估更能提高繁殖力的预测准确性（Tesfay等人，2020年；Daryatmo等人，2024年）。大多数精液质量特性的遗传力较低（h2约为0.05–0.30），表明其遗传结构复杂且多基因。尽管如此，如精液体积、质量移动性和精子浓度等特性通常表现出较高的遗传力，并可能对遗传选择产生响应（Juiputta等人，2025年）。泰国本土鸡（包括Pradu Hang Dum及其相关本地品种）是重要的遗传资源，具有适应热带环境和高遗传多样性的特点（Loengbudnark等人，2023年；Tanglertpaibul等人，2024年）。尽管它们很重要，但这些群体的遗传改良计划主要基于表型选择和基于系谱的最佳线性无偏预测（PBLUP）。这些方法的有效性受到不完整系谱信息和低遗传力特性准确性较低的限制（Kim等人，2023年；Misztal等人，2020年）。此外，关于泰国本土鸡精液质量特性的遗传和基因组信息仍然有限。

基因组选择通过结合密集的单核苷酸多态性（SNP）数据来估计基因组育种值，从而提高预测准确性（Meuwissen等人，2001年）。在基因组方法中，单步基因组最佳线性无偏预测（ssGBLUP）将系谱、表型和基因组信息整合到一个统一的框架中，允许评估基因分型和未基因分型的动物（Misztal等人，2020年）。尽管ssGBLUP在几种家畜物种中提高了预测准确性，但其在本地鸡群体中的表现尚未得到充分验证。此外，标准ssGBLUP假设标记间的方差相等，这可能限制其捕捉具有中等或较大效应位点的能力。加权ssGBLUP（WssGBLUP）通过根据估计的遗传方差为标记分配特定权重来扩展ssGBLUP，从而可能提高预测准确性和检测生物学上相关的基因组区域（Teissier等人，2019年）。当与全基因组关联研究（GWAS）结合使用时，这种方法可以提供关于复杂特性的遗传结构的见解。尽管GWAS在某些鸡群体中鉴定出了与繁殖特性相关的候选基因（Zhang等人，2023年；Zhu等人，2025年），但关于泰国本土鸡精液质量特性的信息仍然有限。特别是，对这些特性的基因组预测模型的比较评估和相关基因组区域的表征尚未得到充分建立。这一限制可能限制了基因组选择在改善本地鸡群体繁殖性能方面的有效应用。

**材料与方法**
**伦理声明**
机构动物护理和使用委员会根据泰国国家研究委员会的动物实验伦理标准批准了实验程序（记录编号IACUC-KKU-110/68）。

**数据与资源群体**
数据集包含5,597条记录，涉及395只40至156周大的泰国本土Pradu Hang Dum公鸡。这些鸡被单独饲养在开放式笼子（45×50×60厘米）中，处于自然光照周期和室温条件下。所有鸡每天提供约110克含有90.07%干物质（DM）、17.15%粗蛋白（CP）、3.35%粗纤维（CF）和9.75%醚提取物（EE）的商业育种饲料，并可自由饮水。这些鸡从孵化到研究结束都在泰国孔敬大学农业学院的动物育种和组学研究中心饲养。

**精液质量数据**
从公鸡身上收集的精液数据包括三个特性：精子浓度（×10^9精子/毫升）、精液体积（毫升/射精）和质量移动性（评分）。质量移动性由一名受过培训的技术人员在光学显微镜下以1–5的序数分类评分进行评估，以减少评估者的偏差。

**表型数据**
精液使用Dorso abdominal massage方法（Castillo等人，2021年）收集，并立即用0.1毫升的改良IGGKPh稀释剂（Chankitisakul等人，2022年）稀释。采集工作由受过培训的人员进行，以减少污染。样本在运输过程中受到保护，避免光照，并保持在22–25°C的温度下，运输时间不超过20分钟。精液体积直接用1毫升量筒测量。精子活动性通过将未稀释的精液滴在玻璃载玻片上并在复合显微镜下观察波动运动来评估（100倍放大）。质量移动性评分范围为1–5。精子浓度使用血细胞计数器测定。简而言之，1微升精液用999微升4%（重量/体积）氯化钠溶液（1:1,000稀释）稀释。稀释后的样本加载到计数室中，在光学显微镜下（400倍放大）计数精子细胞。精子浓度以每毫升精子细胞数表示。泰国本土鸡精液特性的数据结构和描述性统计见表1。

