德国年轻肉鸡群中出现了多例类似骨硬化症的疾病病例

《Poultry Science》：Multiple cases of osteopetrosis-like disease in young broiler flocks in Germany

　　希查姆·西德 | 本杰明·沙德 | 布里吉特·伯姆 | 伊娃·卡佩 | 维纳·赫林 | 安德烈亚斯·布鲁施韦因 | 多尔特·吕肖 | 费迪南德·施密特
德国慕尼黑工业大学魏亨斯蒂芬生命科学学院，生殖生物技术系

**摘要**
鸡的骨硬化症表现为成骨细胞异常增生，通常由禽白血病病毒（ALV）引起。本研究报道了一例生长缓慢的肉鸡出现的类似骨硬化症的病例，这些肉鸡在孵化后第6至17天之间出现跛行症状。虽然受影响鸡群中患病鸡的选择率有所不同，但所有动物都表现出相似的症状，包括虚弱、腿部肿胀和瘫痪。尸检主要发现长骨出现中度至重度的对称性增厚。组织学检查显示皮质区域存在弥漫性骨膜增生，并伴有明显的矿化骨组织形成。鉴于患病鸡的年龄较小且未检测到外源性ALV，探索可能导致该病症的遗传因素非常重要。此外，也不能排除该病症是由含有白血病病毒的疫苗引起的可能性。合作研究对于确定这一问题的感染性或遗传性原因至关重要。

**引言**
过去五十年间，家禽产业经历了显著增长。现代家禽育种提高了肉和蛋的产量，但为了追求快速生长和高产蛋率而进行的选育导致了诸如跛行、骨骼疾病以及啄羽等行为问题（Bokkers和Koene，2003；Julian，1998；Siegel等人，2019；Wideman Jr等人，2013）。维持骨骼健康是实现家禽群最佳性能的关键因素。肉鸡对快速增重的需求常常导致骨骼疾病，从而造成巨大的经济损失（Kestin等人，2001；Rath等人，2000；?wi?tkiewicz和Arczewska-Wlosek，2012）。在短时间内快速增重与骨骼发育不匹配，增加了畸形和骨折的风险（Julian，1998）。骨骼完整性受多种因素影响，包括年龄、遗传倾向和传染病。此外，钙、磷或维生素D的营养缺乏也可能导致骨骼生长减缓和矿化异常（Rath等人，2000；Wilson和Duff，1991）。病原体也会威胁骨骼质量，且通常与多种因素相关，这使得诊断和适当治疗变得复杂（Raehtz等人，2018）。

骨硬化症是一种独特的骨骼疾病，可由禽白血病病毒（ALV）引起，导致成骨细胞异常增生，尤其是在长骨中（Brothwell，2002；Robinson等人，1986）。ALV共有11个亚群，分别命名为A至K。其中ALV-E、ALV-F和ALV-G是内源性的，而其他亚群是外源性的，可能导致鸡类死亡率在1%至2%之间（Fandi?o等人，2023）。ALV亚群的分类基于宿主范围、gp85(SU)包膜蛋白序列、易感细胞与抗性细胞中的受体使用情况以及基因组特征（包括病毒是外源性还是内源性的）（Fandi?o等人，2023）。ALV，特别是J亚群（ALV-J），能够引起骨硬化症，其致癌性还可能导致髓细胞瘤、髓细胞瘤病、血管瘤和红细胞瘤（Fadly，2000；Fandi?o等人，2023）。ALV在长时间潜伏期后以较低频率诱发骨硬化症（Payne，1998；Schmidt和Smith，1982）。某些病毒株，如髓细胞瘤相关病毒2型（MAV-2），可在出生后几周内引起骨硬化症（Schmidt和Smith，1982）。这种疾病的快速发作是由于病毒整合触发了局部成骨细胞活动的“代谢风暴”（Smith和Ivanyi，1980），其特征是骨膜成骨细胞活动呈指数级增加，超过了自然吸收速度，导致髓腔被致密的、无序的编织骨取代（Smith和Ivanyi，1980）。包括人类和鸟类在内的脊椎动物的遗传性骨硬化症在病理学上表现为破骨细胞骨吸收缺陷（Piret等人，2016）。此外，某些遗传因素也可能导致某些鸡类的骨硬化症病变，例如微眼症相关转录因子（Mitf）的突变，该突变已被确定为鹌鹑骨硬化症的潜在因素（Kawaguchi等人，2001；Minvielle等人，2010）。其他物种（如人类）中也描述了类似的突变，但在鸟类中尚未进行研究（Leite等人，2023；Piret等人，2016）。临床表现包括骨干的明显同心性增厚，尤其是在跗跖骨处，使腿部呈现特征性的“弓形”或“粗腿”外观（Brothwell，2002）。从正常皮质骨向增生性编织骨的转变表明稳态信号完全丧失，病毒整合导致成骨细胞活动失控，破坏了髓腔（Thorp，1994）。这些骨骼病变带来了显著的经济负担，表现为饲料转化率降低和淘汰率增加，因此管理这一状况成为维持鸡群生产力的关键（Liu等人，2023）。

