与肉鸡中沙门氏菌Typhimurium超强排泄者（super-shedders）发展相关的肠道微生物群特征

《Poultry Science》：Gut microbiota signatures associated with the development of Salmonella Typhimurium super-shedders in broiler chickens

　　刘艳|孟丽霞|王洋|邓倩茹|段梦珂|曾秋凤|白世平|丁雪梅|张凯英|王建平
中国四川省成都市，四川农业大学动物营养研究所，农业部动物疾病抗性营养重点实验室，四川省重点实验室，邮编611130

**摘要**
感染沙门氏菌Typhimurium（S. Typhimurium）的肉鸡可能会从急性感染状态转变为持续携带状态，其中一部分个体成为超级排泄者，对禽群中的病原体传播贡献显著。然而，导致这种表型出现的微生物和宿主因素仍不甚明了。在本研究中，通过口服方式给鸡接种S. Typhimurium，并根据粪便排泄情况将它们分为高排泄组、中等排泄组和低排泄组。在接种后14天（dpc），持续排出高细菌负荷（> 10? CFU/g粪便）的鸡被定义为超级排泄者。持续排泄与肠道形态受损、生产性能下降和持续性肠道炎症相关。全长16S rRNA测序显示不同排泄表型之间的粪便微生物群组成存在差异，超级排泄者的特征是Blautia显著富集，而Escherichia和Streptococcus减少。相关性分析表明，Blautia的数量与粪便中的S. Typhimurium负荷呈正相关，而Escherichia则呈负相关。此外，体外共培养实验表明，超级排泄者的粪便上清液在培养后期促进了S. Typhimurium的生长。总体而言，这些发现表明失调的肠道微生物群和炎症驱动的肠道微环境共同促进了肉鸡中S. Typhimurium的持续存在和超级排泄者的形成。针对肠道微生物组成和肠道炎症可能是减轻禽生产中超级排泄者出现的有效策略。

**引言**
根据统计数据显示，近年来中国约70%的人类细菌性疾病主要由沙门氏菌引起（Wang等人，2019年），其中禽类及其副产品被认为是人类感染的主要原因（Yang等人，2025年）。沙门氏菌是一种革兰氏阴性细菌，通常定植于动物的胃肠道（Liu等人，2021年）。在鸡中，沙门氏菌Typhimurium（S. Typhimurium）菌株可能导致全身感染并导致死亡，但更常见的是，在急性感染后转变为长期排出一定数量病原体的状态，即超级排泄者（Velge等人，2005年）。S. Typhimurium超级排泄者可通过水平和垂直传播导致病原体在禽群中的广泛传播，从而引发反复感染（Proux等人，2001年）。因此，为了减少S. Typhimurium感染及其进一步传播，识别和控制肉鸡中超级排泄者的形成至关重要。
先前的研究表明，不同的菌株或免疫反应可以部分解释S. Typhimurium的异质性定植和排泄（Calenge等人，2010年）。然而，在遗传同质和免疫抑制的群体中也观察到了超级排泄表型（Lawley等人，2008年），这表明还有其他因素影响这一结果。越来越多的研究表明，肠道共生细菌是抵抗肠道病原体定植的关键决定因素，并可能影响感染动态和排泄强度。将成年母鸡的微生物群转移到新生鸡体内可以提供对沙门氏菌定植的保护（Varmuzova等人，2016年），而在猪和小鼠中的研究将特定的微生物特征与高或低排泄表型联系起来（Argüello等人，2019年）。尽管取得了这些进展，但驱动超级排泄者表型出现的宿主和微生物因素，尤其是肠道共生细菌的作用仍不清楚。我们假设特定的肠道共生细菌，无论是预先存在的还是由感染重塑的，都会调节肠道炎症和微环境条件，从而影响S. Typhimurium的不同排泄表型的建立。为了验证这一假设，我们在肉鸡中建立了受控的口服感染模型，纵向分析了粪便排泄模式、肠道形态、免疫反应和肠道微生物群组成，并进一步评估了粪便微生物代谢物对S. Typhimurium生长的体外影响。