**表1. 泰国本土鸡精液特性的数据结构和描述性统计**
| 特性 | 平均值 ± 标准差 |
|------------------|---------------------|
| 质量移动性（评分） | 3.60 ± 1.18 |
| 精液体积（毫升/射精） | 0.32 ± 0.16 |
| 精子浓度（×10^9精子/毫升） | 3.66 ± 1.46 |

**基因型数据和质量控制**
从287只鸡（150只公鸡和137只母鸡）的翼静脉中采集血液样本。所有鸡在采样后及整个实验期间都保持临床正常状态。根据制造商的说明，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，Hilden，德国；目录编号69504）提取基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计评估DNA浓度和纯度，选择浓度≥40 ng/μL的样本进行Axiom Genome-Wide Chicken 580K SNP Array基因分型。基因型质量控制使用BLUPF90+软件家族（版本2.56，Misztal等人，2024年）进行。排除调用率<0.90的SNP和单等位基因频率（MAF）<0.05的SNP。还移除了具有>10%冲突的SNP和具有>1%冲突的个体。质量控制后，剩余434,173个SNP用于后续的基因组选择分析。

**遗传评估模型**
使用GIBBSF90（BLUPF90+软件家族，版本2.56）在贝叶斯框架内，通过多性状重复性阈值-线性模型估计遗传参数（遗传力、遗传相关性和永久环境相关性）和育种值。质量移动性被视为序数性状（评分1–5），而精液体积和精子浓度被视为连续性状。模型定义如下：
y = Xb + Za + Wpe +
其中y是观察到的表型向量（阈值性状的潜在性尺度）；b是固定效应向量，包括孵化代数、公鸡年龄和体重；a是加性遗传效应向量；pe是永久环境效应向量；e是残差效应向量。X、Z和W分别是将观察结果与固定遗传效应、加性遗传效应和永久环境效应相关联的矩阵。

**PBLUP**
使用基于系谱的最佳线性无偏预测（PBLUP）模型对动物之间的遗传关系进行建模。假设加性遗传效应遵循多元正态分布：
a ～ N(0, Aσa2)

**ssGBLUP**
应用ssGBLUP方法结合系谱和基因组信息。在此方法中，混合模型方程中基于系谱的关系矩阵的逆被组合关系矩阵的逆替代：
H?1 = A?1 + [000G?1 ? A22?1]
其中H?1是组合关系矩阵的逆，A?1是基于系谱的关系矩阵的逆，G?1是基因组关系矩阵的逆，A22?1是仅针对基因分型动物的基于系谱的关系矩阵的逆。

**WssGBLUP**
使用WssGBLUP方法进行基因组评估，采用多性状遗传模型。与仅基于基于系谱的关系矩阵逆的传统动物模型不同，将组合关系矩阵的逆纳入混合模型方程：
H?1 = A?1 + [000τG?1 ? ωA22?1]
其中A?1是所有分析中包含的动物的基于系谱的关系矩阵的逆，G?1是基因组关系矩阵的逆，A22?1是仅针对基因分型动物的基于系谱的关系矩阵的逆。由于只有不完整的系谱信息，因此在构建矩阵A时未包括近交系数，这可能略微影响了估计结果。基因组关系矩阵（G）和SNP权重按照VanRaden（2008年）描述的方法构建：
G = ZDZ′2 ∑i=1mpi(1 ? pi)di=1.125(∣s^i∣SD(s^i)2)
其中Z是调整了等位基因频率的中心化基因型协变量矩阵，D是包含SNP特定权重的对角矩阵，m是SNP标记的总数，pi是第i个SNP的参考等位基因频率，di是分配给第i个SNP的权重，s^i是从阈值ssGBLUP分析获得的后验平均SNP效应。