**研究方法**
2019年11月至2021年10月期间，共研究了9个肉鸡群，这些鸡群出现了跛行、瘫痪、饮水和饲料摄入量减少以及体重生长不均等问题。我们咨询了现场兽医，以获取有关雏鸡及其亲本鸡群接种方案的详细信息。临床团队记录了所有观察到的症状，并选择了部分鸡进行尸检和实验室检测。受影响的鸡来自两种不同的遗传背景：Ross 308（4个鸡群）和Hubbard Cy 57（5个鸡群）（表1）。这些鸡来自四个孵化场，其中三个位于德国南部，一个位于德国北部（表1）。在病例1-5中，农场从德国南部的一个孵化场购买了雏鸡。研究鸡群的数量从400只到30,000只不等，它们均饲养在深垫料环境中。在三个鸡群中，患病鸡的淘汰率在出生后前7天内达到了30%，而在其他鸡群中这一比例不超过3%。在一个农场中，经兽医建议后所有鸡都被淘汰（病例8，表1）。淘汰的鸡是根据农民日常检查中观察到的临床症状选择的，具体包括严重跛行的个体（如无法行走或用翅膀移动的鸡）。由于预后不良和动物福利问题，这些鸡被实施安乐死。安乐死由农民或现场兽医在现场进行，首先通过钝力撞击头部使其失去意识，然后通过颈椎脱位确保死亡。操作迅速且不会造成长时间痛苦，符合德国动物福利要求（https://www.gesetze-im-internet.de/tierschg/）。

**表1. 发生骨硬化症的肉鸡场概况**
| 病例编号 | 农场 | 孵化日期 | 检查的鸡只数量 | 孵化场 | 遗传背景 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 1 | A | 2019年8月10日 | 17 | Hubbard Cy57 | 2 |
| 2 | B | 2019年10月26日 | 15 + 24 | Hubbard Cy57 | 2 |
| 3 | C | 2019年12月14日 | 13 + 31 | Hubbard Cy57 | 2 |
| 4 | A | 2020年2月15日 | 12 | Hubbard Cy57 | 2 |
| 5 | D | 2020年11月27日 | 12 | Aviagen Ross 308 | 6 |
| 6 | E | 2021年2月19日 | 6 | Aviagen Ross 308 | 7 |
| 7 | F | 2021年7月12日 | 10 | Aviagen Ross 308 | 3 |
| 8 | G | 未知 | 未知 | Aviagen Ross 308 | 4 |
| 9 | F | 2021年10月14日 | 未知 | Hubbard Cy57 | 1 |