**材料与方法**
**实验设计与管理**
所有实验程序均获得四川农业大学动物护理和使用委员会的批准，并按照四川农业大学的实验室动物福利和伦理指南进行（中国四川成都）。本研究选择了50只健康的1日龄雄性Arbor Acres（AA）肉鸡，每只体重约为57克。每只鸡单独关在笼子里，以便准确监测个体水平的粪便S. Typhimurium排泄情况。在5日龄时，所有鸡每天口服接种200 μL浓度为1×10? CFU/mL的S. Typhimurium SL14418菌株，连续三天。在接种后3、7、14和21天（dpc）收集每只鸡的新鲜粪便样本进行细菌计数和微生物群分析。所有鸡在26日龄时被安乐死并取样。环境温度和光照条件符合肉鸡养殖标准。在整个实验过程中，鸡可以自由获取水和商业无抗生素的基础饲料（表1）。

**表1. 基础饲料的配方和营养成分（g/kg）**
| 成分 | 含量（%） |
|--------------|--------------|
| 玉米 | 53.03 |
| 大豆粕 | 38.74 |
| 大豆油 | 4.38 |
| 二钙磷酸盐（DCP） | 1.88 |
| 碳酸钙 | 0.79 |
| 氯化胆碱 | 0.30 |
| DL-甲硫氨酸 | 0.21 |
| 复合矿物质 | 20.20 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 0.09 |
| 复合维生素 | 10.03 |
| 总计 | 100.00 |

**营养水平**
| 可代谢能量（Mc/kg） | 3.00 |
| 粗蛋白（%） | 21.00 |
| 赖氨酸（%） | 1.15 |
| 甲硫氨酸（%） | 0.50 |
| 可利用磷（%） | 0.45 |
| 钙（%） | 1.00 |

**每公斤预混料提供的营养成分：**
维生素A：12000 IU，维生素D?：3000 IU，维生素E：3 IU，维生素K?：0.48 mg，维生素B?：0.3 mg，维生素B?：0.96 mg，维生素B?：0.6 mg，维生素B??：0.03 mg，D-生物素：0.1665 mg，泛酸：1.8 mg，叶酸：0.15 mg，烟酰胺：6 mg。
**铜（CuSO?·5H?O）：** 7.0 mg，铁（FeSO?·H?O）：80 mg，锰（MnSO?·H?O）：60 mg，锌（ZnSO?·H?O）：55 mg，碘（KI）：0.7 mg，硒（Na?SeO?）：0.15 mg。

**S. Typhimurium的培养**
病原菌S. Typhimurium SL14418菌株储存在实验室的-80°C环境中。培养前，在低温环境下解冻，然后接种到Gifu厌氧培养基（GAM）中，37°C下培养24小时。对数生长阶段的细菌悬浮液调整至1×10? CFU/mL浓度，用于口服给药。

**样本收集**
在接种后3、7、14和21天（dpc）收集每只鸡的新鲜粪便，分别放入三个试管中。一个试管用于计数S. Typhimurium，一个试管用于分析粪便微生物群组成，另一个试管用于后续实验。在21天（dpc）时，对鸡进行安乐死并取样。收集肝脏、脾脏、回肠和盲肠扁桃体组织样本，同时收集回肠和盲肠的内容物并储存在超低温冷冻箱中。小心取出回肠并放入甲醛中固定。

**粪便中S. Typhimurium的计数**
精确称量新鲜粪便样本（0.5克），用无菌盐水或磷酸盐缓冲液混匀制成1:10的稀释液。将得到的悬浮液进行系列十倍稀释，接种到Xylose Lysine Deoxycholate（XLD）选择性琼脂上，37°C下培养24小时。培养后，计数假定的S. Typhimurium菌落，并以每克新鲜粪便样本的菌落形成单位（CFU）表示浓度。所有上述操作均在无菌条件下进行。

**组织学分析**
回肠组织的苏木精-伊红（HE）染色和石蜡切片由成都Nine Plus One Biotechnology Co.完成。使用数字三目视频显微镜（BA400 Digital，日本）拍摄切片图像。对于每个切片，在10个位置测量绒毛高度和隐窝深度，然后计算绒毛高度与隐窝深度的比率。