**模型比较**
使用Legarra和Reverter（2018年）描述的线性回归（LR）方法评估PBLUP、ssGBLUP和WssGBLUP的预测性能。数据集被随机划分为完整数据集（w）和部分数据集（p），其中部分数据集是通过屏蔽一部分动物的表型记录生成的。在这项研究中，屏蔽了75只验证动物（当前代公鸡的50%）的表型以创建部分数据集。从两个数据集中估计了育种值，并基于完整数据集和部分数据集获得的估计值之间的比较计算了预测准确性、偏差和离散度。使用以下指标评估了该验证组的模型性能：(1)偏差：偏差用于量化从部分数据集和完整数据集获得的EBVs/GEBVs之间的平均差异：μw,p=u^￣p?u^￣w，其中u^￣p和u^￣w分别是来自部分数据集和完整数据集的平均预测育种值。(2)准确性：准确性通过从完整数据集和部分数据集估计的EBVs/GEBVs之间的皮尔逊相关性来评估，反映了模型正确排序动物的能力：ρw,p=cov(u^p,u^w)var(u^p)var(u^w)(3)离散度：使用u^w对u^p的回归系数来评估离散度。理想的值为1.00，表示没有过度或不足的离散度：βw,p=cov(u^w,u^p)var(u^p)(4)协方差：计算了来自完整数据集和部分数据集的预测育种值之间的协方差，以评估它们的线性关联：cov(u^w,u^p)GWAS为了识别与泰国本地公鸡精液特征相关的基因组区域和SNP，使用最佳模型进行了GWAS。使用POSTGSF90软件包迭代估计SNP效应。将加性基因组育种值（u^）根据它们的共享基因组方差（σu2）转换回SNP效应（s^）：s^=DZ′G?1u^，其中Dis是SNP权重的对角矩阵，Z是将SNP基因型与个体关联的关联矩阵，G是基因组关系矩阵。每个SNP窗口（五个连续的SNP）解释的加性遗传方差的比例计算如下：Var(∑j=15zjs^j)σ^u2×100，其中Var(∑j=15zjs^j)表示由给定五个SNP窗口解释的遗传方差，σ^u2是总加性遗传方差，zj是第j个SNP在所有个体中的基因含量向量，s^j是第j个SNP的估计效应。为了识别与三个精液特征相关的候选基因，考虑了解释超过0.5%总加性遗传方差的基因组区域。基于Gallus gallus参考组装（GRCg4）注释了基因组坐标。对于每个显著的SNP，定义了一个1 Mb的窗口（上游0.5 Mb和下游0.5 Mb）。从NCBI数据库中检索这些区域内的候选基因，重点关注功能特征化的基因。使用DAVID生物信息学资源（版本2025_2）进行了功能注释和通路富集分析。所有统计分析和可视化，包括曼哈顿图，都是在使用R（版本4.5.2）和RStudio环境（版本2026.01.2）的情况下进行的。

**结果**

**鸡龄对精液特征的影响**
图1显示了年龄（40–156周）与精液质量特征之间的关系。随着年龄的增长，精子浓度和质量运动能力逐渐下降，其中精子浓度的下降趋势最明显（b?=??0.008）。相比之下，精液体积相对稳定（平均?=?0.320 mL；b ≈ 0.000）。在100周龄后观察到更明显的下降和更大的变异性，表明在较高年龄时精液质量降低。这些模式表明，与年龄相关的退化主要影响精液的功能特征，而不是射精体积。

**年龄对精液特征育种值的影响**
如图2所示，所有精液特征的育种值（EBVs和GEBVs）随着年龄的增长而下降。精子浓度的下降最为显著（b?=??0.025），其次是精液体积（b?=??0.013），而质量运动能力的改变最小（b?=??0.002），表明其遗传稳定性较高。100周龄后育种值的变异性增加表明在较老的年龄时遗传表达的一致性降低，这可能会影响育种计划中的选择决策。