**材料与方法**
**病例历史**
根据体重差异，从2019年11月至2021年10月，共研究了9个肉鸡群。临床团队记录了所有观察到的症状，并选择了部分鸡进行尸检和实验室检测。受影响的鸡来自两种不同的遗传背景：Ross 308（4个鸡群）和Hubbard Cy 57（5个鸡群）（表1）。这些鸡来自四个孵化场，三个位于德国南部，一个位于德国北部（表1）。在病例1-5中，农场从德国南部的一个孵化场购买了雏鸡。研究鸡群的数量从400只到30,000只不等。在三个鸡群中，出生后前7天内患病鸡的淘汰率达到了30%，而在其他鸡群中这一比例不超过3%。在一个农场中，经兽医建议后所有鸡都被淘汰（病例8，表1）。淘汰的鸡是根据农民每日检查中观察到的临床症状选择的，特别是那些严重跛行的鸡。由于预后不良和动物福利问题，这些鸡被实施安乐死。安乐死由农民或现场兽医在现场进行。首先通过钝力撞击头部使其失去意识，然后通过颈椎脱位确保死亡。操作迅速且不会造成长时间痛苦，符合德国动物福利要求（https://www.gesetze-im-internet.de/tierschg/）。

**尸检分析**
根据标准程序对49只肉鸡进行了尸检。收集了心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠道、大脑和受影响长骨的组织样本用于组织学分析。此外，还收集了骨骼、肾脏和肝脏样本进行PCR分析。使用肛门拭子进行了抗原-ELISA检测。

**组织学**
组织样本用10%中性缓冲福尔马林固定并包埋在石蜡块中。4微米厚的组织切片安装在玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红（H&E）染色。

**放射学**
使用配备Fluorospot Compact FD平板探测器（VA01A；西门子医疗保健，埃尔朗根，德国）的Axiom Luminos dRF Max系统对四肢进行了放射学检查。标准投照包括每个翅膀和骨盆肢体的内外侧及头尾视图。曝光参数为48 kVp、14 mAs，源到探测器的距离为115厘米。成像器像素间距为0.148×0.148毫米。

**ELISA**
通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测p27抗原，该抗原存在于所有ALV亚群中，包括外源性和内源性ALV亚群。使用IDEXX ALV Ag Test试剂盒按照制造商说明进行检测（IDEXX Laboratories, Inc.，美国）。

**DNA提取**
使用QIAamp DNA Mini QIAcube Kit?（Qiagen GmbH，希伦，德国）根据制造商说明从组织材料中自动提取总DNA。分析的器官包括肾脏、骨骼和肝脏组织。

**PCR**
为了检测骨骼、肝脏和肾脏组织中的外源性ALV（包括A-D和J亚群），我们采用了嵌套PCR方法（García等人，2003）。两组引物分别位于长末端重复区域，扩增片段长度分别为350 bp至318 bp（引物对Leu3.2F/Leu7R）和175 bp至220 bp（引物对Leu11F/Leu12R）。第一次PCR使用Taq PCR Master Mix Kit（Qiagen），加入12.5 μl Taq PCR Master Mix、12.5 pmol每种引物（Leu3.2F/Leu7R）和无核酸酶的水，最终体积为25 μl。第二次PCR使用相同的引物对Leu11F/Leu12R和第一次PCR的PCR产物作为模板。第一次PCR的条件为94°C预热4分钟，随后30个循环：94°C变性20秒、60°C退火40秒、72°C延伸1分钟，最后72°C延伸2分钟。第二次PCR的条件相同，但总循环次数为35次。PCR产物分别在1.5%和2%琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。

**第二种方法**
我们采用了广谱（BS）PCR并进行后续序列分析，使用引物对BS-UP和BS-DWN（Spencer等人，2003）。该方法应能扩增所有相关ALV、RSV和MAV亚群的包膜基因片段（约1491 bp），除了J亚群。BS-PCR使用Q5? Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix（New England Biolabs GmbH，法兰克福，德国），总体积为25 μl，包含12.5 μl Q5 High-Fidelity 2X Master Mix、12.5 pmol每种引物和最多500 ng DNA。样本首先在98°C预热30秒，然后进行35个循环：98°C变性1分钟、60°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最后72°C延伸2分钟。PCR产物在1.5%和2%琼脂糖凝胶中进行电泳，并用溴化乙锭染色。