**Western Blot**
称量组织，按1:9的比例加入裂解缓冲液。然后在低温下用匀浆器将混合物匀浆至完全裂解。匀浆液离心15分钟，收集上清液以提取蛋白质并测定蛋白质浓度。蛋白质加载、凝胶电泳和膜转移后，加入3% BSA-TBST在室温下封闭30分钟。加入一级抗体，包括兔抗Claudin-1、ZO-1（1:2000）和Occludin-1（1:1000），4°C下孵育过夜。洗去一级抗体，加入二级抗体（山羊抗兔IgG (H+L) HRP，1:10000）并在室温下孵育40分钟，然后进行膜清洗。使用ECL发光溶液进行显色，使用Image J V1.8.0.112软件分析相对蛋白质表达水平。

**通过实时PCR检测回肠和盲肠相关基因的mRNA表达**
根据制造商提供的指南，使用Tritazol试剂（Takara，北京，中国）从回肠和盲肠组织中提取RNA。使用NanoDrop ND1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，威斯康星州麦迪逊）评估RNA的浓度和纯度。使用SuperScriptTM逆转录酶试剂盒（Invitrogen，美国）合成互补DNA（cDNA）。使用SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量实时PCR。定量表达水平的参考基因是β-actin。所有引物见表2，基因表达水平通过2?ΔΔCt方法确定。

**表2. 用于测量基因表达的引物序列**
| 目标基因 | 引物序列（5′→3′） | GenBank编号 |
|----------------|-----------------|----------------------|
| β-actin | TGCGTGACATCAAGGAGAAG | NM_205518 |
| | TGCCAGGGTACATTGTGG | |
| | TAIL-4 | AGACAAATAACAAAACTGAG | NM_00100707 |
| | TTGGTGGAAGAAGGTACG | |
| IL-4 | TGTCACCGCTTCTTCACCT | NM_0010044 |
| | TCCCGTTCTCATCCATCTT | |
| | TLR4 | ACTCTCAATGCGATGCACT | NM_001030 |
| | AGTCCGTTCTGAAATGCCG | |
| Claudin-1 | CATCTCCTGGGTCTGG | NM_001013 |
| | 1 | GACAGCCATCCGCATCTT | |
| | | NM_2051 |
| | GGGCGAAGAAGCAGATGA | GMUC-2 |
| | AACTCCTCCTTTGTATG | XM_0407 |
| | 1 | ATTCAACCTTCTGCCCT | |
| | ZO-1 | GGCAAGTTGAAGATGG | XM_0406 |
| | 1 | ATGCCAGCGACTGAATTTCT | |
| | iNOS | ACTGAAGGTGGCTATTGG | NM_2049 |
| | 1 | GGGTGGGTGGGGTAGT | |
| IL-10 | GTGTTACCTGGGAGAAG | IL-2 | NM_2041 |
| | 1 | GATCTTGCATTCACTTCC | |
| | IFN-γ | AAACACTGACAAG | NM_2044 |
| | 1 | CTTCACGCCATCAGGA | |
| | IL-6 | TGTTACCTGGGAGAAG | NM_2046 |
| | 1 | CTCGTCCGGAACAACCT | |
| | NF-κB | GTGTGAAGAACGGG | NM_2051 |
| | 1 | CCATTTTCCCATGCT | |
| IL-18 | TCTGGCAGTGGAATGT | XM_0315 |
| | 1 | 9998 | |
| | CCATTTTCCCATGCT | |
| MYD88 | AGAAGGTGTCGGAG | XM_0469 |
| | 1 | GGGCTCCAAATGCT | |
| | GF-β | CTTCACGCCAGG | |
| | 1 | 1045 | |
| | TGTGATGGAGCCAT | |
| | TRIF | ACTGACAAGTCAA | NM_0010 |
| | 1 | 878 | |
| | TGAGGGTTGGTAAAG | XM_0469 |
| | 1 | GGGCTCCAAATGCT | |
| | 1 | CTTCACGCCATCAG | |
| | IL-4 | TGTTACCTGGGAGAAG | NM_2041 |
| | 1 | 1087 | |
| | GGGCTCCAAATGCT | |
| | 1 | CTTCACGCCATCAG | |
| | IL-6 | GTGTACCTGGGAGAAG | NM_2046 |
| | 1 | TGATCTTGCATTCA | |
| | IL-10 | AGAAGGTGGCTATT | NM_2049 |
| | 1 | GGGTGGGTGGGGTAG | |
| IL-18 | GTGTTACCTGGGAGAAG | NM_2041 |
| | 1 | 153.2 | |
| | GATCTTGCATTCA | |
| | CTTCACGCCATCAG | |
| | IFN-γ | AAACACTGACA | NM_2044 |
| | 1 | CTTCACGCCATCAG | |
| | IL-18 | TGGTACCTGGGAGAAG | NM_2046 |
| | 1 | 1 | 88 |
| | CTTCACGCCATCAG | |
| | NF-κB | GTGTGAAGAACGGG | NM_2051 |
| | 1 | 1 | 986 |
| | GGCACGGTTGTCAT | |
| | IL-18 | TCTGGCAGTGGAATGT | NM_2041 |
| | 1 | 1 | 88 |
| | CTCGTCCGGAACAACCT | |
| | NOD1 | AGAAGGTGTCGG | NM_2046 |