**遗传参数估计**
使用PBLUP、ssGBLUP和WssGBLUP获得的精子运动能力、精液体积和精子浓度的遗传参数估计值见表2。在所有特征中，遗传力估计值都很低，PBLUP下为0.046至0.143，在WssGBLUP下增加到0.060–0.165。包含基因组信息增加了加性遗传方差并改善了遗传力估计值，特别是对于精液体积。WssGBLUP下的遗传相关性更强，尤其是在精液体积和精子浓度之间（0.077至0.287），表明存在共同的遗传控制。相比之下，永久环境相关性在各个模型中都有所降低，表明遗传和环境效应的分割得到了改善。这些结果表明基因组模型更好地捕捉了精液特征的遗传结构。

**验证性能**
表3展示了泰国本地公鸡精液特征的育种模型的预测性能。与PBLUP相比，结合基因组信息提高了所有特征的预测准确性。精子浓度的改进最为显著（ssGBLUP和WssGBLUP分别为0.714至0.823和0.806）。WssGBLUP显示出最高的整体准确性（平均?=?0.804）和较低的离散度，表明预测更加稳定。偏差值在所有模型中都很低（0.002–0.003），确认了最小的系统偏差。这些结果证明了基因组模型在提高精液特征预测可靠性方面的优势。

**SNP效应和基因组区域**
图3的曼哈顿图表明，精液特征受到多个位点的影响，这些位点具有小的效应，分布在几个染色体上。值得注意的是，6号、11号、19号、21号和22号染色体上的区域解释了超过0.5%的遗传方差，并且在包括质量运动能力、精液体积和精子浓度在内的多个特征中一致被识别。检测到影响多个特征的重叠基因组区域与这些精液特征之间的强遗传相关性一致。

**候选基因和显著SNP的识别**
GWAS识别出几个与精液特征相关的显著基因组窗口（表4）。对于精液体积，6号和21号染色体上检测到显著区域，包括VDAC2和GPAT2等基因，这些基因参与线粒体功能和脂质代谢。对于质量运动能力和精子浓度，11号和19号染色体上检测到重叠区域，包含RPGRIP1L、FTO和C1QBP等基因。这些基因与纤毛功能、能量调节和细胞过程相关。总体而言，识别的候选基因在功能上与线粒体活性、纤毛结构和细胞内运输相关，这对精液功能和精液质量具有生物学意义。