**系统发育分析**
使用BASIC BLAST程序分析核苷酸序列，以寻找与GenBank中已报道的ALV包膜基因序列的相似性。对齐的序列经过了自助法（1000次重复）处理，然后使用自助法生成的数据集通过最大似然法和Tamura-Nei模型在MEGA版本11中构建了系统发育树（Tamura等人，2021年）。结果临床检查显示了类似骨硬化症的疾病临床症状在孵化后第6天到第17天之间出现，除了一个在两个月大时被调查的群体，该群体出现了反复的骨硬化症病例（图1）。临床症状包括生长异常、瘫痪和跛行，导致难以获取食物和水（表1）。下载：下载高分辨率图片（727KB）下载：下载全尺寸图片图1. 一只11天大的肉鸡患骨硬化症的临床症状，表现为腿部皮肤发红、跛行以及长骨增厚，导致难以获取食物和水。尽管进行了广泛的调查，但未能获取到种鸡群的详细疫苗接种史，特别是出生当天在孵化场接种的疫苗信息。在饲养期间，种鸡接受了德国和奥地利常用的疫苗接种计划，包括标准活疫苗（饮用水疫苗）和灭活疫苗。所有有机肉鸡都接种了一种基于火鸡疱疹病毒（HVT）的载体疫苗，该疫苗携带编码传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP1抗原的基因盒和马立克病（Rispens CVI-988）疫苗。相比之下，传统饲养的肉鸡（Ross 308）仅接种了针对传染性支气管炎（多种菌株）、新城疫和传染性法氏囊病的活疫苗。

在49只被检查的肉鸡中，有40只表现出长骨骨干中度到重度的增厚。受影响长骨骨干的外径是同龄鸡的2-3倍。骨膜难以与骨头分离。股骨、胫跗关节和跗跖关节最常受到影响。在严重病例中，股骨的直径超过一厘米（图2）。其他骨骼如桡骨、尺骨、颅骨和脊柱受影响较小。此外，49只鸡中有16只（32%）表现出中度肾脏肿胀，而其他器官看起来正常。然而，需要指出的是，在这种现场病理学研究中没有记录肾脏与体重的比例，这代表了这项研究的局限性。下载：下载高分辨率图片（880KB）下载：下载全尺寸图片图2. 10天大的肉鸡类似骨硬化症的宏观图片。A) 整体视图 B) 用星号标记的增厚肱骨、股骨和胫跗关节。C) 增厚的跗跖关节（左）与健康的对照组动物（右）相比。D) 受影响股骨的横截面（左）大约1厘米厚，而健康的对照组股骨（右）大约0.35厘米厚。虽然这种情况通常是双侧的，但不同骨骼之间的严重程度可能有所不同。

骨骼和组织分析显示，皮质骨组织出现明显的、弥漫性的、主要是环状的增厚。骨膜成骨细胞显著增殖，随后形成了类骨组织和未成熟的编织骨（图3）。骨吸收细胞存在于内骨膜表面。干骺端生长板未受影响。在某些情况下，由于骨组织增加，髓腔宽度减小。肿胀的肾脏表现出急性肾小管上皮变性、多灶性矿化和管内尿酸沉积，并伴有肉芽肿反应。下载：下载高分辨率图片（2MB）下载：下载全尺寸图片图3. 孵化后11天临床患病动物的骨硬化症骨骼组织学图片。图片显示了骨干的纵向切片。外围有大量的成骨细胞增殖，随后向致密骨发展（星号）。苏木精-伊红（HE）染色；A: 20x, B: 40x, C: 100x；比例尺A: 200 μm, B: 100 μm, C: 100 μm。

为了确认骨骼病理学的X光表现，对农场F的两只具有代表性的10天大肉鸡（表1）进行了研究，一只严重受影响，另一只未受影响（对照组）。在对照组动物中，所有翼部和骨盆肢体的长骨皮质细腻、边界清晰且矿化良好，皮质与髓质的交界明显。在严重受影响的肉鸡中，骨干出现严重的、双侧对称的云雾状至层状矿化和无定形新骨形成，边界不清，最严重的是肱骨和股骨（图4）。两只动物的关节间隙均增宽，这与年龄相关的干骺端和腕骨及跗骨骨化不完全一致。下载：下载高分辨率图片（453KB）下载：下载全尺寸图片图4. 健康肉鸡和骨硬化症肉鸡右后肢的X光对比。左：严重受影响的肉鸡，股骨、胫跗关节和跗跖关节出现云雾状至层状矿化和无定形新骨形成。箭头指示无定形新骨形成和骨干矿化的区域。右：对照组动物。