**全长16S rRNA基因测序用于生物多样性分析**
在接种后3、7、14和21天（dpc）收集每只鸡的粪便样本，使用16S rRNA基因测序分析和量化粪便微生物群。使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美国）从粪便样本中提取微生物群基因组DNA，然后在1%琼脂糖凝胶上进行检测。使用NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific，美国）测量DNA浓度和纯度。使用通用细菌引物27F和1492R扩增全长细菌16S rRNA基因。将纯化产物按等摩尔比混合，使用SMRTbell prep kit 3.0（Pacific Biosciences，美国）根据PacBio的说明构建测序文库。纯化的SMRTbell文库在PacBio Sequel IIe系统（Pacific Biosciences，美国）上进行测序，由Majorbio（上海，中国）完成。质量控制和组装后的优化序列使用Qiime2 pipeline中的DADA2插件（或Deblur插件）去噪，去噪后的序列通常称为扩增子序列变异体（ASVs）。下游分析在Majorbio Cloud Platform上进行粪便排出的时间动态在三个组之间存在显著差异，H组在整个观察期间都表现出持续的高水平排出（图1D）。持续的高水平排出与生产性能的负面趋势相关。在26日龄时，H组的平均体重较低，饲料摄入量较高，尽管并非所有差异都达到统计学显著性（图1E，F）。此外，从第1天到第26天的饲料转化率（FCR）在H组中倾向于较高，表明超级排出者的生产效率较低（图1G）。关键的是，我们的体外数据表明，在超级排泄者中，微生物环境积极促进了病原体的生长。我们提出，肠道微生物群和宿主免疫反应的联合作用为鼠伤寒沙门氏菌的持续存在创造了一个有利的环境。沙门氏菌病是继弯曲杆菌病之后人类最常见的食源性人畜共患病（Kempf等人，2023年）。感染鼠伤寒沙门氏菌后，个体的粪便排泄通常表现出异质性，即使在基因上同质的宿主群体中也能观察到这种现象。这一现象已在小鼠、鸟类和猪身上得到验证。在鼠伤寒沙门氏菌传播的小鼠模型中，30%的感染个体被定义为超级排泄者，因为他们在口服感染后30天内粪便中的病原体水平超过10^8 CFU/g（Lawley等人，2008年）。在猪的鼠伤寒沙门氏菌感染模型中，那些在感染后21天时粪便中沙门氏菌排泄量对数曲线下面积（AULC）值为107.70±12.13的猪被归类为超级排泄者（约29%）（Kempf等人，2023年）。在这项研究中，我们观察到肉鸡粪便中沙门氏菌排泄有三个不同的水平：高、中和低。值得注意的是，16%的肉鸡即使在感染后14天仍继续大量排泄病原体（>10^5 CFU/g粪便），这些个体被定义为超级排泄者。鼠伤寒沙门氏菌感染通常会导致肉鸡生产性能显著下降（Yin等人，2024年；Yang等人，2025年）。与L组相比，我们发现H组在26天内的饲料摄入量增加而体重增长减少，第1天到第26天的饲料转化率（FCR）也更高。这些结果表明，肉鸡感染并发展为超级排泄者会损害其生产性能。HE染色的组织病理学证据直接证实了超级排泄者肠道的严重损伤。回肠中绒毛的广泛钝化、粘附和结构破坏是营养吸收受损和物理屏障严重弱化的典型特征（Juricova等人，2013年；Meijerink等人，2021年）。这种宏观损伤为生产性能下降的趋势提供了合理的解剖学解释（Awad等人，2015年）。