**讨论**
繁殖效率是家禽系统生产力的关键决定因素，精液特征直接影响种公的生育能力和鸡群的表现（Vitorino Carvalho等人，2021；Daryatmo等人，2024）。在这项研究中，评估了与年龄相关的精液特征变化，并比较了基于系谱和基因组的预测模型的性能以及全基因组关联分析。这些结果提供了关于精液特征遗传结构的见解，并展示了基因组信息在提高泰国本地公鸡繁殖性能方面的实际价值。随着年龄的增长，精子浓度和质量运动能力下降，而精液体积相对稳定。这些结果与先前的报告一致，表明老化公鸡的精子发生效率和内分泌功能降低（Ayeneshet等人，2024；Roshdy等人，2024；Guo等人，2026）。大约100周后观察到的表型变异性增加表明老年鸡的均匀性降低和环境敏感性增加。从育种的角度来看，这可能会降低表型记录的可靠性并影响选择的一致性。因此，早期选择种公可能会提高记录的稳定性并缩短世代间隔。遗传力估计值（0.046–0.168）表明精液特征受到低到中等的加性遗传控制，表明环境和非加性效应的贡献较大（Fournier等人，2019；Wolc等人，2019；Li等人，2025）。在这种情况下，提高预测准确性对于实现遗传进步至关重要（Ndung’u等人，2022；Liang和Xuan，2024）。SNP效应在多个染色体上的分布支持多基因组结构，没有主要位点解释了大部分遗传方差。这一发现与生殖特征的复杂生物学调控一致，并支持使用全基因组方法（Liang等人，2024）。精子浓度和质量运动能力之间的强正遗传相关性表明它们受到共同的遗传控制，并表明这些特征受到共同的遗传机制的影响。从选择的角度来看，这种关系是有利的，因为一个特征的改善预计会导致另一个特征的相关改善。缺乏拮抗相关性进一步支持了多特征选择策略的应用（Chomchuen等人，2022；Guo等人，2025）。基于基因组的模型相比PBLUP提高了预测准确性，特别是对于精子浓度和精液体积，反映了基因组信息更好地捕捉了实际的遗传关系。WssGBLUP中的额外加权带来了适度的、依赖于特征的增益，对于高度多基因的特征（如质量运动能力）益处有限（Chen等人，2025；Zhou等人，2025）。这与证据一致，即当特征受到具有不同效应大小的位点影响时，加权模型最为有效（Lourenco等人，2020）。此外，基因组模型增强了对系谱错误或不完整家谱记录的鲁棒性，改善了关系估计并减少了育种值预测的偏差（Zhang等人，2019；Liu等人，2026；Misztal等人，2020）。这种优势对于本土种群尤为重要，因为那里的系谱信息可能有限。全基因组关联分析识别出多个解释小但有意义的加性方差的基因组区域，确认了精液特征的多基因组性质。在6号、11号、19号、21号和22号染色体上检测到的基因组区域各自解释了超过0.5%的加性方差，表明精液特征受到多个具有小到中等效应的位点的影响。本研究鉴定出的候选基因包括VDAC2（Park等人，2022年）、CFAP74（Zhang等人，2024年）和DUSP13（Biscotti等人，2020年），这些基因参与线粒体功能、鞭毛结构以及精子发生过程，从而支持了所检测信号的生物学相关性。其他基因如PRKCZ、GPAT2和RPGRIP1L则与ATP调节、基因组完整性及鞭毛发育有关（Liu等人，2024年）。重要的是，这项研究为泰国本地鸡的精液性状提供了新的基因组信息，而该群体的基因组证据目前仍然有限。然而，这些关联结果应谨慎解读，因为它们并不代表已被证实的因果变异。尽管本研究展示了基因组评估的优势，但仍需考虑一些局限性。样本量虽然足以估计遗传参数，但可能限制SNP效应估计的精度，并降低检测到小效应位点的能力，这是全基因组关联研究中的常见问题。此外，本研究使用的SNP密度可能限制了作图分辨率，从而降低捕捉连锁不平衡中的因果变异的能力，尤其是在许多位点贡献小效应的高度多基因性状中。验证是在同一群体内进行的，这可能导致预测准确性的膨胀；因此，需要在更大或外部群体中进行独立验证，以确认这些结果的稳健性和普遍性。另外，尽管从统计上考虑了环境效应，但并未进行实验控制，未来结合生理、激素或功能基因组数据的研究将有助于更深入地解释所检测到的关联。

总之，本研究表明整合基因组信息显著提高了对泰国本地鸡精液质量性状的预测能力，为更精确和高效的选择父本提供了坚实的框架。ssGBLUP和WssGBLUP方法的性能提升，以及性状之间的强遗传相关性，支持了多性状基因组选择策略的实施。此外，观察到的年龄相关模式突显了优化父本利用的重要性，以改善选择反应并缩短世代间隔。除了方法论上的进步外，这些发现还对本土家禽群体的育种计划设计具有直接意义。采用基因组评估可以加速遗传改良，同时保持泰国本地鸡在热带生产系统下的适应性和抗逆性。扩大基因分型参考群体的规模、整合功能基因组信息以及完善性状定义将对于进一步提高预测准确性和生物学解释至关重要。从更广泛的角度来看，将基因组工具纳入国家育种策略有助于提高生产力、加强食品安全，并支持本地适应遗传资源的保护。总体而言，这项研究为泰国本地鸡及类似低投入生产系统从传统育种向基因组辅助育种的转变奠定了基础。

作者贡献声明：
Jiraporn Juiputta：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Veeraya Tuntiyasawasdikul：撰写——审阅与编辑、方法学。
Vibuntita Chankitisakul：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学。
Wuttigrai Boonkum：撰写——初稿、撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念化。