抗原ELISA检测表明可能存在ALV的参与我们使用ELISA对之前的实验室研究进行了补充。从2023年的一例具有类似骨硬化症病变的病例中收集了20个泄殖腔拭子样本（未在表1中显示）并分析了p27蛋白，该蛋白存在于所有ALV亚型中。结果显示20个样本中有4个为ALV阳性（补充数据）。

所有检查的组织在嵌套PCR中均对外源性ALV呈阴性（A, B, C, D, J）。在第二种使用BS-PCR的方法中，所有四个样本都扩增出了预期大小的片段。通过BLAST分析获得的部分包膜基因序列，发现与内源性ALV的最接近匹配。进一步的系统发育分析确认了内源性ALV E亚型的存在（表2和图5）。分析的序列与内源性ALV聚类在一起。表2. 具有类似骨硬化症病变的鸡群中ALV的PCR筛查。鸡群编号。ALV前病毒DNA的检测外源性ALV ALV-BS1. PCR轮次2. PCR轮次PCR序列分析农场BB骨阴性阴性阳性ALV E亚型农场C骨阴性阴性阳性ALV E亚型肝阴性阴性阳性ALV E亚型肾阴性阴性阳性ALV E亚型

我们假设鸡中的ALV诱导的骨硬化症通常在潜伏的ALV感染后发展，这使得这种疾病在较老的鸡中显现（Schmidt和Smith，1982年）。相比之下，本报告描述了在出生前几天缓慢生长的年轻肉鸡中出现的类似骨硬化症的病例。值得注意的是，我们仅在巴伐利亚地区常见的两个品种Ross 308和Hubbard C57中报告了这种情况，而在其他肉鸡品种如Cobb Sasso和Ranger中未观察到骨硬化症，这些品种在研究区域中较少见。这些动物表现出典型的与MAV-2（O）菌株卵内感染后相关的临床症状和组织学病变（Powers等人，1987年）。MAV-2（O）可以在19天大的鸡胚胎中卵内注射后迅速引发骨硬化症病变，导致孵化后7天就出现骨病变（Powers等人，1987年）。有趣的是，将MAV-2（O）菌株注射到8天大的鸡中会导致100%的贫血，但没有骨硬化症的迹象（Paterson和Smith，1978年）。以前认为由ALV引起的骨硬化症是由外源性病毒亚型引起的，因为病毒是先天传播的（Smith和Ivanyi，1980年；Wang等人，2020年）。令人惊讶的是，在本病例中，标准PCR对所有ALV外源性亚型均为阴性。可能出现新的菌株，这些菌株可能逃避标准实验室方法的检测（Nishiura等人，2020年）。ALV-J从受感染的种鸡群中的垂直传播可能导致后代免疫抑制，甚至显著降低马立克病疫苗的效果，如疫苗保护指数较低所示（Wang等人，2020年）。已有报道指出，ALV-J引起的骨硬化症发生在成年鸡中，包括5至7周大的肉鸡，其特征是胸骨增厚和管腔狭窄，以及骨膜凹陷（Fotouh等人，2024年）。我们推测，后代的ALV感染可能与孵化场传播有关，因为许多受影响的肉鸡群来自同一个孵化场（表1）。此外，不能排除ALV的垂直传播的可能性，特别是之前的研究表明受污染的活疫苗可能是后代的疾病来源（Mao等人，2020年）。在我们的案例中，由于种鸡群的不完整疫苗接种史，无法评估是否由禽白血病病毒污染引起。有机肉鸡接种了一种基于火鸡疱疹病毒（HVT）的载体疫苗和另一种制造商的Rispens CVI-988疫苗。然而，疫苗批次号不可用，因此无法进行比较。这是一个重要的限制，因为疫苗相关的污染通常仅限于少数批次，并可能影响有限的分布时间（Mao等人，2020年）。Ross 308肉鸡也受到影响的事实并不支持疫苗污染的可能性。在德国，这个遗传品系通常不接种马立克病疫苗，这意味着它们既没有接种HVT载体疫苗也没有接种活马立克病疫苗。尽管如此，这些鸡仍然出现了类似的临床症状，尽管病例较少。