肠道上皮细胞及其之间的紧密连接复合体构成了抵御肠道感染的第一道防线，有助于维持肠道稳态。紧密连接蛋白常被用作反映宿主肠道屏障完整性的生物标志物（Chelakkot等人，2018年）。研究表明，鼠伤寒沙门氏菌的入侵会导致ZO-1和Occludin-1的表达减少，Claudin-1和MUC-2的重新分布，促进细菌的转移，并导致屏障功能丧失（Awad等人，2017年）。在这项研究中，我们检测了紧密连接成分的转录和翻译水平。在mRNA水平上，ZO-1、Occludin-1和Claudin-1在超级排泄者中显著上调。然而，Western blot分析显示，ZO-1和Occludin-1的蛋白水平在三个组之间没有显著差异，而Claudin-1的蛋白在超级排泄者中显著低于中度排泄者。因此，超级排泄者中升高的紧密连接转录本并未转化为相应的蛋白积累。mRNA和蛋白表达之间的不一致表明存在转录后调控机制，但这种调控的具体性质需要进一步研究。重要的是，无论紧密连接的发现如何，H&E染色观察到的严重绒毛钝化和结构破坏，以及促炎细胞因子的表达升高，都明确表明超级排泄者存在严重的肠道屏障功能障碍。这种肠道损伤的主要驱动因素是持续的促炎状态，表现为IL-6、iNOS、IL-2和IL-18的显著升高。这种环境对上皮细胞具有直接的细胞毒性，并破坏了紧密连接的组织结构（Liu等人，2023年）。此外，这种炎症被鼠伤寒沙门氏菌所利用，这是一种典型的“炎症驱动”的病原体，它利用宿主产生的炎症产物（如iNOS产生的硝酸盐）来获得相对于专性厌氧共生菌的优势（Winter等人，2010年；Lopez等人，2012年）。因此，在超级排泄者中，炎症具有双重作用：直接导致组织损伤，同时为沙门氏菌的 dominance 创造了选择性的环境。

越来越多的研究表明，肠道微生物群在维持宿主健康方面起着重要作用（Clavijo和Flórez，2018年；Diaz Carrasco等人，2019年）。鸡在发育阶段早期接触鼠伤寒沙门氏菌会对肠道微生物群的整体发展产生不利影响，导致盲肠微生物多样性降低和病原体相关成员的增加（He等人，2020年）。在没有肠道微生物群的情况下，所有肉鸡在感染鼠伤寒沙门氏菌后都会成为超级排泄者（Kempf等人，2020年），这与我们的观察结果完全不同。与此相反，本研究发现H组的粪便微生物群扩增子序列变异（ASV）计数始终高于L组。我们推测这可能是由于H组中鼠伤寒沙门氏菌的广泛定植，破坏了宿主介导的栖息地，引发了细菌群落的菌群失调，导致非驻留肠道微生物的入侵增加。β多样性分析表明，鼠伤寒沙门氏菌超级排泄者和正常个体之间的微生物结构和多样性存在差异。我们的结果确定了与沙门氏菌排泄密切相关的特定肠道微生物群成员，特别是Blautia和Escherichia。Escherichia和鼠伤寒沙门氏菌属于同一科——肠杆菌科，在生长条件和代谢特征上具有多个共同点。研究表明，在肠道中，大肠杆菌可以与鼠伤寒沙门氏菌竞争常见的营养物质，如氧气、半乳糖醇和铁载体，从而抑制其定植（Deriu等人，2013年；Litvak等人，2019年；Eberl等人，2021年）。Blautia通常被认为是一种有益细菌，与肥胖和心血管疾病有关，其丰度与某些疾病呈负相关，并具有某些抗菌特性（Caballero等人，2017年；Hatziioanou等人，2017年；Alavi等人，2020年）。然而，一些研究表明，与健康个体相比，胃肠道疾病患者的粪便中Blautia的丰度更高（Rajili?-Stojanovi?等人，2011年；Nishino等人，2018年）。我们发现Blautia与病原菌的排泄量呈显著正相关，可能是因为Blautia在炎症或菌群失调条件下优先扩张，这同时有利于鼠伤寒沙门氏菌的持续存在。然而，我们研究的横断面设计不允许我们确定菌群失调和炎症之间的时间关系。乳酸杆菌具有广泛的作用，包括调节肠道菌群、抗菌活性和抗氧化特性。研究表明，植物乳杆菌可以通过调节紧密连接蛋白的表达来保护宿主免受鼠伤寒沙门氏菌引起的肠道屏障损伤（Wang等人，2018年）。然而，研究表明，在严重的肠道炎症期间，鼠伤寒沙门氏菌可能利用乳酸作为肠道增殖的营养物质（Gillis等人，2018年），这可能与超级排泄者中观察到的高乳酸杆菌水平有关。

为了研究不同鼠伤寒沙门氏菌排泄水平的肉鸡粪便微生物群如何影响体内鼠伤寒沙门氏菌的定植，我们在体外共培养了三组肉鸡的粪便上清液和鼠伤寒沙门氏菌。结果显示，H组的粪便上清液显著促进了鼠伤寒沙门氏菌的生长。因此，我们假设不同排泄水平的肉鸡可能通过不同肠道细菌产生的代谢物影响鼠伤寒沙门氏菌的定植。为了探索潜在的分子机制，我们进行了微生物功能预测分析。结果表明，肠道中的某些代谢途径与鼠伤寒沙门氏菌的定植有关。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成与肠道屏障和免疫功能相关。例如，吲哚衍生物可以增强屏障功能和免疫反应，从而提供对病原体的抵抗力（Platten等人，2019年）。其中，吲哚-3-乳酸（ILA）是一种来自色氨酸的微生物代谢物，可以激活AHR/IL-22通路，提供对鼠伤寒沙门氏菌感染的保护（Li等人，2024年）。丁酸盐代谢是肠道微生物群与宿主之间互利共生关系的一个典型例子。研究表明，丁酸盐通过改变与病原体毒力相关的基因表达来抑制沙门氏菌的生长（Gantois等人，2006年）。这些发现与本研究的结果一致。氨基糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸是细菌细胞壁的关键成分。H组中的微生物可能通过氨基糖和核苷糖代谢途径为鼠伤寒沙门氏菌的增殖提供关键成分。虽然这些功能预测提供了合理的机制线索，但我们承认驱动超级排泄者中鼠伤寒沙门氏菌生长的具体代谢物尚未确定。由于粪便上清液样本的耗尽，当前研究中无法进行靶向代谢组学分析。尽管如此，我们的体外共培养实验直接证明了超级排泄者的肠道微环境具有促病原性，“氨基糖和核苷糖代谢”途径为未来的代谢组学验证提供了一个可测试的假设。要确定特定微生物类群（如Blautia和Escherichia）与超级排泄者表型之间的因果关系，需要无菌模型和特定菌株的功能研究。

**结论**：鼠伤寒沙门氏菌超级排泄者表现出严重的肠道损伤、持续的炎症反应和独特的肠道微生物群组成，这些因素共同促进了病原体的持续存在和高水平排泄。调节肠道微生物组成和肠道炎症可能是减少家禽生产系统中超级排泄者发生的有效策略。

**作者贡献声明**
Yan Liu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。
Lixia Meng：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。
Yang Wang：撰写——初稿、可视化、方法学、正式分析。
Qianru Deng：撰写——初稿、可视化、正式分析。
Mengke Duan：撰写——初稿、可视化、正式分析。
Qiufeng Zeng：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、正式分析。
Shiping Bai：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、资金获取。
Xuemei Ding：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、资金获取。
Keying Zhang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、资金获取。
Jianping Wang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、资金获取。