在大多数受影响的鸡群中，一旦出现无法行走的症状，就必须立即选择病鸡进行采样，这限制了进一步的采样。未观察到其他症状或组织学病变，如贫血或肾母细胞瘤。除了ALV引起的骨硬化症外，还有报道指出遗传性疾病也会导致这种情况，包括鸟类和人类。在其他鸡形目动物（如鹌鹑）中的先前研究表明，Microphthalmia-associated transcription factor（Mitf）基因的纯合突变会导致成骨细胞生成功能障碍（Kawaguchi等人，2001年；Minvielle等人，2010年）。作者报告了一个月大的鹌鹑出现骨硬化症表型，其长骨的干骺端区域放射不透明（Kawaguchi等人，2001年）。此外，还报道了人类婴儿中的常染色体隐性骨硬化症病例，发病率约为每250,000例活产中有1例（Amirfiroozy等人，2025年）。还有一些人类病例描述了与肾小管酸中毒相关的骨硬化症（Piret等人，2016年），这可能导致肾钙质沉着症（Sly等人，1991年）。虽然与肾小管酸中毒相关的骨硬化症是由氯离子/质子反向转运蛋白7（CLCN7）的基因缺陷引起的（Piret等人，2016年），但导致肾钙质沉着症的骨硬化症是由于碳酸酐酶2（CA2）的纯合突变（Sly等人，1991年）。人类和鸟类之间存在显著的遗传差异；尽管在人类中记录的遗传缺陷未在鸟类中发现，但研究鸟类的潜在遗传性疾病是值得的。由于受影响的肉鸡来自不同的遗传菌株，因此这些鸡群中的这种情况似乎不太可能是由遗传因素引起的。有趣的是，婴儿猕猴在子宫内暴露于一种结合并抑制RANKL活性的人类IgG2单克隆抗体后也出现了骨硬化症（Boyce等人，2014年）。还有报道描述了药物引起的骨硬化症，例如重复给予高剂量的氨基双膦酸盐唑来膦酸，这种药物通常用于治疗成骨不全症（Whyte等人，2023年）。营养原因，如钙磷失衡（Chen和Moran Jr，1995年）或继发性肾性甲状旁腺功能亢进，也可能导致骨骼结构受损并影响矿物质代谢（Naveh-Many和Volovelsky，2020年）。此外，骨骼结构未显示出佝偻病的迹象，这得到了这些鸡群补充了维生素A、D3、K以及钙磷复合物的支持。由于不同孵化场的鸡群受到影响，药物引起的骨硬化症或营养原因似乎不太可能。本报告描述了类似骨硬化症的疾病，但没有明确的致病因子，这在我们发现的年轻肉鸡中确实是一个问题。肉鸡雏鸡的早期发病可能导致生长异常、免疫抑制和疫苗效果降低。因此，提高人们对这种疾病的认识并促进合作研究以确定可能导致其发展的潜在传染性或遗传因素至关重要。
**资金支持**
本研究的部分工作得到了巴伐利亚自由州以及巴伐利亚联合防治传染性牲畜疾病基金会的财政支持。

**作者贡献声明**
Hicham Sid：撰写、审稿与编辑；撰写初稿；项目管理工作；概念构思。
Benjamin Schade：撰写、审稿与编辑；撰写初稿；验证；方法论；研究；数据分析；概念构思。
Brigitte B?hm：撰写初稿；方法论；数据分析；概念构思。
Eva Kappe：数据分析；概念构思。
Werner Heering：方法论；研究。
Andreas Brühschwein：方法论；研究；数据分析。
D?rte Lüschow：方法论；研究；数据分析。
Ferdinand Schmitt：撰写初稿；研究；数据分析；概念构思。